Phát hiện mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể y ở nam giới mắc hội chứng OAT

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 23 PHÁT HIỆN MẤT ĐOẠN NHỎ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI MẮC HỘI CHỨNG OAT Nguyễn Bá Sơn, Nguyễn Xuân Tùng, Lương Thị Lan Anh Trường Đại học Y Hà Nội Hội chứng OAT (Oligo - Astheno - Teratozoospermia) là tình trạng tinh trùng trong tinh dịch có mật độ ít, độ di động yếu và tỷ lệ bất thường cao. Hội chứng OAT chiếm khoảng 8,5% nam giới tới xét nghiệm tinh dịch đồ và chiếm 12,5% nam giới có tinh dịch đồ bất thường. Mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y là nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền đứng thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh nam do ảnh hưởng tới quá trình tạo tinh trùng. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới mắc hội chứng OAT. 327 nam giới mắc hội chứng OAT được lựa chọn vào nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR, M - PCR ). Kết quả cho thấy 40/327 nam giới mắc hội chứng OAT có mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%, trong đó: mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 80%, mất đoạn AZFd chiếm tỷ lệ 20%; không phát hiện được trường hợp mất đoạn AZFa, AZFb. Đối với mất đoạn AZFd, toàn bộ mất đoạn xảy ra ở vị trí sY152 và không phát hiện trường hợp nào mất ở vị trí PBY2. Mất đoạn xảy ra chủ yếu ở nhóm OAT mức độ nặng, chiếm 16%. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khóa: Mất đoạn nhỏ, nhiễm sắc thể Y, hội chứng OAT Hội chứng OAT (Oligo - Astheno - Teratozoospermia) là tình trạng tinh trùng trong tinh dịch có mật độ ít, độ di động yếu và tỷ lệ bất thường cao [1]. Theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO) năm 2010, hội chứng OAT là tình trạng phối hợp của 3 biểu hiện sau trên tinh dịch đồ: Mật độ tinh trùng dưới 15 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% và tỷ lệ tinh trùng bình thường dưới 4% [2]. Hội chứng OAT chiếm khoảng 8,5% nam giới tới xét nghiệm tinh dịch đồ và 12,5% nam giới có tinh dịch đồ bất thường [3]. Dựa vào mật độ tinh trùng, hội chứng OAT được chia làm ba mức độ: Hội chứng OAT mức độ nhẹ (mật độ tinh trùng 10 - 15 triệu/ml); hội chứng OAT mức độ trung bình (mật độ tinh trùng 5 - 10 triệu/ml) và hội chứng OAT mức độ nặng (mật độ tinh trùng 0 - 5 triệu/ ml) [4]. Mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y là nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền đứng thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh nam do ảnh hưởng tới quá trình tạo tinh trùng [5; 6]. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y chiếm khoảng 2 - 14% nam giới vô sinh [5; 7 - 10]. Trên nhiễm sắc thể Y có các các vùng gen đặc hiệu (vùng AZF - Azoospermia Factor) bao gồm AZFa, AZFb, AZFc, AZFd. Mỗi vùng AZF chứa nhiều gen khác nhau và mất đoạn trong các vùng này được xác định là nguyên nhân gây ra suy giảm sinh tinh trùng [5; 11] . Việc xác định các mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y giúp cho chẩn đoán chính xác, đặc biệt là Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội Email: lanhluong@gmail.com Ngày nhận: 09/03/2017 Ngày được chấp nhận: 26/6/2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 201724 tư vấn di truyền và có hướng điều trị đúng đắn. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xác định tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới mắc hội chứng OAT. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng nghiên cứu 327 nam giới trong độ tuổi sinh sản đã làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại Học Y Hà Nội, xác định mắc hội chứng OAT; Mật độ tinh trùng dưới 15 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% và tỷ lệ tinh trùng bình thường dưới 4%. 