KẾT LUẬN
Định lượng nồng độ HBV – DNA trong máu
là một thông số sinh học quan trọng và cần thiết
để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu
chiều hướng phát triển của bệnh và là cơ sở để
các bác sĩ lâm sàng chỉ định và đánh giá hiệu
quả điều trị.
Nghiên cứu này đạt được kết quả như sau:
Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time
PCR:
- Nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C.
- Nồng độ mồi là 400 nM.
- Nồng độ mẫu dò Taqman là 100 nM.
- Độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml.
- Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có
R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là
đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu
cho virus viêm gan B.
- Bên cạnh đó, có 34 trường hợp trong tổng
số 46 người đến xét nghiệm, phát hiện có virus
viêm gan B và định lượng được số lượng DNA
đích ban đầu có trong cơ thể.
- Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh
viện ĐHYD TpHCM.
Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học
phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong
các lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. Qua nghiên
cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật
Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA
với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh
– Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Qua đó,
bộ môn có thể tiến hành làm thường quy xét
nghiệm này trong phát hiện, điều trị và theo dõi
bệnh nhân viêm gan B. Chúng tôi hy vọng rằng
kỹ thuật này sẽ là công cụ hỗ trợ cho những
nghiên cứu tiếp theo.
Tuy nhiên nghiên cứu vẫn không thể tránh
khỏi những hạn chế do thời gian tiến hành
tương đối ngắn và về tài chính không đủ nên số
lượng mẫu chưa đủ lớn. Chúng tôi hy vọng
trong thời gian tới sẽ có những đề tài tiếp tục
đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn và so sánh
với các phương pháp định lượng khác, ứng
dụng Real-time PCR trong việc theo dõi hiệu
quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B,
cũng như ứng dụng đường chuẩn tự dựng này
với những bộ Kit khác giúp giảm giá thành của
xét nghiệm.
8 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 28/01/2022 | Lượt xem: 253 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phát hiện và định lượng Hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 182
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNA
BẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTION
VỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNG
Nguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Người nhiễm virus viêm
gan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ đó gây ra cái chết của khoảng 500,000 –
700,000 người mỗi năm. Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR ra đời để định lượng HBV-DNA chính xác hơn, nhanh
hơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi trong cả nước.
Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định
lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả được tiến hành trên 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan
B. Tất cả bệnh nhân được định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng của bộ
môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT. Kết quả được so sánh với kết quả real-time PCR sử
dụng đường chuẩn thương mại. Sự tương đồng giữa hai kỹ thuật được chứng minh qua test Wilcoxon, test
Spearman và biểu đồ Bland và Altman.
Kết quả nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR với
nhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM và độ nhạy của phản ứng là
100 copies/ml. Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt
chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. Từ đó, chúng tôi đã phát hiện và định lượng
được HBV-DNA ở 34 trong 46 trường hợp. So sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương
mại, kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có sự tương đồng.
Kết luận: Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng
HBV- DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT.
Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR.
ABSTRACT
DETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain Reaction
WITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDS
Nguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 182 - 189
Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis. People infected with chronic
hepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death of
about 500.000 to 700.000 patients every year. Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNA
more accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country.
Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve to
quantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patient's blood sample tested for hepatitis B.
* Bộ môn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Trần Minh Thắng ĐT 0934.014.937
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 183
Research Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B. All
patients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve of
Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Results were
compared with real-time PCR results using standard curve commercial. The similarities between the two
techniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph.
Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique with
primer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probe
and the sensitivity of reaction was 100 copies / ml. Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is
100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B. Since
then, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases. Compared with real-time PCR results
using standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows the
similarities.
Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA with
self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of
Medicine.
Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề đang
rất được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới
hiện nay. Nhiễm virus viêm gan B là một trong
những nguyên nhân làm tăng tỉ lệ mắc bệnh và
tăng tỉ lệ tử vong toàn cầu(1,15).
HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh
viêm gan cấp hoặc mãn. Mặc dù việc sử dụng
vắc xin đã hiện hữu trong hai thập kỷ qua nhưng
vẫn có khoảng 360 triệu người trên thế giới bị
nhiễm virus viêm gan B mãn tính(15). Người
nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với
những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ người
lành mang mầm bệnh không triệu chứng đến xơ
gan và ung thư tế bào gan. Trong đó, xơ gan và
ung thư tế bào gan là các nguyên nhân chính
gây ra cái chết của 500,000 – 700,000 người mỗi
năm(15).
