Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc họ nhân tố phiên mã ở đậu tương

105 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 6(103)/2019 PHÂN TÍCH VAI TRÒ CỦA GỐC METHIONINE TRONG CẤU TRÚC HỌ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở ĐẬU TƯƠNG Chu Đức Hà1, Lê Minh Tuấn1,2, Phạm Phương Thu2, Phạm Thị Lý Thu1, Phạm Thị Xuân3, La Việt Hồng2, Phạm Xuân Hội1 TÓM TẮT Methionine (Met) là một axít amin đóng vai trò thiết yếu ở thực vật. Các gốc Met cấu trúc được giả thuyết là bảo vệ protein chống lại bất lợi ôxi hóa nội bào. Trong nghiên cứu này, 21 phân tử protein giàu Met, thuộc ba nhóm nhân tố phiên mã (TF) lần lượt là ‘Basic helix-loop-helix’ (bHLH), ‘Basic leucine zipper’ (bZIP) và ‘Serum response factor’ (SRF) ở đậu tương (Glycine max) đã được phân tích nhằm chứng tỏ giả thuyết trên. Kết quả phân tích đã đưa ra 15 MRP có sự phân bố dày đặc của gốc Met trên hai khoảng ngoại biên quanh vùng bảo thủ. Phân tích tin sinh học cho thấy các TF đều ưa nước và hầu như không bền vững trong ống nghiệm. Trong đó, một số TF có thể phân bố trong tế bào chất, ty thể hoặc trên hệ thống bao gói. Dựa trên dữ liệu biểu hiện trong điều kiện thường, phần lớn các gen mã hóa họ bHLH và bZIP đều có xu hướng tăng cường biểu hiện ở ít nhất một cơ quan chính. Phân tích dữ liệu RNA-Seq cho thấy, một số gen mã hóa họ bHLH và SRF có mức độ phiên mã đáp ứng, trong khi các gen mã hóa họ bZIP có đáp ứng tăng ở rễ đậu tương xử lý mặn. Từ khóa: Bất lợi, đậu tương, Methionine, nhân tố phiên mã, tin sinh học 1 Viện Di truyền Nông nghiệp; 2 Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Sư phạm Hà Nội 2 3 Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam I. ĐẶT VẤN ĐỀ Dưới tác động của ngoại cảnh bất lợi, sự dư thừa của một số dạng chứa ôxi nguyên tử hoạt động đã gây ra những tổn thương đến các đại phân tử, ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Khoảng 68% đại phân tử bị tác động là protein. Trong đó, gốc Methionine (Met) trên protein rất dễ bị ôxi hóa, làm biến đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi hoặc gây mất chức năng của protein (Kim et al., 2014). Đây là một axít amin đóng vai trò thiết yếu trong đời sống của thực vật, tham gia vào con đường Yang, liên quan đến nhiều chu trình nội bào quan trọng như hình thành màng tế bào, tổng hợp diệp lục và củng cố thành tế bào. Giả thuyết đặt ra là, liệu rằng các gốc Met cấu trúc có thực sự tham gia vào cơ chế bảo vệ cấu trúc để duy trì chức năng của phân tử protein trong điều kiện bất lợi hay không? Gần đây, 213 phân tử protein giàu Met (Met-rich protein, MRP) đã được sàng lọc ở đậu tương (Glycine max) (Chu et al., 2016). Các MRP này đã được xác định tham gia vào nhiều quá trình quan trọng trong tế bào, trong đó, 20% MRP liên quan đến điều hòa phiên mã ở đậu tương (Chu et al., 2016). Như đã biết, nhân tố phiên mã (TF) là họ protein tham gia điều hòa sự biểu hiện của gen, vì vậy liên quan đến cơ chế đáp ứng và khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi. Trong nghiên cứu này, 3 nhóm TF giàu Met cơ bản ở đậu tương, bao gồm ‘Basic helix-loop-helix’ (bHLH), ‘Basic leucine zipper’ (bZIP) và ‘Serum response factor’ (SRF) đã được khai thác để chứng minh giả thuyết về vai trò của Met liên quan đến cơ chế đáp ứng. Đặc tính lý hóa học của protein và khảo sát sự phân bố của các gốc Met trên phân tử đã được xem xét. Mức độ biểu hiện của gen mã hóa các TF được phân tích tại một số cơ quan chính trên đậu tương. Kết quả của nghiên cứu này có thể cung cấp dẫn liệu quan trọng về vai trò của gốc Met liên quan đến chống chịu bất lợi ở đậu tương. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Bảng 1. Thông tin về các TF giàu Met khai thác trong nghiên cứu này (Chu et al., 2016) TT Mã định danh TF TT Mã định danh TF TT Mã định danh TF 01 Glyma01g15930 bH LH 08 Glyma10g04890 bH LH 15 Glyma10g40080 SR F 02 Glyma02g00980 09 Glyma11g17120 16 Glyma11g26260 03 Glyma03g04000 10 Glyma13g19250 17 Glyma11g30490 04 Glyma03g32740 11 Glyma20g22280 18 Glyma11g30620 05 Glyma04g04190 12 Glyma02g01600 bZ IP 19 Glyma18g05930 06 Glyma05g19920 13 Glyma05g28960 20 Glyma18g05960 07 Glyma06g04380 14 Glyma08g12170 21 Glyma20g27320 106 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 6(103)/2019 Trình tự protein và mã định danh của 21 TF giàu Met, bao gồm nhóm bHLH, bZIP và SRF được khai thác từ nghiên cứu trước đây (Chu et al., 2016) (Bảng 1). 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân tích vùng bảo thủ của protein: Các TF được kiểm tra vùng bảo thủ bằng MEGA (Kumar et al., 2016). Trình tự ngoại biên từ đầu 3’ và 5’ đến vị trí vùng bảo thủ được tách biệt để xác định sự phân bố gốc Met bằng BioEDIT (Hall, 1999). - Phương pháp xác định đặc tính lý hóa của protein: Trình tự axít amin được phân tích trên ExPASy Protparam (Gasteiger et al., 2003) để đánh giá các đặc tính lý hóa của protein. Một số chỉ tiêu được quan tâm, bao gồm điểm đẳng điện (pI), chỉ số bất ổn định (II), độ ưa nước (GRAVY). - Phương pháp dự đoán vị trí phân bố nội bào của protein: Trình tự axít amin (.fasta) của các TF được sử dụng để tìm kiếm vị trí cư trú trong tế bào thông qua TargetP (Emanuelsson et al., 2007). Trong đó, mức độ tin cậy của thuật toán được xác định theo thang điểm 5 (Emanuelsson et al., 2007). - Phương pháp phân tích in silico mức độ biểu hiện gen trong điều kiện thường: Mức độ phiên mã của gen mã hóa các TF được xác định trong điều kiện thường dựa trên dữ liệu microarray đã công bố (Libault et al., 2010). Trong đó, chín mẫu mô, bao gồm lông rễ thu ở 84 và 120 h sau nảy mầm (RH 84 HAS, RH 120 HAS), nốt sần (N), mô phân sinh đỉnh chồi (SAM), hoa (F), vỏ quả xanh (GP), lá (L), rễ (R), chóp rễ (RT) được khai thác và phân tích (Libault et al., 2010). Mã định danh được truy vấn trên dữ liệu microarray để tìm kiếm biểu hiện của gen tương ứng ở các mô trong điều kiện thường. - Phương pháp phân tích in silico mức độ biểu hiện gen trong điều kiện bất lợi: Mức độ phiên mã của gen mã hóa TF trong điều kiện mặn được khai thác trên dữ liệu RNA-Seq gần đây (GSE57252) (Belamkar et al., 2014). Trong đó, mẫu rễ xử lý với dung dịch NaCl 100 mM trong 0 (đối chứng), 1, 6 vá 12 h được thu thập để phân tích RNA-Seq (Belamkar et al., 2014). Mã định danh của gen mã hóa TF được truy vấn để tìm kiếm mức độ biểu hiện của gen tương ứng ở rễ trong điều kiện xử lý mặn. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích sự phân bố của gốc Met trong các họ TF ở đậu tương Với giả thuyết đặt ra, vùng thượng nguồn (upstream region) và hạ nguồn (downstream region) của các nhóm TF được chọn lọc để xác định mức độ phân bố của các gốc Met trên protein. Trước tiên, vùng bảo thủ của các TF được xác định bằng công cụ MEGA (Kumar et al., 2016). Vùng bảo thủ của họ TF bHLH giàu Met ở đậu tương có cấu tạo gồm 4 domain, ‘basic-helix-loop-helix’, trong khi các thành viên của họ TF bZIP chia sẻ cấu trúc bảo thủ gồm 3 vùng, ‘basic-hinge-leucine zipper’ (Hình 1). Phân tích trình tự tương đồng cho thấy họ TF SRF có vùng bảo thủ ‘MADS-box’ (Hình 1). Hình 1. Sự phân bố của gốc Met trên ba nhóm TF ở đậu tương 107 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 6(103)/2019 Khảo sát hai vùng ngoài trình tự bảo thủ của ba nhóm TF đã cho thấy sự mật độ dày đặc của các gốc Met. Cụ thể, phần lớn bHLH (8 trên 11) có vùng thượng nguồn hoặc hạ nguồn quy