Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm corynespora cassiicola (berk curt) wei gây bệnh trên cây cao su (hevea brasiliensis muell arg) bằng phương pháp rflp – pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI Thành phố Hồ Chí Minh -2005- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN VŨ THỊ QUỲNH CHI ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh -2005- iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . PGS.TS Bùi Cách Tuyến cùng ThS. Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam – đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. TS. Bùi Minh Trí và TS. Đinh Duy Kháng đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. KS. Nguyễn Ngọc Mai cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Chị Huỳnh Kim Hưng cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để Con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN. ThS. PHAN THÀNH DŨNG. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được trồng ở Việt Nam. Kết quả đạt được: Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính. Qua phân tích chúng tôi đi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được không đặc trưng cho nấm C. cassiicola. v Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... vii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. .................................... 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 4 2.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 4 2.2.2. Phạm vi phân bố .................................................................................. 4 2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................. 5 2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola ..................................................... 5 2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ....................................................................................................... 6 2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis .................................................................................... 6 2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước trồng cao su .............................................................................................. 6 2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su ..................... 9 2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola ............... 9 vii 2.5. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) .............................................. 10 2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................... 10 2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 12 2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) ................................. 14 2.6.1. Giới thiệu ............................................................................................ 16 2.6.2. Định danh các enzyme ....................................................................... 15 2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn ................................. 16 2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA .................... 16 2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE ............................... 18 2.6.6. Bản đồ giới hạn ................................................................................... 19 2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền .................... 19 2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước ............................ 21 2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước ................................. 21 2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước ................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................. 24 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 24 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 24 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 24 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 24 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24 3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola ............................................. 24 3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................... 24 3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 25 3.2.1.3. Phương pháp phân lập ................................................................. 25 3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR ........................................... 26 3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR........................... 26 3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ............................................................ 28 3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR ................................................... 