Phân tích đặc điểm phân tử bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại bệnh viện ung bướu Nghệ An

N. Q. Trung, N. T. T. Lê, T. Đ. Hùng, N. T. T. Trinh, V. T. Q. Trang, N. T. G. An / Phân tích đặc điểm 56 PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN UNG BƯỚU NGHỆ AN Nguyễn Quang Trung (1), Nguyễn Thị Thuỷ Lê (1) Trần Đức Hùng (1), Ngô Thị Tố Trinh (2) Võ Thị Quỳnh Trang (2), Nguyễn Thị Giang An (2) 1 Bệnh viện Ung bướu Nghệ An 2 Trường Đại học Vinh Ngày nhận bài 04/12/2017, ngày nhận đăng 15/4/2018 Tóm tắt: Nghiên cứu 109 bệnh nhân điều trị ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) tại Bệnh viện Ung bƣớu Nghệ An cho thấy, đột biến gen EGFR chiếm tỷ lệ 40,37%, các đột biến này đều đƣợc xác định bằng kỹ thuật Scorpion ARMS. Trong đó, tuổi trung bình mắc bệnh là 63,8 ± 10,6 và 96,33% bệnh nhân là ung thƣ biểu mô tuyến (UTBMT). Tỷ lệ bệnh nhân nam UTPKTBN chiếm 55,96%, trong đó có 27,87% bệnh nhân mang đột biến gen EGFR. Tỷ lệ bệnh nhân nữ chiếm 44,04%, trong đó, có 56,25% bệnh nhân mang đột biến gen. Những trƣờng hợp bệnh nhân mang đột biến gen EGFR có 54,55% đột biến xóa đoạn LREA and L747-P753 delinsS ở exon 19; 29,55% đột biến L858R ở exon 21; đột biến kép trên exon 19 và 20, 18 và 20, 18 và 21 chiếm 9,09%; bệnh nhân mang gen đột biến kháng thuốc điều trị đích chiếm 15,91%. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ phổi (UTP) là loại ung thƣ thƣờng gặp, gây tử vong hàng đầu trong các loại ung thƣ, với 1,6 triện ca mắc mới mỗi năm. Theo Globocan, năm 2008 có 1.608.000 trƣờng hợp mắc mới UTP (chiếm 12,7%); UTP có tỷ lệ tử vong cao nhất, chiếm 18,2% trong các loại ung thƣ. Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm tỷ lệ 75-80% trong các loại UTP, phổ biến là ung thƣ biểu mô tuyến. Theo số liệu thống kê, có khoảng 90% số ca đƣợc ghi nhận là UTP có liên quan đến thuốc lá, 10% còn lại là do bị nhiễm phóng xạ hay tiếp xúc với các tác nhân gây ung thƣ trong môi trƣờng làm việc. Các nghiên cứu đã chỉ ra trong khói thuốc có chứa đến 40 hợp chất gây ung thƣ [1], [2], [9]. Khoảng 25% bệnh nhân UTP không có triệu chứng lâm sàng cụ thể và chỉ có thể đƣợc phát hiện qua khám sức khỏe định kỳ. Bệnh nhân thƣờng có các triệu chứng nhƣ: khó thở, đau ngực, ho ra máu. Khi khối u di căn, thƣờng xuất hiện các dấu hiệu nhƣ đau xƣơng, giảm sức nhìn, đau đầu, đột quỵ và các triệu chứng không điển hình khác nhƣ suy nhƣợc, giảm cân... [10]. Tuy nhiên, những triệu chứng này thƣờng không đặc trƣng cho UTPKTBN. Các xét nghiệm máu, tế bào học hay chẩn đoán bằng hình ảnh có thể xác định đƣợc UTPKTBN nhƣng khả năng chẩn đoán thƣờng ở giai đoạn phát triển thành khối u. UTPKTBN nếu đƣợc phát hiện và phẫu thuật sớm, kết hợp phác đồ điều trị hợp lý sẽ có 50% bệnh nhân sống thêm 5 năm [8]. Trong những năm gần đây, sự phát triển của các kỹ thuật y sinh đã giúp cho việc chẩn đoán và điều trị UTPKTBN có những bƣớc cải thiện đáng kể. Nổi bật hơn cả là phƣơng pháp điều trị nhắm trúng đích thông qua việc phát hiện sự đột biến của gen EGFR. Vì vậy, việc nghiên cứu và xác định sự đột biến của gen EGFR là vô cùng quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Email: nguyengianganbio@gmail.com (N. T. G. An) Trường Đại học Vinh Tạp chí khoa học, Tập 47, Số 1A (2018), tr. 56-61 57 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 109 bệnh nhân đã đƣợc xác định UTPKTBN bằng xét nghiệm mô bệnh học. Các bệnh nhân này phải có các mẫu khối nến đƣợc lƣu giữ và có hồ sơ bệnh án lƣu tại Bệnh viện Ung bƣớu Nghệ An từ tháng 01/2015 đến tháng 6/2017. Nghiên cứu này loại trừ những bệnh nhân dƣới18 tuổi, có chỉ định sử dụng hoá chất điều trị, có dấu hiệu suy gan, suy thận, suy hô hấp và bệnh tiểu đƣờng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chọn mẫu Nghiên cứu đƣợc tiến hành theo mô tả cắt ngang, hồi cứu hồ sơ bệnh án và có đủ tiêu chuẩn chọn mẫu. 2.2.2. Phương pháp hoá mô Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc xác định UTPKTBN bằng nhuộn HE thƣờng qui bằng phƣơng pháp hoá mô [11]. 2.2.3. Phương pháp realtime PCR Xác định đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật Scorpions - Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS). Mẫu mô đƣợc bác sỹ giải phẫu bệnh lựa chọn chính xác vùng tế bào ung thƣ, tiến hành tách chiết ADN tổng số bằng bộ kit ReliaPRep TM FFPE gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) theo sự hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Theo đó, bệnh phẩm đƣợc loại bỏ parafin bằng xylen. ADN đƣợc tách chiết bằng phenol/chloroform; nồng độ tinh sạch của ADN đƣợc xác định bằng máy Nano-Drop; những mẫu ADN đạt giá trị OD ≥ 1,8 đƣợc sử dụng để phân tích đột biến gen EGFR [10]. Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm SPSS 16.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 1: Đặc điểm nhóm bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu Đặc điểm bệnh nhân n % Đột biến EGFR Không đột biến EGFR n % n % Giới tính Nam 61 55,96 17 27,87 44 72,13 Nữ 48 44,04 27 56,25 21 43,75 p > 0,05 p < 0,01; r = - 0,29 Tuổi TB = 63,8 ± 10,6 < 50 9 8,26 7 77,78 2 22,22 50-64 43 39,45 17 39,53 26 60,47 ≥ 65 57 52,29 20 35,09 37 64,91 p < 0,01; r = - 0,15 N. Q. Trung, N. T. T. Lê, T. Đ. Hùng, N. T. T. Trinh, V. T. Q. Trang, N. T. G. An / Phân tích đặc điểm 58 Đặc điểm bệnh nhân n % Đột biến EGFR Không đột biến EGFR n % n % Giải phẫu bệnh Biểu mô tuyến 105 96,33 61 58,10 44 41,90 Biểu mô vảy 3 2,75 0 0,00 3 100,00 Biểu mô tuyến - vảy 1 0,92 1 100,00 0 0,00 Biểu mô tế bào lớn 1 0,92 0 0,00 1 100,00 p < 0,01; r = - 0,08 Kết quả phân tích bảng 1 cho thấy: tuổi trung bình mắc bệnh là 63,8 ± 10,6, trong đó, độ tuổi cao nhất là trên 65 (chiếm 52,29%). Tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến EGFR là 40,37%, trong đó, tỷ lệ UTPKTBN ở nam là 55,96% (đột biến EGFR chiếm 27,87%), bệnh nhân nữ là 44,04% (đột biến EGFR chiếm 56,25%). Tỉ lệ ung thƣ biểu mô tuyến chiếm đến 96,33%, trong đó, có 58,1% bệnh nhân mang gen đột biến gen ở loại này. Tuổi mắc bệnh có mối tƣơng quan thuận với tỷ lệ mắc bệnh nhƣng lại tƣơng quan nghịch với tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến gen EGFR (r = - 0,15). Bảng 2: Dấu hiệu biểu hiện của bệnh UTPKTBN Dấu hiệu biểu hiện n Tỷ lệ (%) Ho khan, đau tức ngực 90 82,57 Ho máu 5 4,59 Sụt cân, da xanh, ăn ngủ kém 10 9,17 Đau ngực, nổi hạch 2 1,83 Khó thở 2 1,83 Các bệnh nhân UTPKTBN khi