Phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt bằng kỹ thuật PCR

BÀN LUẬN 60 bệnh nhân CML đã được xác định chẩn đoán với tủy đồ dương tính từ phòng thí nghiệm huyết học bệnh viện Chợ Rẫy và đang được điều trị ngoại trú tại phòng khám huyết học của bệnh viện. Thuốc sử dụng điều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea), đây là một loại thuốc chống chuyển hoá, tác dụng nhanh, ít độc, ít gây suy tủy(8). Tuy nhiên loại thuốc này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn tác nhân chính gây bệnh là các bản sao của gene tổ hợp BCR-ABL(8), điều này giải thích vì sao khi chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện sự hiện diện gen tổ hợp BCR-ABL ở 59/60 bệnh nhân CML (98.33%). Carol D. Jone và CS (2003)(3) cũng như Susan Branford 2006(1) cho rằng tỷ lệ này là lớn hơn 95% và như vậy là hoàn toàn tương đồng với kết quả của chúng tôi. Cũng từ những kết quả trên chúng ta thấy rằng bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt xuất hiện chủ yếu ở những người đã trưởng thành, đặc biệt ở độ tuổi trung niên (41 – 60). KẾT LUẬN Từ kết quả trên, chúng tôi cho rằng, chúng ta có thể hoàn thiện quy trình xét nghiệm để sau đó đem ra áp dụng ở những cơ sở khám và chữa bệnh. Điều này sẽ giúp cho thầy thuốc lâm sàng có một phương tiện đáng tin cậy để nhanh chóng xác định chẩn đoán bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, đồng thời có kế hoạch điều trị cũng như theo dõi đáp ứng điều trị bệnh CML một cách hiệu quả.

pdf5 trang | Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 07/02/2022 | Lượt xem: 167 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt bằng kỹ thuật PCR, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 565 PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT BẰNG KỸ THUẬT PCR Phan Đình Điền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thái Sơn** TÓM TẮT Đặt vấn ñề và Mục tiêu nghiên cứu: Nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện trong máu ngoại biên và tủy xương của bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia-CML) với tỷ lệ lớn hơn 95%, ñây là sản phẩm của sự chuyển ñoạn t(9;22), trong ñó ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của gene BCR trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11). Với kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), ở ñây là RT-PCR chúng ta có thể phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL của nhiễm sắc thể Philadelphia. Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát hiện và tiến hành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 và BCR-ABL b3a2 ñể xác ñịnh sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML. Đối tượng nghiên cứu: 60 bệnh nhân ñược xác ñịnh chẩn ñoán là CML với tủy ñồ dương tính và ñang ñược ñiều trị ngoại trú tại Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009. Phương pháp và mẫu nghiệm nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang, mô tả. 04 ml máu ngoại biên của bệnh nhân sẽ ñược lấy và cho vào tube có chất chống ñông bằng EDTA. Máu toàn phần sẽ ñược trích ly RNA, khuếch ñại 2 types của gene tổ hợp BCR-ABL là b2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR, tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng ñộ chuẩn của gene β-glucuronidase (GUS) S1:100.000 copies/ml, S2: 10.000 copies/ml và S3:1.000 copies/ml, ñược phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm. Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software. Kết quả: Phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML với tỷ lệ 98.33% (59/60 BN) trong ñó BCR-ABL b2a2: 32.20 %, BCR-ABL b3a2: 44.07 % và dạng kết hợp BCR-ABL b2a2 + b3a2 chiếm tỷ lệ 23.73 %. Kết luận: Những kết quả trên cho thấy có thể dùng kỹ thuật PCR ñể phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia. Việc so sánh ñối chiếu kết quả này với các tác giả khác trong và ngoài nước cũng ñược bàn luận ñể khẳng ñịnh giá trị của kỹ thuật. Từ khóa: Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, Gene tổ hợp BCR-ABL, Hoạt tính Tyrosine Kinase, Protein P210, Xét nghiệm RT-PCR. ABSTRACT DETECTION AND QUANTITATIVE THE PHILADELPHIA CHROMOSOME BY PCR TECHNIQUE IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA PATIENTS Phan Dinh Dien, Pham Hung Van, Nguyen Thai Son * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 - 2010: 565 - 569 Background: The BCR-ABL fusion gene, formed by rearrangement of the breakpoint cluster region (bcr) on chromosome 22 with the abl proto-oncogene on chromosome 9, is present in virtually all Chronic Myeloid Leukemia (CML) patients. The t(9;22) (q34;q11) translocation associated with BCR-ABL leads to a cytogenesis aberration known as Philadelphia chromosome, and it could be detected by PCR technique. Objective: To detect and quantitative analysis for fusion genes BCR-ABL including BCR-ABL b2a2 and BCR-ABL b3a2 transcripts to confirm the presentation of Philadelphia chromosome in CML patients. *Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Chợ Rẫy ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: TS Phạm Hùng Vân, ĐT: 0903698920, Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 566 Subjects: 60 cases of CML patients in chronic phase (CP) were confirmed by positive bone marrow smears that were undergoing treated in out patient department of Cho Ray hospital. Method and specimens: 04ml peripheral blood in an EDTA tube was collected, in this quantitative assay; extracted RNA is subject to Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) to amplify 02 types of BCR-ABL fusion transcripts: b2a2 and b3a2. An additional amplification of the GUS gene (β-glucuronidase) is performed as a control for sample RNA quality and as a reference for relative quantification. Results: Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98.33%) of these 60 blood samples. In these 59 positive cases, BCR-ABL b3a2 type has the highest rate of 44.07%, followed by BCR-ABL b2a2 type with 32.2%, and BCR-ABL b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73%. Conclusion: These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphia chromosome. We also compare our results with other local and foreign researchers to confirm the accuracy of this technique. Keywords: Chronic Myeloid Leukemia, BCR-ABL, Tyrosine kinase, Protein P210, RT-PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là một bệnh ác tính của hệ tạo máu với ñặc ñiểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt. Trong bệnh CML có một sự biến ñổi nhiễm sắc thể ñặc trưng ñó là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph)(4), ñây là sản phẩm của sự chuyển ñoạn giữa nhiễm sắc thể số 9 và nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22)(5). Theo khảo sát của các nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện ở máu ngoại biên và tuỷ xương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95%(3,1). Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy bản chất gene của nhiễm sắc thể Philadelphia là gene tổ hợp BCR-ABL(6) ñược tạo thành do sự chuyển ñoạn của ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của BCR gene trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11). Trong bệnh CML, gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase ñó là protein P210 (protein có trọng lượng phân tử 210 KD) và protein này chính là nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh CML(7). Tùy theo vị trí sắp xếp các ñiểm gãy (breakpoints) khác nhau trên BCR-gene và ABL-gene ta có các sản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 nếu vị trí sắp xếp các ñiểm gãy nằm giữa exon 13 và 14, hay ñó sẽ là BCR-ABL b3a2 nếu vị trí sắp xếp các ñiểm gãy nằm ở giữa exon 14 và 15(6). Phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML ñồng nghĩa với phát hiện ñược nhiễm sắc thể Philadelphia. Do vậy việc tiến hành xây dựng một kỹ thuật mới ñể phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML là một ñiều hết sức cần thiết trong chẩn ñoán và ñiều trị. Hình 1. Sự tạo thành gen BCR-ABL (Salesse et al 2002) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 567 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 60 bệnh nhân (bao gồm 32 nữ, chiếm tỉ lệ 53.33% và 28 nam, chiếm tỉ lệ 46.67 %) với ñộ tuổi nhỏ nhất là 20 ñến lớn nhất là 74 tuổi, ñược chẩn ñoán ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia, CML) với tủy ñồ dương tính và ñang ñược ñiều trị bằng các loại thuốc Hydrea (Không sử dụng các loại thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib) tại phòng khám huyết học của Bệnh Viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009. Phương pháp Lấy mẫu và bảo quản mẫu Lấy 04ml máu tĩnh mạch ngoại biên, cho vào ống nghiệm có chất chống ñông EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), lắc nhẹ ñể trộn ñều máu với chất chống ñông, bảo quản ở nhiệt ñộ 4-8oC trong vòng 08 giờ phải chuyển ñến phòng thí nghiệm ñể xử lý mẫu. Kỹ thuật xét nghiệm Máu toàn phần sẽ ñược trích ly RNA với bộ thuốc thử ñã ñược chuẩn hoá của Chomczynski (2). Khuếch ñại 2 types của gene tổ hợp BCR-ABL là b2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) sau ñó tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng ñộ chuẩn của gene β-glucuronidase (GUS) S1: 100.000 bản sao/ml, S2: 10.000 bản sao/ml và S3:1.000 bản sao/ml, ñược phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm. Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software. KẾT QUẢ Tương quan giữa ñộ tuổi và bệnh CML (Chronic Myeloid Leukemia) Bảng 1. Mối tương quan giữa ñộ tuổi và bệnh CML Độ tuổi Số lượng Tỷ lệ % < 30 12 / 60 20.00 30 – 40 11 / 60 18.33 41 – 50 12 / 60 20.00 51 – 60 17 / 60 28.33 61 – 74 08 / 60 13.33 Những kết quả ghi nhận ñược cho thấy ña số bệnh nhân CML ñều ở ñộ tuổi của người ñã trưởng thành, ñặc biệt tỷ lệ này khá cao ở tuổi trung niên (41 – 60) # 48.33%. Kết quả phân tích mẫu gene BCR-ABL từ 60 bệnh nhân CML Qua phân tích mẫu máu ngoại biên của 60 bệnh nhân CML ñã ñược xác ñịnh chẩn ñoán với tủy ñồ dương tính và ñang ñiều trị ngoại trú tại Bệnh Viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh, thuốc ñiều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea). Chưa có bệnh nhân nào ñược ñiều trị trị với các loại thuốc ức chế hoạt tính Tyrosine Kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib... Chúng tôi ñã phát hiện ñược 59/60 trường hợp (98,33%) mẫu máu ñược ñem phân tích có sự hiện diện gene BCR-ABL. Tần suất xuất hiện các dạng chuyển ñoạn của nhiễm sắc thể Philadelphia Bảng 2. Tần suất xuất hiện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong bệnh nhân CML Mẫu nghiệm dương tính với BCR-ABL (n = 59) Vị trí chuyển ñoạn Của nhiễm sắc thể Philadelphia Số lượng phát hiện Tỷ lệ % BCR-ABL b2a2 19 32.20 BCR-ABL b3a2 26 44.07 BCR-ABL b2a2 + b3a2 14 23.73 Bằng kỹ thuật RT-PCR, gene tổ hợp BCR-ABL ñã xuất hiện trong máu ngoại biên của 59/60 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 568 bệnh nhân: 19 người mang BCR-ABL b2a2 (32.20 %); 26 người mang BCR-ABL b3a2 (44.07 %) và 14 người mang dạng kết hợp b2a2 + b3a2 (23.73 %). Hình ảnh mẫu gene bình thường khi khảo sát bằng RT-PCR Hình 2. Mẫu gene của người bình thường (không có nhiễm sắc thể Philadelphia) Ở hình này chúng ta thấy sự hiện diện của 3 ñường chuẩn: S1, S2, và S3. Sự xuất hiện của GUS (gene bạch cầu của chính bệnh nhân) nói lên quá trình phiên mã ngược và khuếch ñại các bản sao từ phản ứng RT-PCR ñã ñược thực hiện thành công. Không phát hiện sự hiện diện các bản sao của gene BCR-ABL. Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng b2a2 BN.số 58. b2a2 = 291.000 copies/ml Hình 3. Mẫu có phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b2a2 Ở hình 3 ngoài sự hiện diện của 03 ñường chuẩn S1, S2, S3 và GUS còn phát hiện ñuợc sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b2a2 chứng tỏ ñây là mẫu máu của bệnh nhân ñang mang bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (CML). Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng b3a2 BN.số:51. b3a2 = 367 copies/ml Hình 4. Mẫu có phát hiện nhiễm sắc thể b2a2 STANDARD 1,2,3 GUS GUS STANDARD 1,2,3 STANDARD 1,2,3 GUS b3a2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 569 Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b3a2 Tương tự như trên chúng tôi phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia có sự chuyển ñoạn ở vị trí b3a2 ở Hình 4. Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng kết hợp b2a2+b3a2 BN.số: 60. b2a2 = 552 copies/ml b3a2 = 195.600 copies/ml Hình 5. Mẫu có phát hiện sự chuyển ñoạn ở cả hai vị trí b2a2 và b3a2 Trong một số bệnh nhân, qua phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software, chúng tôi thấy có sự hiện diện sự chuyển ñoạn ở cả 02 vị trí b2a2 và b3a2 trên nhiễm sắc thể Philadelphia. BÀN LUẬN 60 bệnh nhân CML ñã ñược xác ñịnh chẩn ñoán với tủy ñồ dương tính từ phòng thí nghiệm huyết học bệnh viện Chợ Rẫy và ñang ñược ñiều trị ngoại trú tại phòng khám huyết học của bệnh viện. Thuốc sử dụng ñiều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea), ñây là một loại thuốc chống chuyển hoá, tác dụng nhanh, ít ñộc, ít gây suy tủy(8). Tuy nhiên loại thuốc này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn tác nhân chính gây bệnh là các bản sao của gene tổ hợp BCR-ABL(8), ñiều này giải thích vì sao khi chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện sự hiện diện gen tổ hợp BCR-ABL ở 59/60 bệnh nhân CML (98.33%). Carol D. Jone và CS (2003)(3) cũng như Susan Branford 2006(1) cho rằng tỷ lệ này là lớn hơn 95% và như vậy là hoàn toàn tương ñồng với kết quả của chúng tôi. Cũng từ những kết quả trên chúng ta thấy rằng bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt xuất hiện chủ yếu ở những người ñã trưởng thành, ñặc biệt ở ñộ tuổi trung niên (41 – 60). KẾT LUẬN Từ kết quả trên, chúng tôi cho rằng, chúng ta có thể hoàn thiện quy trình xét nghiệm ñể sau ñó ñem ra áp dụng ở những cơ sở khám và chữa bệnh. Điều này sẽ giúp cho thầy thuốc lâm sàng có một phương tiện ñáng tin cậy ñể nhanh chóng xác ñịnh chẩn ñoán bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, ñồng thời có kế hoạch ñiều trị cũng như theo dõi ñáp ứng ñiều trị bệnh CML một cách hiệu quả. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Branford S and Hughes T. (2006) Diagnosis and Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR. Methods in Molecular Medicine. Vol 125:69-92. 2. Chomczynski P, (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem.Apr; 162(1): 156-9. 3. Jones CD, Yeung C (2003). Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use. Am J Clin Pathol 120: 42-48. 4. Nowel, PC and Hungerford D.A (1960) Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes. J Natl Cancer Inst 25: 85- 108. 5. Rowley JD (1973) A new consisten chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia ideltified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining.Nature 243: 290-3. 6. Salesse, S. and Verfaillie CM (2002). BCR/ABL: from molecular Mechanisms of Leukemia induction to treatment of chronic myelogenous Leukemia.Oncogene 21 (56): 8547- 59. 7. Sawyers, C.L. (1999). Chronic myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine 340(17):1330-59. 8. Tybor JG (2008) Targeted drugs in Chronic Myeloid Leukemia. Current medicinal Chemistry, 15: 3036-3051 STANDARD 1,2,3 GUS b2a2 b3a2

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfphat_hien_nhiem_sac_the_philadelphia_tren_benh_nhan_ung_thu.pdf
Tài liệu liên quan