30 3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) ........... 30 viii 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................... 31 3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP .................................. 31 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 32 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora ................................................ 32 4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola .................................................... 37 4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola ............................................ 37 4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS ..................................... 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 52 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction. RE: Restriction endonuclease. PDA: Potato Dextrose Agar. PSA: Potato Saccharose Agar. EtBr: Ethidium Bromide. TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism. ITS: Internal Transcribed Spacer. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. Bp: base pairs rRNA: ribosomal RNA. dvt: dòng vô tính. BVTV: bảo vệ thực vật VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó ........................................................ 15 Bảng 2.2: Liệt kê các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó ......................... 17 Bảng 2.3: Trình tự một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS của nấm ..................................................................................................................... 21 Bảng 3 .1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ................................................ 29 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP ............................................... 31 Bảng 4.1: Các dòng vô tính cao su được lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trưng/ không đặc trưng)..................................................................................... 33 Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập được nấm C. cassiicola ................ 36 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam .... 8 Hình 2.2: Hình minh họa phản ứng PCR .................................................................. 11 Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm .............................................................................. 20 Hình 2.4: Lược đồ các primer trên vùng ITS ............................................................ 20 Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm ............................................................................................ 29 Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora ................... 34 Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora ............................ 34 Hình 4.3:Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioidies ........................................................................................................ 35 Hình 4.4: Bào tử nấm C. cassiicola dạng đơn dưới kính hiển vi và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioidies ............................................................................... 35 Hình 4. 5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường PDA ................................ 36 Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau ........... 37 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola ............... 38 Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi giảm lượng primer dùng trong phản ứng PCR ........................................................................................................... 39 Hình 4.9: Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae ................. 40 Hình 4.10: Các sản phẩm tạo thành khi phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI .......................................................................................... 41 Hình 4.11: Phân cắt các sản phẩm PCR bằng enzyme MspI .................................... 42 Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme CfoI .................................................... 42 Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme RsaI .................................................... 43 Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII ........................................ 43 Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI ...................................... 