tụ nhiều gốc Met (> 10%) (Hình 1). Chỉ có một TF thuộc họ bZIP, Glyma02g10600, được xác định có sự phân bố dày dặc của gốc Met ở hai vùng ngoại biên cận bảo thủ (Hình 1). Trong khi đó, hai đoạn trình tự ngoài vùng bảo thu của hầu hết các thành viên của họ SRF (sáu trên bảy) được ghi nhận sự có mặt của nhiều gốc Met (Hình 1). Trước đây, Luo và cộng tác viên (2009) đã chứng minh vai trò của Met trên protein giúp chống lại bất lợi ôxi hóa bằng cách thay thế Met với Norleucine (Luo and Levine, 2009). Như vậy, kết quả của nghiên cứu này đã tìm ra được 15 TF có sự tập trung nhiều Met quanh vùng bảo thủ, vì thế, các gốc Met này có thể giúp phân tử protein đáp ứng lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi. 3.2. Phân tích đặc tính lý hóa của TF giàu Met ở đậu tương Đặc tính lý hóa của protein, bao gồm pI, II và GRAVY được phân tích trên ExPASy Protparam (Gasteiger et al., 2003). Kết quả đã chỉ ra rằng hầu hết các TF, ngoại trừ Glyma02g00980 (một thành viên của họ TF bHLH) có giá trị II lớn hơn 40, cho thấy chúng không ổn định trong điều kiện kiểm tra trong ống nghiệm (Bảng 2). Phân tích từ ExPASy Protparam (Gasteiger et al., 2003) cũng ghi nhận tất cả các TF có chỉ số GRAVY nhỏ hơn 0, suy ra 21 phân tử protein này đều ưa nước (Bảng 2). Bảng 2. Đặc tính lý hóa của 3 nhóm TF giàu Met được tìm thấy ở đậu tương TT Tên protein TF pI II GRAVY BQ TT Tên protein TF pI II GRAVY BQ 01 Glyma01g15930 bH LH 8,88 47,61 -0,55 C5 12 Glyma02g01600 bZ IP 5,07 55,40 -0,66 C3 02 Glyma02g00980 9,26 39,46 -0,10 S5 13 Glyma05g28960 5,23 43,56 -0,64 C2 03 Glyma03g04000 9,14 51,91 -0,69 - 14 Glyma08g12170 5,24 44,66 -0,73 C2 04 Glyma03g32740 7,20 63,57 -0,51 M3 15 Glyma10g40080 SR F 9,76 46,27 -0,47 - 05 Glyma04g04190 6,84 68,89 -0,78 - 16 Glyma11g26260 6,84 55,54 -0,65 - 06 Glyma05g19920 8,93 52,30 -0,53 - 17 Glyma11g30490 9,26 57,12 -0,44 - 07 Glyma06g04380 6,63 59,36 -0,72 - 18 Glyma11g30620 9,37 55,52 -0,42 - 08 Glyma10g04890 5,84 65,40 -0,84 - 19 Glyma18g05930 10,0 58,23 -0,64 - 09 Glyma11g17120 8,63 46,28 -0,58 C5 20 Glyma18g05960 9,13 59,28 -0,57 - 10 Glyma13g19250 6,03 65,52 -0,82 M4 21 Glyma20g27320 9,79 55,34 -0,44 - 11 Glyma20g22280 5,92 62,84 -0,66 - Ghi chú: TF: Nhân tố phiên mã, pI: điểm đẳng điện, II: chỉ số bất ổn định, GRAVY: độ ưa nước, BQ: bào quan, C: lục lạp, S: hệ thống bao gói, M: ty thể. Giá trị pI của các TF dao động từ khoảng 5,07 (tính axít) đến 10,00 (tính bazơ) (Bảng 2). Các protein có tính axít phân bố trong tế bào chất, trong khi protein bám trên màng bào quan thường có tính bazơ. Kết quả phân tích trên TargetP cho thấy 5 TF được tìm thấy ở tế bào chất, 2 TF cư trú ở ty thể, trong khi 1 TF phân bố trên hệ thống bao gói nội bào (Bảng 2). 3.3. Phân tích biểu hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã giàu Met ở đậu tương trong các điều kiện Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các gen mã hóa 3 nhóm TF ở đậu tương được phân tích in silico dựa trên dữ liệu phiên mã trong điều kiện thường (Libault et al., 2010) và khi xử lý mặn (Belamkar et al., 2014). Biểu hiện của một gen trong điều kiện thường được chia làm bốn mức độ, dưới ngưỡng phát hiện, biểu hiện, có xu hướng biểu hiện mạnh và biểu hiện mạnh (Libault et al., 2010). Kết quả phân tích được minh họa ở hình 2. Trong điều kiện thường, phần lớn các gen mã hóa bHLH và bZIP có xu hướng biểu hiển mạnh ở ít nhất một bộ phận chính, trong khi mức độ phiên mã của 7 gen mã hóa họ SRF ở 9 mẫu mô cơ quan dưới ngưỡng phát hiện (Hình 2). Cụ thể, Glyma13g19250, Glyma03g32740, Glyma01g15930 và Glyma11g17120 có biểu hiện mạnh ở hoa và lá, nhưng không biểu hiện mạnh ở các cơ quan dưới đất, chứng tỏ 4 gen này có thể tham gia vào sinh trưởng và phát triển của hoa và lá trong điều kiện thường. 