2. Phương pháp: mô tả cắt ngang. Tiến hành nghiên cứu - Thu thập mẫu bệnh phẩm: 2-5ml máu chống đông bằng EDTA. - Tách DNA từ máu ngoại vi đã chống đông EDTA bằng phenol chloroform. - Tiến hành thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR để xác đinh các mất đoạn AZFa,b,c,d bằng các cặp mồi sY84, sY86 (AZFa); sY127, sY134 (AZFb); sY254, sY255 (AZFc); sY152, BPY2 (AZFd) và hai chứng nội tại SRY và ZFY. Thành phần của các phản ứng được mô tả trong bảng 2 Bảng 1. Vị trí và trình tự gen của các đoạn mồi trong phản ứng multuplex PCR Vị trí Mồi Trình tự Kích thước (bp) AZFa sY84 F: 5′-AGA AGG GTC CTG AAA GCA GGT-3′ 326 R: 5′-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3′ sY86 F: 5′-GTG ACA CAC AGA CTA TGC TTC-3′ 318 R: 5′ - ACA CAC AGA GGG ACA ACC CT - 3′ AZFb sY127 F: 5′-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3′ 274 R: 5′-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3′ sY134 F: 5′-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3′ 301 R: 5′-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3′ AZFc sY254 F: 5′-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3′ 380 R: 5′-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3′ sY255 F: 5′-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3′ 123 R: 5′-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3′ AZFd sY152 F: 5’- AGACAGTCTGCCATGTTCA-3’ 125 R: 5 ‘- CAGGAGGTACTTAGCAGT-3’ BPY2 F: 5’ - TAATTCCTCTTTACGCATGACC-3’ 202 R: 5’- ATATCTCTGAGCACATACC -3’ SRY sY14 F: 5′-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3′ 472 R: 5′-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3′ ZFX/Y ZFX/Y F: 5′-ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C-3′ 495 R: 5′-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T-3′ TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 25 Bảng 2. Các thành phần của phản ứng multiplex PCR Thành phần Phản ứng 1 Phản ứng 2 Phản ứng 3 Mastermix PCR 12,5 µL 12,5 µL 12,5 µL Mồi (2,5 pmol/µL) ZFY, sY86, sY127, sY254 ZFY, sY84, sY255 SRY, sY134, BPY2, sY152 DNA (30-45 ng/µL) 4 µL 4 µL 4 µL Nước cất Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ Tổng 25 µL 25 µL 25 µL Chu trình nhiệt: 95oC - 10 phút; 34 chu kỳ [94oC - 1 phút 10 giây, 56oC - 1 phút 30 giây, 72oC - 1 phú; 72oC - 10 phút; giữ lạnh 4oC. Sử dụng đối chứng âm, chứng nữ và chứng dương. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE 1X với điện thế 100V trong 70 phút. Đánh giá kết quả theo thang DNA 100 bp của hãng Invitrogen, nhuộm bằng Ethidium Bromide để phát hiện kết quả. Hình 1. Hình ảnh minh họa kết quả phản ứng multiplex PCR 3. Đạo đức nghiên cứu Các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan đã được xác nhận và chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Những thông tin về bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu. III. KẾT QUẢ Biểu đồ 2. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới OAT TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 201726 Trong 327 nam giới mắc hội chứng OAT có 40 nam giới bị mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%. Tỷ lệ không có mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể chiếm 87,8%. Bảng 3. Vị trí mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở nam giới OAT Vị trí mất đoạn Số lượng Tỷ lệ % AZFa 0 0 AZFb 0 0 AZFc 13 32,5 AZFd 8 20,0 AZFc+d 19 47,5 Tổng số 40 100 Trong số 40 nam giới bị mất đoạn: không có ai bị mất đoạn AZFa, AZFb; mất đoạn AZFc+d chiếm tỷ lệ cao nhất: 19/40 (47,5%) tiếp theo là mất đoạn AZFc: 13/40 (32,5%) và mất đoạn AZFd: 8/40 (20%). Bảng 4. Phân bố mất đoạn AZF theo locus gen Mất đoạn AZF Vị trí STS* Số lần gen bị mất Tỷ lệ % AZFc sY254 32 35,2 sY255 32 35,2 AZFd sY152 27 29,6 BPY2 0 0 Tổng 91 100 *: STS Sequence Tagged Site - trình từ gắn đuôi Trong số 40 nam giới bị mất đoạn, có 91 vị trí STS bị mất đoạn. Trong đó: sY254 và sY255 thuộc vùng AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 35,2%; tiếp theo là sY152 thuộc vùng AZFd chiếm tỷ lệ 29,6%; không phát hiện được trường hợp nào mất BPY2 thuộc vùng AZFd; sY84 và sY86 của vùng AZFa; sY125 va sY134 của vùng AZFb. Bảng 5. Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y theo mức độ hội chứng OAT Đột biến Mức độ (số lượng) Mất đoạn Bình thường Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % OAT mức độ nhẹ (31) 2 6,5 29 93,5 OAT mức độ trung bình (54) 4 7,4 50 92,6 OAT mức độ nặng (212) 34 16,0 178 84,0 Tỷ lệ mất đoạn ở nhóm nam giới OAT mức độ nặng chiếm tỷ lệ cao nhất 16%, ở nhóm OAT mức TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 27 độ nhẹ chiếm tỷ lệ thấp nhất 6,5%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Bảng 6. Phân bố mất đoạn AZF theo mức độ hội chứng OAT Mức độ OAT mức độ nhẹ OAT mức độ trung bình OAT mức độ nặng Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % AZFc 0 0 0 0 13 6,1 AZFd 0 0 3 5,6 5 2,3 AZFc+d 2 6,5 1 1,8 16 7,5 Tổng 31 100 54 100 212 100 Tỷ lệ mất đoạn AZFc đơn thuần trong nhóm OAT mức độ nặng là 13/212 (6,1%). Mất đoạn vùng AZFc đơn thuần nằm toàn bộ trong nhóm OAT mức độ nặng. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZFd ở nhóm OAT mức độ trung bình chiếm tỷ lệ cao nhất 5,6%, tiếp theo là nhóm OAT mức độ nặng 2,3%, nhóm OAT mức độ nhẹ là 0%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. Tỷ lệ mất đoạn AZFc+d ở nhóm OAT mức độ nặng chiếm tỷ lệ cao nhất 7,5%, tiếp theo là OAT mức độ nhẹ 6,5% và OAT mức độ vừa 1,8%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. IV. BÀN LUẬN Phân tích DNA của 327 nam giới mắc hội chứng OAT cho thấy có 40 nam giới bị mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, chiếm tỷ lệ 12,2%. Tỷ lệ này tương ứng với một nghiên cứu khác ở Việt Nam là 13,3% [12]. So với nghiên cứu khác trên nhóm nam giới OAT người Iran, tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y của chúng tôi cao hơn tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm Y của người Iran (9,52%) [8]. Sự chênh lệch tỷ lệ có thể do việc lựa chọn các cặp mồi để phát hiện đột biến của mỗi nghiên cứu là khác nhau, nguồn gốc dân tộc, địa lý của đối tượng nghiên cứu khác nhau. Trong số 40 nam giới bị mất đoạn, chúng tôi chưa thấy mất đoạn AZFa, AZFb. Mất đoạn AZFc, AZFd vẫn có thể tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch, tuy nhiên mật độ thấp và chất lượng tinh trùng kém. Mất hoàn toàn đoạn AZFa, AZFb dẫn tới không có tinh trùng trong tinh dịch [5]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đối tượng nghiên cứu là nam giới mắc hội chứng OAT, do đó không phát hiện thấy mất đoạn AZFa, AZFb là điều dễ hiểu. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu của các tác giả khác nhau, trong nhóm OAT vẫn có một tỷ lệ nhỏ mất đoạn AZFa, AZFb (8%) [13; 9]. Điều này có thể giải thích là do trong trường hợp mất đoạn AZFa, AZFb hoàn toàn thì không thể tìm thấy tinh trùng nhưng nếu mất đoạn AZFa, AZFb không hoàn toàn vẫn có một tỷ lệ nhỏ tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch với mật độ thấp và chất lượng kém. Với 40 trường hợp mất đoạn, mất đoạn AZFc+d chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%), tiếp sau là mất đoạn AZFc đơn thuần (32,5%) và mất đoạn AZFd đơn thuần (20%). So với nghiên cứu khác trên người Ấn Độ, tỷ lệ mất đoạn AZFc+d (chiếm tỷ lệ 67,7%) cao hơn so với tỷ lệ của chúng tôi [10]. Sự khác biệt này có thể do khác biệt về lựa chọn cỡ mẫu và sự khác biệt về chủng tộc. STS (Sequence Tagged Site) là một đoạn trình tự ngắn (200 - 500bp) duy nhất trong một bộ gen. Đoạn trình từ này được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tất cả trình TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 201728 tự còn lại của gen đó. Đối với mất đoạn AZFc, chúng tôi sử dụng hai STS là: sY254 và sY255. Cả hai vị trí STS này bị mất với tỷ lệ tương đương nhau (32,5%). Trong mất đoạn AZFd, chúng tôi sử dụng hai STS là: sY152 và BPY2, toàn bộ mất đoạn xảy ra ở vị trí sY152, chúng tôi chưa phát hiện được trường hợp nào mất đoạn xảy ra ở vị trí BPY2. Kết quả này tương tự như nghiên cứu một số tác giả khác đều không phát hiện thấy mất BPY2 trong nhóm OAT [14]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu ở 226 nam giới Slovenia bị vô sinh, phát hiện được 2 trường hợp mất BPY2 trong nhóm OAT [12]. Sự khác biệt này có thể do khác biệt về lựa chọn cỡ mẫu và sự khác biệt về chủng tộc. Hội chứng OAT được chia làm ba mức độ: mức độ nhẹ (mật độ tinh trùng từ 10 - 15 triệu/ ml), mức độ trung bình (mật độ tinh trùng từ 5 - 10 triệu/ml) và mức độ nặng (mật độ tinh trùng 0 - 5 triệu/ml). Trong nghiên cứu này, mất đoạn xảy ra chủ yếu ở nhóm OAT mức độ nặng, chiếm 16%, cao hơn so với nhóm OAT mức độ trung bình và vừa. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: mất đoạn AZFd, AZFc+d ở ba nhóm OAT mức độ nhẹ, trung bình và nặng có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. Trong khi đó, mất đoạn AZFc đơn thuần chỉ gặp ở nhóm OAT mức độ nặng, chiếm tỷ lệ 100%. Trong số 32 trường hợp mất đoạn AZFc (đơn thuần và kết hợp) có tới 19 trường hợp bị OAT mức độ nặng chiếm (59,4%). Những điều này cho thấy mất đoạn AZFc ảnh hưởng tới mật độ và chất lượng tinh trùng nặng nề hơn so với mất đoạn AZFd. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu phát hiện mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở 327 nam giới mắc hội chứng OAT: - Tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y là 12,2%, trong đó: mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 80% (AZFc đơn thuần là 32,5%; AZFc+d là 47,5%); mất đoạn AZFd chiếm tỷ lệ 20%. Chưa phát hiện được trường hợp nào mất đoạn AZFb, AZFa. - Trong mất đoạn AZFd, toàn bộ mất đoạn xảy ra ở vị trí sY152, chưa phát hiện được trường hợp nào mất đoạn xảy ra ở vị trí BPY2. Trong mất đoạn AZFC, mất đoạn xảy ra ở hai vị trí sY254 và sY255 với tỷ lệ tương đương nhau (32,5%). - Mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y xảy ra chủ yếu ở nhóm OAT mức độ nặng, chiếm 16%. Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện thành công nhờ sự hỗ trợ của các thầy cô và anh chị ở Bộ môn Y sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. World Health Organization (1999). WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus. 3th Edition, Cambridge University Press: Cambridge. 2. World Health Organization (2010). Laboratory manual for the Examination and processing of human semen. 5th Edition. Cambridge University Press: Cambridge. 3. Ku P.S. (1988). Aritifical Insemination of Oligo-astheno-teratozoospermia. Journal Korean Andrology Sociation. 6, 85 - 102. 4. Huda I., Al-Qadhi, Haidar M. et al (2016). Coenzyme Q10 Effect on Varicocele Associated Asthenozoospermia. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 11, 69 - 739. 5. Krausz C., Hoefsloot L., Simoni M. et al (2013). EAA/EMQN best practiceguidelines for molecular diiiagnosis of Y-chromosomal TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 29 microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrology. 2, 5 - 14. 6. Jungwirth A., Diemer T., Dohle G., et al (2015). Guidelines on Male Infertility. Eur Urol. 63 (3), 1-33. 7. Simoni M. Molecular diagnosis of Y chromosome microdeletions in Europe: state- of-the-art and quality control. Hum Reprod. 16, 402 - 409. 8. Elfateh F., Wang R., Zhang Z., et al (2014). Influence of genetic abnormalities on semen quality and male fertility: A four-year prospective study. Iran J Reprod Med. 12, 95 - 100. 9. Arundhati S., Madon F., Naik, J., et al (2004). A Study of Y Chromosome Microdeletions in Infertile Indian Males. Int J Hum Genet. 4, 179 - 185. 10. Massart A., Lissens W., Tournaye H., et al (2012). Genetic causes of spermatogenic failure. Asian Journal of Andrology. 14, 40 - 48. 11. Kent M., Muallem A., Shultz J., et al (1999). Defining regions of the Y-chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chro- mosome microdeletion detection. MolReprod Dev. 53, 27 - 41. 12. Phan Thị Hoan, Trần Đức Phấn (2013). Phát hiện mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở các bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng. Y học Việt Nam. Số đặc biệt, 622 - 625. 13. Vijayalakshmi J., Venkatachalam P. (2013). Chromosomal Anomalies in Patients with Azoospermia and Oligoasthenoteratozo- ospermia. International Journal of Human Ge- netics. 13, 183 - 187. 14. Nguyễn Đức Nhự (2013), Phát hiện mất đoạn AZFd trên nhiễm sắc thể Y ở những bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Y Học Việt Nam. 1, 54 - 58. Summary DETECTION OF MICRODELLETION ON Y CHROMOSOME IN MALE WITH OAT SYNDROME OAT syndrome (Oligo-Astheno-Teratozoospermia) is a condition of low concentration, poor motility and high rate of abnormal shape of sperm in human semen. OAT syndrome is found in approximately 8.5% of tested males and 12.5% of males with abnormal semen. The objective of this study is to detect the microdeletion on Y chromosome in male with syndrome OAT. 327 males with syndrome OAT were tested by performing three multiplex PCR. We found 40 of 327 males -representing 12.2% -have microdeletion on chromosome Y. Microdeletion in the AZFc region has the highest rate of 80% while microdeletion in the AZFd region represents 20%. With microdeletion in AZFd region, the entire microdeletion occurred in position sY152 and none in PBY2 position. Microdeletions occur mainly in severe OAT group with a 16% rate. Keywords: Microdeletion, Y chromosome, OAT syndrome.