mắc bệnh có dấu hiệu thƣờng gặp nhất là ho khan, đau tức ngực, chiếm 82,57%; sụt cân, da xanh xao và kém ăn, chiếm 9,17%. Bảng 3: Phân loại các dạng đột biến gen EGFR Vị trí đột biến Dạng đột biến n Tỷ lệ (%) n = 109 Đột biến gen EGFR 44 40,37 Không đột biến gen EGFR 65 59,63 19 LREA, L747-P753 delinsS 23 54,55 L477-P753 delinsS 1 21 L858R 13 29,55 Trường Đại học Vinh Tạp chí khoa học, Tập 47, Số 1A (2018), tr. 56-61 59 Vị trí đột biến Dạng đột biến n Tỷ lệ (%) 20 INS 3 6,82 18 + 20 G179X (exon 18) + S768I (exon 20) 1 2,27 9,09 19 + 20 LREA (exon 19) + INS (exon 20) 2 4,55 18 + 21 T790M (exon 18) + L858R (exon 21) 1 2,27 Tổng số 44 100 Trong 109 bệnh nhân đƣợc xét nghiệm gen EGFR, có 44 bệnh nhân mang đột biến gen EGFR, chiếm tỷ lệ 40,37%. Trong đó, đột biến tại exon 19 và 21 chiếm đa số với tỷ lệ lần lƣợt là 54,55% và 29,55%; đột biến tại exon 20 chiếm 6,82%, trong đó, có 1 trƣờng hợp đột biến kép G179X (exon 18) + S768I (exon 20), 1 trƣờng hợp đột biến kép T790M (exon 20) + L858R exon 21 và 2 trƣờng hợp đột biến kép xóa đoạn LREA (exon 19) + INS (exon 20) chiếm 9,09%. Trong các trƣờng hợp phát hiện đột biến gen EGFR, có 7 trƣờng hợp đột biến kháng thuốc điều trị đích chiếm (15,91%), bao gồm đột biến INS ở exon 20, G179S (exon 18) + S768I (exon 20), LREA (exon 19) + INS (exon 20), T790M (exon 18) + L858R (exon 21). BÀN LUẬN Kết quả nghiên cứu 109 trƣờng hợp UTPKTBN cho thấy tuổi trung bình của các bệnh nhân là 63,8 ± 10,6 tuổi. Trong đó, tỷ lệ bệnh nhân UTPKTBN tăng dần theo độ tuổi, nhƣng đột biến gen EGFR tỷ lệ nghịch với độ tuổi (r = - 0,15). Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp cơ chế sinh bệnh, bởi UTPKTBN phụ thuộc vào sự thay đổi trong cấu trúc di truyền và độ ổn định trong quá trình phân bào. Ở những bệnh nhân trẻ, sự tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ dẫn đến đột biến gen EGFR từ bố mẹ và môi trƣờng rất cao. Trong khi đó, ở những bệnh nhân lớn tuổi, các yếu tố hình thành khối u là sự già hóa của tế bào, dẫn đến lỗi trong quá trình phân bào, kèm theo sự suy giảm hệ miễn dịch, tạo ra kẽ hở cho các tế bào ung thƣ phát triển. Kết quả này tƣơng đƣơng với các công trình nghiên cứu trong nƣớc nhƣ của Phạm Văn Luận và CS [7], Nguyễn Minh Hải và CS [6], Shi, Y [10]. Phân tích bệnh nhân mắc UTPKTBN theo giới tính cho thấy, tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 55,96% cao hơn ở nữ (44,04%), song ở nữ có 56,25% mang gen đột biến, cao gấp 2,01 lần ở nam (27,87%). Kết quả nghiên cứu này tƣơng tự kết quả nghiên cứu trƣớc đây của Mai Trọng Khoa và cộng sự, theo đó, tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nữ là 55,2% [5]. Nghiên cứu của Phạm Văn Luận cũng cho tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nữ là 55,2% [7]. Nghiên cứu của Shi Y (2014) trên bệnh nhân UTP Châu Á cũng cho thấy đột biến gen EGFR thƣờng gặp ở bệnh nhân nữ nhiều hơn bệnh nhân nam (64,9%) [10]. Đặc điểm mô bệnh học là yếu tố quan trọng trong chỉ định điều trị và tiên lƣợng của bệnh ung thƣ phổi. Các nghiên cứu trƣớc đây cũng ghi nhận ung thƣ biểu mô tuyến chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại ung thƣ phổi [3], [10]. Trong nghiên cứu này, UTPKTBN chủ yếu ở thể ung thƣ biểu mô tuyến chiếm 96,33%, tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nhóm này chiếm 58,1%, các loại ung thƣ khác chiếm tỷ lệ rất thấp. Điều đặc biệt, 100% bệnh nhân ung thƣ biểu mô vảy đều mang đột biến gen EGFR, kết quả này đã N. Q. Trung, N. T. T. Lê, T. Đ. Hùng, N. T. T. Trinh, V. T. Q. Trang, N. T. G. An / Phân tích đặc điểm 60 đƣợc đề cập đến trong nghiên cứu trƣớc đây. Theo y văn thế giới, UTBMTBN là hình thức phổ biến ở nữ và những nam giới trẻ không hút thuốc lá [9]. Phân tích kết quả đột biến gen EGFR rất đa dạng, phân bố cả 4 exon, gồm tất cả các dạng đột biến điểm, xóa đoạn và thêm đoạn. Trong 44 mẫu đột biến EGFR đƣợc xác định, đột biến mất đoạn ở exon 19 chiếm tỷ lệ cao nhất (54,55%), gấp 1,8 lần đột biến ở exon 21 (chiếm 29,55%). Trên exon 20, đột biến điểm T790M, S768I và đột biến chèn đoạn là chủ yếu. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự [5], Phạm Văn Luận và cộng sự [7]. Nhƣng khác với một số nghiên cứu trên thế giới, tỷ lệ đột biến xóa đoạn exon 19 và L858R exon 21 khoảng 1,1 [10]. Trong điều trị bệnh nhân UTPKTBN, đột biến EGFR đƣợc chia thành 2 nhóm, là nhóm liên quan đến tính nhạy thuốc và nhóm kháng thuốc TKI. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ bệnh nhân mắc đột biến kháng thuốc TKI là 15,9%. Kết quả này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Inukai và cộng sự với tỷ lệ kháng thuốc là 3,6%; Theo nghiên cứu của POINEER, tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc là 2,9%, trong đó, các tác giả đã đề cập đến sự kết hợp giữa đột biến tăng nhạy và kháng thuốc là 2,3% [8], [9]. Theo nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự, tỷ lệ kháng thuốc là 1,9% [5]. Theo nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ, tỷ lệ kháng thuốc là 1,3% [3]. Ở các nghiên cứu trƣớc đây, đột biến kháng thuốc thƣờng gặp là đột biến thay đoạn T790M trên exon 20. Trong nghiên cứu này, đột biến kháng thuốc điều trị đích là đột biến thêm đoạn INS exon 20. Đặc biệt, có một số trƣờng hợp vừa mang đột biến kháng thuốc vừa mang đột biến đáp ứng thuốc nhƣ T790M exon 18 + L858R exon 21 (T790M là đột biến kháng thuốc); một trƣờng hợp khác là đột biến G719X exon 18 + S768I exon 20 (S768I là đột biến kháng thuốc). Phân tích đột biến trên các exon của gen EGFR liên quan đến đáp ứng hoặc kháng thuốc là những kết quả rất quan trọng giúp cho bác sĩ định hƣớng điều trị. Từ đó đƣa ra quyết định lựa chọn thuốc điều trị đích nhƣ gefitinib và erlotinib cho bệnh nhân UTPKTBN. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, tỷ lệ bệnh nhân UTPKTBN có tuổi trung bình mắc bệnh là 63,8 ± 10,6 (chiếm 52,29%), trong đó có 35,09% mang gen đột biến. Tỷ lệ bệnh nhân nam UTPKTBN cao hơn nữ, song tỷ nữ mang gen đột biến cao hơn nam. Hầu hết các bệnh nhân mắc bệnh là ung thƣ biểu mô tuyến, chiếm 96,33%. Trong số các bệnh nhân đƣợc phát hiện đột biến gen EGFR, đột biến xóa đoạn LREA exon 19 và đột biến L858R exon 21 chiếm đa số với tỷ lệ lần lƣợt là 52,27% và 29,55%. Có 4 trƣờng hợp mang đột biến kép, chiếm tỷ lệ 9,09%. Đột biến kháng thuốc điều trị trúng đích EGFR TKI chiếm 15,91%. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ciardiello F., Tortora G., EGFR antagonists in cancer treatment, N. Engl. J. Med., 358, 2008, 1160-1174. [2] Ferlay J., Shin H. R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D. M., GLOBOCAN 2008 v2.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase, No. 10, 2010, International Agency for Research on Cancer. Trường Đại học Vinh Tạp chí khoa học, Tập 47, Số 1A (2018), tr. 56-61 61 [3] Hoàng Anh Vũ, Ngô Thị Tuyết Hạnh, Đặc điểm đột biến gen trên 332 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, Tạp chí Y dƣợc học lâm sàng 108, 4, 2014, tr. 58-64. [4] Hoàng Anh Vũ, Cao Văn Động, Ngô Thị Tuyết Hạnh, Phan Thị Xinh, Hứa Thị Ngọc Hà, Đột biến gen EGFR và KRAS trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh - Chuyên đề Điều dƣỡng Kỹ thuật Y học, tập 14, phụ bản số 4, 2011, tr. 166-172. [5] Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Phạm Cẩm Phƣơng, Hoàng Thị Hà, Xác đinh đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai, Tạp chí Ung thƣ học Việt Nam, Số 4/2016, tr. 274-277. [6] Nguyễn Minh Hải, Nghiên cứu giá trị định hướng chẩn đoán của TPS trong ung thư phổi không tế bào nhỏ, Tạp chí Y dƣợc lâm sàng 108, Tập 8, 2013, tr. 141-145. [7] Phạm Văn Luận, Nguyễn Đình Tiến, Nguyễn Minh Hải, Đánh giá tỉ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh ưng thư phổi không tế bào nhỏ điều trị tại Bệnh viện trung ương quân đội 108, Tạp chí Ung thƣ học Việt Nam, Số 4/2016, tr. 178-182. [8] Selvaggi G, Novello S, Torri V., et al, Epidermal growth factor receptor overexpression correlates with a poor prognosis in completely resected non-small- cell lung cancer, Annals of Oncology 15, 2004, 28-32. [9] Sharma S. V., Bell D. W., Settleman J., Haber D. A., Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer, Nat. Rev. Cancer., 7(3), 2007, 169-81. [10] Shi Y, Joseph Siu-Kie A, Sumitra T. et al, A Prospective, Molecular Epidemiology Study of EGFR Mutations in Asian Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer of Adenocarcinoma Histology (PIONEER), J. Thor. Oncol., 9(2), 2014, 154- 162. [11] Sheehan D. C., Hrapchak B. B., Theory and practice of histotechnology, The C. V. Mosly Company, St. Louis, MO., 2 nd Edition, 1980. SUMMARY MOLECULAR CHARACTERISTIC ANALSIS OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS AT NGHE AN ONCOLOGY HOSPITAL By conducting the study on 109 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients at the Nghe An Oncology Hospital, we found that EGFR gene mutation is a cause of NSCLC. The average age of patients is 63.8 ± 10.6. 96.33% of all the patients have Adenocarcinoma. Using Scorpion ARMS technique for EGFR mutation identification, we found the rate of patients carrying the gene mutation was 40.37%. 55.96% of the patients are male (27.87% of those have gene mutation), 44.04% are female (56.25% of those have gene mutation). In all patients with gene mutations, 54.55% of patients carry LREA and L747-P753 delinsS mutation at exon 19. The rate of patients with the L858R gene mutation at exon 21 is 29.55%; the rate of double mutation at exon 19 and 20, 18 and 20, 18 and 21 is 9.09%. 15.91% of patients have targeted-drug-resistant gene mutation.