108 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 6(103)/2019 Hình 2. Mức độ biểu hiện của gen mã hóa TF giàu Met trong các điều kiện Đáng chú ý, Glyma03g32740 và Glyma12g19250 có thể phân bố ở ty thể (Bảng 2), các gen mã hóa 2 TF này biểu hiện đặc thù ở hoa và lá (Hình 2), gợi ý rằng chúng có thể liên quan đến đáp ứng bất lợi ở lá hoặc hoa. Bên cạnh đó, gen mã hóa 2 thành viên của nhóm bZIP biểu hiện đặc thù ở tất cả các bộ phận dưới mặt đất, trong khi Glyma02g01600 có mức độ phiên mã mạnh ở tất cả mẫu mô (Hình 2). Kết quả này chứng tỏ Glyma02g01600 có thể đóng vai trò thiết yếu liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong điều kiện thường. Trong stress mặn (Belamkar et al., 2014), kết quả đã tìm thấy dữ liệu của 10 gen, bao gồm 6 gen mã hóa bHLH, 3 gen mã hóa bZIP và 1 gen mã hóa SRF. Trong đó, 5 gen đã được xác định có đáp ứng phiên mã tăng mạnh ở rễ khi xử lý mặn (Hình 2). Đặc biệt, họ bZIP được tăng cường biểu hiện ở rễ trong điều kiện thường và khi xử lý mặn (Hình 2), chứng tỏ các gen này có thể tham gia vào quá trình đáp ứng bất lợi ở rễ. Trước đó, khi xem xét dữ liệu phiên mã khi xử lý lá cây đậu tương V6 và R2 trong điều kiện hạn, Chu và cộng tác viên (2016) đã chỉ ra ba gen có đáp ứng (Chu et al., 2016). Cụ thể, Glyma01g15930 và Glyma03g32740 bị giảm biểu hiện, Glyma20g22280 có mức độ phiên mã tăng ở cả mẫu lá khi xử lý hạn (Chu et al., 2016). Những kết quả này phù hợp với nhận định về vai trò của gen Glyma03g32740 trong đáp ứng bất lợi ở lá. IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Đã xác định được 15 trên tổng số 21 protein thuộc ba họ TF có sự tập trung nhiều Met quanh vùng bảo thủ, đặt ra giả thuyết về vai trò của gốc Met trong việc giúp phân tử protein đáp ứng bất lợi. Phân tích đặc tính lý hóa cho thấy các TF giàu Met đều ưa nước, hầu hết đều không ổn định trong điều kiện in vitro. Các TF này có thể cư trú trong tế bào chất, ty thể hoặc trên các hệ thống bao gói trong tế bào. Hầu hết các gen mã hóa bHLH và bZIP biểu hiển mạnh ở ít nhất một bộ phận chính, trong khi SRF hoạt động yếu trong điều kiện thường. Trong điều kiện mặn, một số thành viên của họ bHLH và SRF có đáp ứng ở rễ, trong khi các gen mã hóa bZIP đều được tăng cường biểu hiện ở rễ. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu này sẽ tiếp tục phân tích thực nghiệm về mức độ đáp ứng của các gen mã hóa TF trong điều kiện bất lợi ở đậu tương. TÀI LIỆU THAM KHẢO Belamkar, V., Weeks, N. T., Bharti, A. K., Farmer, A. D., Graham, M. A. Cannon, S. B., 2014. Comprehensive characterization and RNA-Seq profiling of the HD-Zip transcription factor family in soybean (Glycine max) during dehydration and salt stress. BMC Genomics, 15(1): 1-25. Chu, H. D., Le, Q. N., Nguyen, H. Q., Le, D.T., 2016. Genome-wide analysis of genes encoding methionine-rich proteins in Arabidopsis and soybean suggesting their roles in the adaptation of plants to abiotic stress. Int J Genomics, 2016: e5427062. Emanuelsson, S., Brunak, G., Heijne, H., 2007. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc, 2(4): 953-971. Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R.D., Bairoch, A., 2003. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res, 31(13): 3784-3788. Hall, T.A., 1999. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser, 41: 95-98. Kim, G., Weiss, S. J., Levine, R. L., 2014. Methionine oxidation and reduction in proteins. Biochim Biophys Acta, 1840(2): 901-905. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K., 2016. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol, 33(7): 1870-1874.