44 1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm bệnh trên cây trồng, đặc biệt là nấm ký sinh là dịch hại nguy hiểm đối với nền nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei có khả năng phân bố và phổ ký chủ rộng đã gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế của nhiều nước. Trong phổ ký chủ, Corynespora cassiicola gây hại đặc biệt nghiêm trọng cho cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), đây là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ. Trên cây cao su, C. cassiicola gây ra bệnh rụng lá – còn được gọi là bệnh rụng lá Corynespora, bệnh này có thể xảy ra trên cây cao su thuộc mọi lứa tuổi và xảy ra quanh năm, gây thiệt hại rất lớn về năng suất mủ cao su. Bệnh này đã bùng phát thành những đợt dịch bệnh và được ghi nhận lần đầu tiên vào những năm 1980 ở Sri Lanka, Indonesia, Malaysia và Thái Lan trên các dvt mẫn cảm như RRIC 103, RRIM 725, KRS 21, PPN 2447. Trong khoảng thời gian từ 1980 - 1988, ở Indonesia, khoảng 1200 ha cao su đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại khoảng 400 ha, ước tính giá trị thiệt hại lên đến 50 triệu USD (theo CFC/INRO Project Proposal, 1999). Trong những năm gần đây, khả năng gây hại của nấm C. cassiicola ngày càng lớn và ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh. Biện pháp phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora bằng hóa chất khá tốn kém và được nhận định là không kinh tế bằng cách thay thế các dvt mẫn cảm bằng các dvt có tính kháng (Chee, 1988). Dịch bệnh do nấm C. cassiicola gây ra thường làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời gian phục hồi của những dvt bị nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây 2 chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C. cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su. Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng 09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C. cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh, đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su. Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”. 1.2.Mục đích yêu cầu 1.2.1.Mục đích Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng, không đặc trưng trên các dvt cao su khác nhau, tại một số địa điểm khác nhau. Xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các dvt cao su khác nhau bằng phương pháp RFLP – PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2. Yêu cầu Nhận dạng được các triệu chứng biểu hiện của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy và phân lập nấm C. cassiicola. Nắm vững kỹ thuật PCR và sử dụng các enzyme cắt giới hạn. 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ), được H. Wickham du nhập vào châu Á và châu Phi năm 1876. Hai cây cao su được du nhập vào Việt Nam năm 1877 do Pierre trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn), nhưng hai cây này sau đó bị chết. Ông Seeligmann gởi về Sài Gòn 50 cây cao su và chỉ còn sống 5 cây vào tháng 12 năm 1881, tiếp theo đợt 2 vào tháng 6 năm 1883, nhưng tất cả cây cao su nói trên đều không tồn tại và phát triển được do nhiều nguyên nhân. Đến năm 1897, sau một số lần thất bại tiếp theo của ông Raul trong việc du nhập và trồng cao su vào nước ta, bác sĩ Yersin đã thành công và vườn cao su đầu tiên được ông trồng tại Suối Dầu – Nha Trang (Đặng Văn Vinh, 2000). Đầu thế kỷ 20, các vườn cao su được trồng tại Đông Nam Bộ và đến đầu thập kỷ 50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000). Hiện nay, diện tích cao su của cả nước đạt trên 450.000 ha với sản lượng trên 400.000 tấn /ha (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam, 2004). Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác,… Tuy nhiên, những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể, một phần do việc chọn lọc chủ yếu dựa theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh đã làm thất thoát gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn biến phức tạp, cùng với sự phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả chủng loại cũng như mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại sản lượng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao su được phát triển mạnh dưới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hưởng trực tiêp đến đời sống của những người trồng cao su. 4 Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế. Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây hại trên cây cao su tại Việt Nam. 2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 2.2.1. Lịch sử phát hiện Cooke (1896) ghi nhận Cercospora melonis là tác nhân gây đốm lá dưa hấu và dưa leo tại Mỹ. Năm 1906, Gusgow ghi nhận loại nấm tương tự trên dưa leo tại Đức và đặt tên nó là Corynespora maizei. Năm 1980, Lindau khẳng định các tác nhân nêu trên là cùng loài và đặt tên là Corynespora melonis (Cooke) Lindau. Tại Trung Quốc nhiều tác giả đã ghi nhận loại nấm này trên cây đậu nành, đậu đũa và đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura. Liu (1948) cho rằng loại nấm gây bệnh tại Trung Quốc tương tự như loại nấm gây bệnh trên cùng ký chủ tại Mỹ đã được Olive và