Phát hiện và định lượng Hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng

KẾT LUẬN Định lượng nồng độ HBV – DNA trong máu là một thông số sinh học quan trọng và cần thiết để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu chiều hướng phát triển của bệnh và là cơ sở để các bác sĩ lâm sàng chỉ định và đánh giá hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này đạt được kết quả như sau: Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time PCR: - Nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C. - Nồng độ mồi là 400 nM. - Nồng độ mẫu dò Taqman là 100 nM. - Độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml. - Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. - Bên cạnh đó, có 34 trường hợp trong tổng số 46 người đến xét nghiệm, phát hiện có virus viêm gan B và định lượng được số lượng DNA đích ban đầu có trong cơ thể. - Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh viện ĐHYD TpHCM. Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Qua đó, bộ môn có thể tiến hành làm thường quy xét nghiệm này trong phát hiện, điều trị và theo dõi bệnh nhân viêm gan B. Chúng tôi hy vọng rằng kỹ thuật này sẽ là công cụ hỗ trợ cho những nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên nghiên cứu vẫn không thể tránh khỏi những hạn chế do thời gian tiến hành tương đối ngắn và về tài chính không đủ nên số lượng mẫu chưa đủ lớn. Chúng tôi hy vọng trong thời gian tới sẽ có những đề tài tiếp tục đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn và so sánh với các phương pháp định lượng khác, ứng dụng Real-time PCR trong việc theo dõi hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B, cũng như ứng dụng đường chuẩn tự dựng này với những bộ Kit khác giúp giảm giá thành của xét nghiệm.

pdf8 trang | Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 28/01/2022 | Lượt xem: 87 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phát hiện và định lượng Hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 182 PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTION VỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNG Nguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền* TÓM TẮT Đặt vấn đề: HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Người nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ đó gây ra cái chết của khoảng 500,000 – 700,000 người mỗi năm. Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR ra đời để định lượng HBV-DNA chính xác hơn, nhanh hơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi trong cả nước. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả được tiến hành trên 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan B. Tất cả bệnh nhân được định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT. Kết quả được so sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương mại. Sự tương đồng giữa hai kỹ thuật được chứng minh qua test Wilcoxon, test Spearman và biểu đồ Bland và Altman. Kết quả nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM và độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml. Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. Từ đó, chúng tôi đã phát hiện và định lượng được HBV-DNA ở 34 trong 46 trường hợp. So sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương mại, kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có sự tương đồng. Kết luận: Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng HBV- DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR. ABSTRACT DETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain Reaction WITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDS Nguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 182 - 189 Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis. People infected with chronic hepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death of about 500.000 to 700.000 patients every year. Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNA more accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country. Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve to quantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patient's blood sample tested for hepatitis B. * Bộ môn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Trần Minh Thắng ĐT 0934.014.937 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 183 Research Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B. All patients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Results were compared with real-time PCR results using standard curve commercial. The similarities between the two techniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph. Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique with primer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probe and the sensitivity of reaction was 100 copies / ml. Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is 100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B. Since then, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases. Compared with real-time PCR results using standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows the similarities. Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA with self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề đang rất được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới hiện nay. Nhiễm virus viêm gan B là một trong những nguyên nhân làm tăng tỉ lệ mắc bệnh và tăng tỉ lệ tử vong toàn cầu(1,15). HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Mặc dù việc sử dụng vắc xin đã hiện hữu trong hai thập kỷ qua nhưng vẫn có khoảng 360 triệu người trên thế giới bị nhiễm virus viêm gan B mãn tính(15). Người nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ người lành mang mầm bệnh không triệu chứng đến xơ gan và ung thư tế bào gan. Trong đó, xơ gan và ung thư tế bào gan là các nguyên nhân chính gây ra cái chết của 500,000 – 700,000 người mỗi năm(15). Việc chẩn đoán và theo dõi lâm sàng của nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên sự phát hiện kháng nguyên (HBsAg, HBeAg), kháng thể (anti HBs, anti HBc và anti HBe) bằng kỹ thuật ELISA và chất liệu di truyền của virus (HBV – DNA) dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Trong đó, xét nghiệm ELISA vẫn là một trong các phương pháp chính để phát hiện người nhiễm virus viêm gan B. Tuy nhiên, kết quả của ELISA không phản ánh được chính xác lượng virus trong huyết thanh hay hoạt động của virus viêm gan B cũng như hiệu quả của điều trị thuốc kháng virus(16). Bên cạnh đó, khoảng mười năm gần đây, xét nghiệm PCR(14), các phương pháp lai bắt RNA:DNA(11), phương pháp khuếch đại tín hiệu bởi bDNA(7,11) ... là các xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện HBV – DNA cũng được sử dụng rộng rãi. Mặc dù vậy trên thực tế, các phương pháp này bị giới hạn vì khả năng dễ lây nhiễm chéo của mẫu thử trong quá trình thao tác kỹ thuật và tốn nhiều thời gian trong giai đoạn điện di sau thí nghiệm nên không thích hợp để thực hiện thường qui trong thực chẩn đoán cận lâm sàng(8,13,14). Một phương pháp chính xác hơn, nhanh hơn và cho hiệu suất cao hơn để định lượng HBV – DNA và định genotype của virus viêm gan B, đó là Real-time PCR(12). Hiện nay, đây là phương pháp hữu dụng trong việc theo dõi hiệu quả của điều trị, phát hiện các đột biến đề kháng thuốc và tái phát sau khi ngưng điều trị. Mục đích của nghiên cứu này là bước đầu thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA trên nền tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR phát hiện vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 184 dựng và sử dụng các đoạn dò huỳnh quang Taqman. Chúng tôi hi vọng từ nghiên cứu này có thể đưa ra thêm một phương pháp xét nghiệm HBV-DNA đáp ứng về chất lượng và giá thành hợp lý, giúp phát hiện và theo dõi kết quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B. Bên cạnh đó, còn có thể sử dụng hóa chất của các hãng khác nhau. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả các trường hợp bệnh. Đối tượng nghiên cứu Tất cả các bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B tại BVĐHYD cơ sở 2 có HBsAg dương tính và HBeAg dương tính trong khoảng thời gian từ 30/08/2009 đến 30/12/2009. Loại trừ những bệnh nhân bị viêm gan B mà HBsAg âm tính hay HBeAg âm tính hay cả hai đều âm tính và những bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu. Các bước tiến hành Lấy máu Lấy 4 ml máu và cho vào 2 tube chống đông bằng EDTA, mỗi tube 2 ml máu. 1 tube lưu giữ tại BVĐHYD cơ sở 2 để làm xét nghiệm, 1 tube gửi về bộ môn Hóa Sinh – Sinh học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Tại phòng thí nghiệm ở bộ môn, các mẫu máu sẽ được ly tâm tách huyết thanh lưu trữ -20oC. Ly trích DNA Được thực hiện theo quy trình của bộ High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche). Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR Trình tự của cặp mồi Mồi HBV dùng để khuếch đại đoạn pre-S của virus viêm gan B. Sản phẩm khuếch đại có kích thước 89bp, từ vị trí nucleotide 730 – 819. Đoạn mồi được cung cấp bởi nhà sản xuất IDT (Intergrated DNA Technologies, USA) do bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT xây dựng. Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng Real-time PCR Phản ứng Real-time PCR là một phản ứng nhạy và cho kết quả định lượng rất chính xác. Tuy nhiên, cũng như phản ứng PCR thông thường, Real-time PCR có thể bị ức chế bởi một số thành phần tồn tại ngay trong chính phản ứng như hàm lượng bản mẫu, nhiệt độ bắt cặp của mồi, nồng độ của mẫu dò Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo ra phản ứng Real-time PCR với hiệu quả tối ưu nhất, bao gồm: Nhiệt độ bắt cặp của mồi, Khảo sát nồng độ mồi, Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman. Độ lập lại của phản ứng Real-time PCR Đây cũng là một yếu tố quan trọng. Trên cùng một mẫu, kết quả thu nhận có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm cũng như giữa các phòng thí nghiệm. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người thực hiện, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng Real-time PCR(4), Để đánh giá độ lập lại của phản ứng Real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lập lại của phản ứng trong cùng một lần thí nghiệm và giữa các lần thí nghiệm(10). Đường chuẩn Đường chuẩn là một khái niệm rất quan trọng và chuyên biệt cho phản ứng Real-time PCR. Thông qua đường chuẩn giúp chúng ta có thể xác định một cách chính xác hàm lượng acid nucleic trong mẫu ta cần quan tâm. Ngoài ra, đường chuẩn cũng giúp chúng ta đánh giá liệu các điều kiện của phản ứng Real-time PCR mà chúng ta chọn là tối ưu hóa hay chưa. Một phản ứng Real-time PCR tối ưu phải là phản ứng cho E% từ 90-105% và R2 phải đạt ≥ 0,99. Ngoài ra tiêu chuẩn tiên quyết một đường chuẩn đạt yêu cầu, hệ số góc của đường chuẩn phải đạt từ -3,32 đến -3,8(5). Trong quá trình làm nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra so sánh với Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 185 đường chuẩn của công ty Khoa Thương – Việt Nam. Chúng tôi dùng một nồng độ là 3 x 102 trong bộ chuẩn thương mại của công ty Khoa Thương Việt Nam để kiểm tra chất lượng đường chuẩn. Tiến hành định lượng cùng đường chuẩn, phản ứng được lập lại 3 lần. Độ nhạy của phản ứng Độ nhạy được xác định trên mẫu huyết thanh ở người nhiễm virus viêm gan B với nồng độ là 4,5 × 107 copies/ml. Tiến hành quy trình Real-time PCR Phản ứng Real-time PCR của các mẫu bệnh phẩm luôn chạy tiến hành cùng một lúc với đường chuẩn (mẫu chứng dương) và một mẫu nước (mẫu chứng âm). Phân tích số liệu Số liệu đem đi phân tích với các test chỉ lấy từ 33 mẫu phát hiện và định lượng được với cả hai kỹ thuật của bộ môn và bệnh viện. Dữ liệu được phân tích và mô tả bằng test Wilcoxon(9), test phi tham số Spearman(9) và biểu đồ Bland và Altman(2,3). Tất cả dữ liệu thống kê sẽ được thực hiện bởi phần mềm SPSS 17,0 và Medcalc 11,3,0,0. KẾT QUẢ Từ 30/08/2009 đến 30/12/2009, có 46 bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu được đưa vào nghiên cứu. Chúng tôi đã phát hiện và định lượng được 34 trường hợp có mang virus viêm gan B trong cơ thể, 12 trường hợp còn lại có kết quả âm tính. Nhiệt độ bắt cặp của mồi Sau khi khảo sát các phổ nhiệt độ từ 59 – 61oC, chúng tôi nhận thấy 60oC là nhiệt độ bắt cặp thích hợp nhất. Hình 1: Nhiệt độ bắt cặp của mồi Khảo sát nồng độ mồi Tại nồng độ mồi là 400 nM thì E% là 100,0% và R2 ≥ 0,99. Vậy 400 nM là nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng của chúng tôi. Hình 2: Khảo sát nồng độ mồi Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman 200 nM là nồng độ mẫu dò tối ưu với E% là 100,0% và R2 ≥ 0,99. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 186 Hình 3: Khảo sát nồng độ mẫu dò Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR: Độ lập lại trong một phản ứng (intraassay) Trị số trung bình của hai nồng độ pha loãng 10-1 và 10-3 lần lượt là 18,14 và 27,08. Hình 4: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại trong một phản ứng Độ lập lại giữa các lần thí nghiệm (interassay) Kết quả trị số trung bình của hai nồng độ pha loãng 10-1 và 10-3 lần lượt 18,38 và 26,61. Hình 5: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại giữa các lần thí nghiệm Đường chuẩn Kết quả giá trị virus trung bình sau 3 lần thử nghiệm là 2,73 × 102 copies/ml, khác biệt không đáng kể so với giá trị lý thuyết là 0,27 × 102 copies/ml. đường chuẩn mà chúng tôi xây dựng được có R2 là 0,999 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58. Hình 6: Đường chuẩn Độ nhạy của phản ứng Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 100 copies/ml. Hình 7: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 187 BÀN LUẬN Phân tích kỹ thuật Nhiệt độ bắt cặp của mồi Với một phổ nhiệt độ từ 59 – 61oC, chúng tôi nhận thấy chu kỳ ngưỡng của sản phẩm khuếch đại ở tất cả các nhiệt độ khảo sát không có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, tại nhiệt độ 60oC sản phẩm khuếch đại có tín hiệu huỳnh quang cao hơn so với tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại tại các nhiệt độ khác. Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ 60oC là nhiệt độ bắt cặp thích hợp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó(10,13). Khảo sát nồng độ mồi Kết quả cho thấy tại nồng độ mồi là 400 nM thì E% và R2 nằm trong giới hạn tối ưu của phản ứng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đó(10). Như vậy 400 nM là nồng độ mồi tối ưu. Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman Chúng tôi nhận thấy với các nồng độ mẫu dò khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại với chu kỳ ngưỡng tương tự nhau, nhưng với nồng độ mẫu dò là 200 nM thì với E% là 100,0% và R2 ≥ 0,99. Như vậy, 200 nM là nồng độ mẫu dò tối ưu cho phản ứng Real-time PCR. Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR Khoảng biến thiên của giá trị trung bình không quá 1 Ct, chứng tỏ phản ứng Real-time PCR của chúng tôi có tính lập lại cao. Đường chuẩn Việc sử dụng biological standard để tạo đường chuẩn có các lợi điểm so với dùng gam đường chuẩn thương mai trên thị trường: - Rẻ tiền, sản xuất được số lượng lớn. - Dễ lưu trữ, dễ chuẩn bị. - Chủ động được các khoảng cách về nồng độ, không bị giới hạn. - Có thể sử dụng hóa chất của các hãng khác nhau. Ở nghiên cứu này, đường chuẩn mà chúng tôi xây dựng được có R2 là 0,999 và E% là 100% và hệ số gốc là -3,58. Độ nhạy của phản ứng Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 100 copies/ml, vì tại đó phản ứng cho tín hiệu tốt còn ở nồng độ 50 copies/ml tín hiệu thấp và 10 copies/ml, phản ứng không có tín hiệu được ghi nhận. Chất lượng của xét nghiệm Test Wilcoxon cho thấy không có sự khác biệt về thống kê giữa kết quả của hai kỹ thuật. Bên cạnh đó, test phi tham số Spearman cho thấy có mối tương quan giữa kỹ thuật Real-time PCR của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM. Hình 8: Biểu đồ Bland và Altman Hơn thế nữa, biểu đồ Bland và Altman cho chúng ta biết kết quả định lượng của BVĐHYD theo log10 copies/ml có thể thấp hơn 0,074 nhưng cũng có thể cao hơn 0,052 so với kết quả của bộ môn. Áp dụng vào lâm sàng, chúng tôi thấy sự chênh nhau giữa hai kết quả là không quá 10 copies/ml. Kế đến, chúng tôi thấy trung bình của sự khác biệt gần giá trị 0, phương trình y = b + ax có hệ số a và b cũng gần với giá trị 0, nên sự khác biệt về kết quả giữa hai kỹ thuật là gần như không đáng kể. Vậy hai kỹ thuật này có thể thay thế cho nhau. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 188 Tóm lại, các kết quả kể trên chứng tỏ có sự tương đồng về mặt kỹ thuật của xét nghiệm Real- time PCR giữa bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM. KẾT LUẬN Định lượng nồng độ HBV – DNA trong máu là một thông số sinh học quan trọng và cần thiết để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu chiều hướng phát triển của bệnh và là cơ sở để các bác sĩ lâm sàng chỉ định và đánh giá hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này đạt được kết quả như sau: Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time PCR: - Nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C. - Nồng độ mồi là 400 nM. - Nồng độ mẫu dò Taqman là 100 nM. - Độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml. - Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. - Bên cạnh đó, có 34 trường hợp trong tổng số 46 người đến xét nghiệm, phát hiện có virus viêm gan B và định lượng được số lượng DNA đích ban đầu có trong cơ thể. - Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh viện ĐHYD TpHCM. Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Qua đó, bộ môn có thể tiến hành làm thường quy xét nghiệm này trong phát hiện, điều trị và theo dõi bệnh nhân viêm gan B. Chúng tôi hy vọng rằng kỹ thuật này sẽ là công cụ hỗ trợ cho những nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên nghiên cứu vẫn không thể tránh khỏi những hạn chế do thời gian tiến hành tương đối ngắn và về tài chính không đủ nên số lượng mẫu chưa đủ lớn. Chúng tôi hy vọng trong thời gian tới sẽ có những đề tài tiếp tục đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn và so sánh với các phương pháp định lượng khác, ứng dụng Real-time PCR trong việc theo dõi hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B, cũng như ứng dụng đường chuẩn tự dựng này với những bộ Kit khác giúp giảm giá thành của xét nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. AASLD. "American Association for the Study of Liver Diseases". Available from: 2. Bland J M, Altman D G. (1995): "Comparing methods of measurement: why plotting difference against standard method is misleading. Lancet". 346(8982):1085-7. 3. Bland J M, Altman D G. (1986): "Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet".1(8476):307-10. 4. Bustin S A. (2002): "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol".29(1):23-39. 5. Đỗ Đình Hồ, Đỗ Như Hiền. (2006): "Giáo trình Sinh Học Phân Tử (trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch)". 6. Gurtsevitch V E. (2008): "Human oncogenic viruses: hepatitis B and hepatitis C viruses and their role in hepatocarcinogenesis. Biochemistry (Mosc)". 73(5):504-13. 7. Hendricks D A, Stowe B J, Hoo B S, Kolberg J, Irvine B D, Neuwald P D, et al. (1995): "Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA (bDNA) signal amplification assay. Am J Clin Pathol". 104(5):537-46. 8. Huy T T, Ushijima H, Win K M, Luengrojanakul P, Shrestha P K, Zhong Z H, et al. (2003): "High prevalence of hepatitis B virus pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship with genotype and chronicity. J Clin Microbiol".41(12):5449-55. 9. Konnick E Q, Erali M, Ashwood E R, Hillyard D R. (2005): "Evaluation of the COBAS amplicor HBV monitor assay and comparison with the ultrasensitive HBV hybrid capture 2 assay for quantification of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol". 43(2):596-603. 10. Ngô Như Hòa, Lê Trường Giang. (1997): "Thống Kê Y Học". 11. Pas S D, Fries E, De Man R A, Osterhaus A D, Niesters H G. (2000): "Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. J Clin Microbiol".38(8):2897-901. 12. Pawlotsky J M. (2003): "Hepatitis B virus (HBV) DNA assays (methods and practical use) and viral kinetics. J Hepatol". 39 Suppl 1:S31-5. 13. Payungporn S, Tangkijvanich P, Jantaradsamee P, Theamboonlers A, Poovorawan Y. (2004): "Simultaneous quantitation and genotyping of hepatitis B virus by real-time PCR and melting curve analysis. J Virol Methods".120(2):131-40. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 189 14. Phạm Hùng Vân. (2009): "PCR và Real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp". 15. Sitnik R, Paes A, Mangueira C P, Pinho J R. (2010): "A real-time quantitative assay for hepatitis B DNA virus (HBV) developed to detect all HBV genotypes. Rev Inst Med Trop Sao Paulo".52(3):119-24. 16. WHO. World Health Organization. Available from: /en/index.html. 17. Zhao J R, Bai Y J, Zhang Q H, Wan Y, Li D, Yan X J.(2005): "Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol". 11(4):508-10.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfphat_hien_va_dinh_luong_hepatitis_b_virus_dna_bang_ky_thuat.pdf
Tài liệu liên quan