cộng sự đặt tên là Helminthosporum vignae Olive Bain và Lefebrve (Olive et al, 1945; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Sau đó trong báo cáo của IMI (International Mycological Institute) tại Anh cho biết Helminthosporum cassiicola (Berk and Curt) là ký chủ của 11 loài cây vùng nhiệt đới, trong đó có cao su và đu đủ. Năm 1950, Wei thu thập tất cả các tài liệu liên quan đến nấm này và phân tích để đi đến kết luận rằng chúng là tác nhân gây bệnh duy nhất thuộc loài Corynespora cassiicola và đặt tên là Corynespora cassiicola (Berk and Curt) Wei, tên này được các nhà bệnh cây chấp nhận cho đến nay. 2.2.2. Phạm vi phân bố C. cassiicola (Berk and Curt) Wei được ghi nhận tại hơn 80 nước trên thế giới thuộc nhiều vùng khí hậu khác nhau từ vùng ôn đới đới đến nhiệt đới như Trung Quốc, Nhật, Malaysia, Indonesia, Australia, Austria, Nigeria, Sri Lanka, Cambodia, Thái Lan, Cameroon, Congo, Cuba, Argentinia…vv (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995). 5 2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh C. cassiicola có khoảng 160 loài ký chủ thuộc các nhóm cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác. Một số cây ký chủ của C. cassiicola bao gồm cao su (Hevea brasiliensis), đu đủ (Carica papaya), cà chua (Lycopersicum esculentum)…. Tuy nhiên, C. cassiicola trên cây cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995) C. cassiicola có thể gây hại cho tất cả các bộ phận của cây và gây ra các bệnh: leaf fire, leaf spot, target spot, frog eye, late blight, ring spot, brown leaf sprot…(Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995) 2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola C. cassiicola (Berk and Curt) Wei có khả năng sống ký sinh trên thực vật cũng như có khả năng sống hoại sinh trên xác bã thực vật (Ellis và Holiday, 1971). Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu và biến thiên rất nhiều về hình thái, hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trong môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt, dạng hình lưỡi liềm, có chứa nhiều vết ngăn với chiều dài đôi khi lên đến 700 m. Ellis và Holiday (1971) mô tả khuẩn lạc của nấm có màu xám đến nâu. Bào tử dạng đơn hay kết thành chuỗi, biến thiên về kích thước và hình dạng. Nấm dễ dàng phát triển trên môi trường nhân tạo nhưng rất khó hình thành bào tử. Sử dụng môi trường PDA cải thiện đáng kể khả năng hình thành bào tử của C. cassiicola phân lập được từ đậu nành. C. cassiicola có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 8 – 36oC trên môi trường PDA, thích hợp nhất ở 28oC, ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40oC. C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau có nhiệt độ phát triển tối ưu khác nhau. Khuẩn ty của C. cassiicola phát triển tốt trong điều kiện tối. Khuẩn lạc hình thành thay đổi theo mức độ chiếu sáng, phát triển rộng và mỏng dưới ánh sáng huỳnh quang, dày và tụ lại trong điều kiện tối. Đối với C. cassiicola trên cây cao su, khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28oC (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995). 6 2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su (Hevea brasiliensis) 2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su (Hevea brasiliensis) Đây là bệnh mới và có tác hại lớn chƣa từng có từ trƣớc tới nay tại các nƣớc trồng cao su ở Châu Á. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1949. Tiếp theo, bệnh lần lƣợt đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ (1958), Malaysia (1961), Nigeria (1968), Thái Lan, Sri Lanka, Indonesia (1985), Bangladesh, Brazil năm 1988 và ở Việt Nam năm 1999 (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Trên cây cao su, nấm C. cassiicola gây hại trên lá, cuống lá và chồi. 2.3.2. Tình hình bệnh do nấm C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại các nƣớc trồng cao su Sự phát dịch và lây lan của C. cassiicola có liên quan đến các yếu tố môi trường như độ ẩm, nhiệt độ, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất đai (CFC/INRO Project Proposal, 1999). Do vậy, tình hình bệnh và diễn biến bệnh ở các quốc gia khác nhau là khác nhau. Dịch hại do C. cassiicola gây ra được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1980, chủ yếu tại các nước sản xuất cao su như Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan. Đến nay C. cassiicola đã gây hại ở nhiều nước. 2.3.2.1. Indonesia Bệnh bùng nổ lần đầu vào năm 1980 tại trại thực nghiệm Sembawa, Nam Sumatra. Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả vùng trồng cao su tại Indonesia. Do cao su tiểu điền chiếm trên 90 % tổng diện tích trồng trong nước nên thiệt hại do bệnh chưa thống kê đầy đủ. Tuy nhiên, 1.125 ha cao su trong giai đoạn 1980 – 1988 và 400 ha phải nhổ để trồng lại với ước tính thiệt hại khoảng 200 triệu Rp. Một số dvt kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản 8 – 10 năm và làm giảm sản lượng 30 – 50 % đối với vườn khai thác (Sinulinga, 1996; Sujanto và Irwan Suhendry, 2000). Diễn biến của bệnh trên các dvt theo từng năm được ghi nhận như sau: - 1980: RRIC 103. - 1982: PNN 2058, 2444, 2447. - 1984: GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725. 7 - 1991: RRIM 600. - 1995: IAN 873. - 1999: AV 2037. 2.3.2.2. Malaysia Ghi nhận tại vườn ương trên dvt RRIC 52 và FX 25. Năm 1985, dịch bệnh bùng phát gây hại nặng cho RRIC 103, KRS 21 và RRIM 725. Hiện nay bệnh ghi nhận tại tất cả các vùng trồng cao su trong cả nước, nặng nhất tại Johor Baru và Trengganu. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, 701, 702, 703, 712, 725, 901, 2009, 2020, PR 261, IAN 873, PB 217 (Shukhor S.K. and Hidir S.M., 1996). 2.3.2.3. Sri Lanka Là nước thiệt hại nặng nề nhất, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại 9 địa phương trong vườn nhân sau đó gây hại nặng trên toàn quốc. 4.300 ha dvt RRIC 103, là dvt cao sản được khuyến cáo trồng đại trà (2.400 ha của đại điền và 1.900 ha của tiểu điền chiếm 3% diện tích trồng cao su cả nước lúc bấy giờ), phải nhổ bỏ và trồng lại bằng dvt kháng bệnh. Chính phủ phải bồi thường 64 triệu Rp cho người trồng cao su bị thiệt hại. Các tiến bộ về giống bị khựng lại (thay thế PB 86 bằng các dvt cao sản thuộc RRIC 100’ s series), buộc phải duy trì dvt có sản lượng thấp nhưng có tính kháng bệnh. Các dvt mẫn cảm bị bệnh nặng trước đây bao gồm RRIC 103, RRIC 104, KRS 21, PNN 2444 đã bị loại bỏ từ đầu, một số dvt được đánh giá là kháng bệnh nay cũng đã bị nhiễm bệnh như là RRIM 600, GT 1, RRIC 110, IAN 873, PB 260, PB 28/59, PB 235, RRII 105 (Jayashinge,1996 và 2000). 2.3.2.4. Thái Lan Bệnh ghi nhận tại thí nghiệm trao đổi giống cao su quốc tế 7 năm tuổi ở trạm Surat Thani. Bệnh gây chết dvt RRIC 103 và rụng lá nặng trên KRS 21. Hiện nay, bệnh đã xuất hiện tên toàn bộ diện tích cao su tại Thái Lan, nhưng tác hại không nghiêm trọng (Narisa Chanruang, 2000). 2.3.2.5. Cameroon Bệnh được ghi nhận trên toàn bộ diện tích trồng cao su trong nước. Các dvt mẫn cảm bao gồm GT1, RRIM 600, RRIC 110, PB 260. RRIC 110 được trồng ở quy mô vừa và phải loại bỏ từ 1995 do nhiễm nặng, trong khi PB 260 là dvt có nhiều triển vọng về sản lượng và kháng bệnh tại Indonesia và Malaysia 8 nhưng bị hại rất nặng tại Cameroon và các nước châu Phi (Gobina, 2000; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2001). 2.3.2.6. Ấn Độ Xuất hiện lần đầu tại vườn ương từ 1969 – 1976 và bệnh chỉ xảy ra ở vài nơi. Cho đến năm 1996 – 1997 dịch bệnh đã bùng phát tại South Canara, Karnataka làm rụng lá, chết chồi và đôi khi chết cả cây. Bệnh cũng gây rụng lá và chết chồi tại vùng Trichur và Thodupuzha, miền trung bang Kerala vào năm 1999 – 2000. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, Tijir 1 và RRII 105, 118. Tại vườn nhân RRII 105, 118, 300,305, PR 107, 255, 261, RRIM 600, PB 235, 255,260, 311, và GT 1. Dvt RRII 105 mẫn cảm nặng với bệnh gây nhiều chú ý do trên 80 % cao su tại đây trồng dvt này (Sabu,2000). 2.3.2.7. Việt Nam Bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Dvt LH 88/372, RRIC 103 và RRIC 104 bị hại nặng và phải cưa bỏ và xử lý bằng 0,5 % Benlate C 50 WP. Theo một số ghi nhận ban đầu, bệnh gây thiệt hại về sinh trưởng và sản lượng do tán lá không đủ để cây sinh trưởng và duy trì sản lượng. Một số vườn khai thác bị hại nặng có sản lượng chỉ bằng 1/3 -1/2 so với vườn cây có cùng điều kiện không bị nhiễm bệnh. Sinh trưởng cũng chậm, tỷ lệ khô miệng cạo và cỏ trong vườn cũng gia tăng hơn so với vườn cây không bị hại. Ngoài ra, cùng dvt và tuổi cây, bệnh phân bố khác nhau, trong đó gây hại nặng tại những vùng thấp ẩm ướt hơn so với vùng cao có điều kiện thông thoáng hơn (Phan Thành Dũng và Nguyễn Thái Hoan, 1999 và 2000). 9 Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam. Nguồn: Bộ Môn BVTV/VNCCSVN. 2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu, rất biến thiên về hình thái, hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trên môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt với dạng hình lưỡi liềm chứa nhiều vết ngăn với chiều dài biến thiên, đôi khi đạt 700 m. Bào tử dạng đơn đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum, phát tán nhờ gió. Bào tử phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh cũng như trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 năm (Chee, 1988). Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua lớp biểu bì và khí khổng, ngoài ra còn tiết ra enzyme cellulase giúp phân huỷ màng tế bào. Trong suốt quá trình sinh trưởng, nấm còn tiết ra độc tố CC toxin (là cassiicoline chứa các amino acid) gây độc cho cây cao su, cho nên chỉ với một lượng nhỏ ở gân chính của lá cũng đủ gây rụng lá (Chee, 1988). Nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong phạm vi nhiệt độ lớn, thích hợp nhất ở 28 2 oC và ẩm độ bão hoà (Chee, 1987 &1988; Jayashinghe, 2000). 10 Nấm có khả năng gây rụng lá non lẫn lá già, cuống lá và chồi. Hơn nữa, nấm gây bệnh quanh năm và suốt chu kỳ sống của cao su nên có tác hại rất lớn, nhất là trên các dvt mẫn cảm. 2.3.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh Bệnh xuất hiện trên lá, cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau. - Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với vòng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ. - Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bở lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá (Chee, 1988). 2.4. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) Kỹ thuật PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1990 được sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) 2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát 11 hiện mầm bệnh trên người, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như hình 2.2. Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 12 Hình 2.2: Mô tả phản ứng PCR Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc 13 gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). 2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR 2.4.2.1. DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần 2.4.2.2. Enzyme Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn++, nhưng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg++, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. 2.4.2.3. Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: - Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. 14 - Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. - Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. - Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngược không được quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 2.4.2.4. Các thành phần khác trong phản ứng PCR - Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. - Nồng độ Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng. 2.4.2.5. Số lượng chu kỳ phản ứng Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu. 15 2.4.2.6. Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR Thiết bị cho phản ứng PCR như máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nước trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 2.5. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease - RE) 2.5.1. Giới thiệu Trong phân tích genome, enzyme làm nhiệm vụ rất quan trọng là nhóm enzyme với thuật ngữ chung là enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE), ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999). Các RE được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Các RE bao gồm một phần của tính chất cải biến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể và những nhân tố lạ về di truyền. Từ kiểu hình được phân lập đầu tiên, hệ thống R- M bây giờ có thể sẵn sàng cho những phân tích di truyền rất có hiệu quả. Hệ thống R-M của vi khuẩn phá hủy những phân tử DNA lạ xâm nhập vào tế bào bằng con đường lây nhiễm, tiếp hợp, chuyển nạp. Hệ thống R-M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật nhân giả (prokaryotic) như là một hệ thống miễn dịch. Hệ thống R-M được tìm thấy trong vi sinh vật, chủ yếu là ở vi khuẩn. Nó rất đa dạng ngay cả trong cùng một tế bào. Số RE được tư liệu hóa cho đến nay trên 1200, trong đó có 17 thuốc type I, 179 type II, 4 type III rất chuyên tính, bên cạnh đó hơn 190 nhóm DNA modification methyltranferase đã và đang được định tính. Type I: Khi một enzyme nhận biết được một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide. Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó. Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. 16 Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong trong kỹ thuật biến đổi di truyền. Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính: (a) một RE viết tắt là R- Enase rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ tiêu hóa DNA ngoại sinh, (b) một methyltranferase là M-Mtase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh không bị tiêu hóa bởi R-Enase. 2.5.2. Định danh các enzyme Smith và Nathan (1973) đã đề nghị một hệ thống định danh thống nhất như sau: - Tên loài của sinh vật là ký chủ được xác định xong lấy chữ cái đầu tiên của genus cộng thêm 2 chữ cái của tên loài bằng 3 chữ, viết theo kiểu in nghiêng, thí dụ: Escheria coli = Eco và Haemophilus influenzae = Hin. Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí phân cắt của nó Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme Trình tự 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Providencia stuartii Seratia marcesens Xanthomonas malvacearum HaeIII Sau3AI BamHI EcoRI HindIII PstI SmaI XmaI GG/CC CC/GG GATC CTAG G/GATCC CCTAG/G G/AATTC CTTAA/G A/AGCTT TTCGA/A CTGCA/G G/ACGTC CCC/GGG GGG/CCC C/CCGGG GGGCC/C Ghi chú: Dấu “/” chỉ vị trí cắt. - Nòi của vi khuẩn được viết bằng chữ in hoa xụt xuống hàng dưới. Thí dụ, Ecok. Trong trường hợp hệ thống R-M được chuyên tính bởi virus hay plasmid 17 người ta dùng chữ viết tắt của tên là ký chủ và nguyên tố ngoại nhiễm được xác định theo sau chữ ấy, viết xuống hàng dưới ví dụ, EcoPI, EcoRI. - Khi một dòng ký chủ nào đó có nhiều hệ thống R-M khác nhau, người ta dùng số la mã đánh dấu ở phía sau. Thí dụ, HindI, HindII, HindIII… Số la mã này không phải là biểu thị loại hình enzyme. - Tất cả mọi RE đều có tên chung là “endonuclease R”, nhưng bên cạnh đó, nó còn mang thêm tên hệ thống, như R.HindIII. Tương tự, modification enzyme có tên chung là methylase M, theo sau đó là tên hệ thống. Modification enzyme của H. influenzae Rd tương hợp với endonuclease R.HindIII sẽ được ghi là M.HindIII. Trong thực tế người ta muốn việc sử dụng khi viết sao cho đơn giản, chữ nhảy xuống dưới không cần thiết, toàn bộ chữ viết tắt được ghi cùng một hàng, thí dụ, HindIII, và khi biết rõ là chỉ có RE, ký hiệu tượng trưng cho endonuclease R bị xóa bỏ (Bùi Chí Bửu Và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.5.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn Các RE có tính chuyên biệt với một trình tự nào đó và nó sẽ cắt nucleotide đúng vị trí xác định mà nó tìm thấy, vị trí này được gọi là trình tự mục tiêu, với số nucleotide trong chuỗi được xác định, thường là 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gen sẽ được cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thước khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Một đặc điểm của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự là hoàn toàn giống nhau nếu chúng được đọc theo chiều 5’ –3’. Như vậy vị trí cắt là giống nhau trên 2 mạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000; Desmond và Nicholl, 1994) 2.5.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lượng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme được biểu hiện bằng đơn vị (unit), là lượng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA thời gian giờ ở 37 C. Phần lớn các thí nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số 18 trường hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt được sự phân cắt không hoàn toàn (Desmond và Nicholl, 1994). Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, 2 đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc biệt đặc tính cắt tạo đầu dính được ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai phân tử có nguồn gốc khác nhau được cắt bằng cùng một loại RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính (Desmond và Nicholl, 1994; Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Bảng 2.2. Các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó Đầu 5’ Đầu 3’ Đầu bằng Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự TaqI ClaI MboI BglII BamHI BclI HindIII NcoI XmaI XhoI EcoRI SalI XbaI T/CGA AT/CGAT /GATC A/GATCT G/GATCC T/GATCA A/AGCTT C/CATG C/CCGG C/TCGAG G/AATTC G/TCGAC T/CTAGA PstI SacI SphI BdeI ApaI KpnI CTGCA/G GAGCT/C GCATG/C GGCGC/C GGGCC/C GGTAC/C AluI FnudII DpnI HaeIII PvuII SmaI NaeI HpaI NruI BalI MstI AhaIII EcoRV AG/CT CG/CG GA/TC GG/CC CAG/CT CCC/GGG GCC/GGC GTT/AAC TCG/CGA TGG/CCA TCG/GCA TTT/AAA GAT/ATC 19 Trong quá trình thực hiện phản ứng thủy giải của enzyme cũng cần lưu ý là mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng nhất định, nhất là về mặt dung dịch đệm, tốt nhất là nên tuân thủ những khuyến cáo của nhà sản xuất RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn được bảo quản ở -20 C . Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra sau khi đã chuẩn bị đủ tất cả các thành phần khác và giữ trong đá trong khoảng thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20 C. Phản ứng cắt được tiến hành trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Tuy nhiên cũng cần đảm bảo là thể tích của RE không vượt quá 1/10 t hể tích của phản ứng vì glycerol sẽ ức chế hoạt động của enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000) 2.5.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE Phản ứng cắt giới hạn sẽ tạo thành nhiều đoạn DNA, kích thước của chúng khác nhau tùy thuộc vào vị trí nhận biết của enzyme có trong phân tử phân tích. Do vậy cần có phương pháp xác định kích thước và số đoạn của các đoạn tạo thành. Dù phân tử có được phân cắt hay không, chúng ta cũng có thể kiểm tra thông qua độ nhớt của dung dịch. Phân tử DNA lớn hơn tạo nên dung dịch có độ nhớt cao hơn những phân tử nhỏ hơn, có nghĩa là sự phân cắt làm giảm độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, những thao tác đối với số lượng và kích thước của sản ph