Việc chẩn đoán và theo dõi lâm sàng của
nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên sự
phát hiện kháng nguyên (HBsAg, HBeAg),
kháng thể (anti HBs, anti HBc và anti HBe)
bằng kỹ thuật ELISA và chất liệu di truyền của
virus (HBV – DNA) dựa trên kỹ thuật sinh học
phân tử. Trong đó, xét nghiệm ELISA vẫn là
một trong các phương pháp chính để phát hiện
người nhiễm virus viêm gan B. Tuy nhiên, kết
quả của ELISA không phản ánh được chính
xác lượng virus trong huyết thanh hay hoạt
động của virus viêm gan B cũng như hiệu quả
của điều trị thuốc kháng virus(16). Bên cạnh đó,
khoảng mười năm gần đây, xét nghiệm PCR(14),
các phương pháp lai bắt RNA:DNA(11), phương
pháp khuếch đại tín hiệu bởi bDNA(7,11) ... là
các xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
trong việc phát hiện HBV – DNA cũng được sử
dụng rộng rãi. Mặc dù vậy trên thực tế, các
phương pháp này bị giới hạn vì khả năng dễ
lây nhiễm chéo của mẫu thử trong quá trình
thao tác kỹ thuật và tốn nhiều thời gian trong
giai đoạn điện di sau thí nghiệm nên không
thích hợp để thực hiện thường qui trong thực
chẩn đoán cận lâm sàng(8,13,14). Một phương
pháp chính xác hơn, nhanh hơn và cho hiệu
suất cao hơn để định lượng HBV – DNA và
định genotype của virus viêm gan B, đó là
Real-time PCR(12). Hiện nay, đây là phương
pháp hữu dụng trong việc theo dõi hiệu quả
của điều trị, phát hiện các đột biến đề kháng
thuốc và tái phát sau khi ngưng điều trị.
Mục đích của nghiên cứu này là bước đầu
thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA
trên nền tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR
phát hiện vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 184
dựng và sử dụng các đoạn dò huỳnh quang
Taqman.
Chúng tôi hi vọng từ nghiên cứu này có
thể đưa ra thêm một phương pháp xét nghiệm
HBV-DNA đáp ứng về chất lượng và giá
thành hợp lý, giúp phát hiện và theo dõi kết
quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan
B. Bên cạnh đó, còn có thể sử dụng hóa chất
của các hãng khác nhau.
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả các trường hợp bệnh.
Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các bệnh nhân đến xét nghiệm viêm
gan B tại BVĐHYD cơ sở 2 có HBsAg dương
tính và HBeAg dương tính trong khoảng thời
gian từ 30/08/2009 đến 30/12/2009.
Loại trừ những bệnh nhân bị viêm gan B mà
HBsAg âm tính hay HBeAg âm tính hay cả hai
đều âm tính và những bệnh nhân không đồng ý
tham gia nghiên cứu.
Các bước tiến hành
Lấy máu
Lấy 4 ml máu và cho vào 2 tube chống
đông bằng EDTA, mỗi tube 2 ml máu. 1 tube
lưu giữ tại BVĐHYD cơ sở 2 để làm xét
nghiệm, 1 tube gửi về bộ môn Hóa Sinh – Sinh
học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Tại phòng
thí nghiệm ở bộ môn, các mẫu máu sẽ được ly
tâm tách huyết thanh lưu trữ -20oC.
Ly trích DNA
Được thực hiện theo quy trình của bộ High
Pure PCR Template Preparation Kit (Roche).
Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR
Trình tự của cặp mồi
Mồi HBV dùng để khuếch đại đoạn pre-S
của virus viêm gan B. Sản phẩm khuếch đại có
kích thước 89bp, từ vị trí nucleotide 730 – 819.
Đoạn mồi được cung cấp bởi nhà sản xuất IDT
(Intergrated DNA Technologies, USA) do bộ
môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường
ĐHYKPNT xây dựng.
Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng Real-time
PCR
Phản ứng Real-time PCR là một phản ứng
nhạy và cho kết quả định lượng rất chính xác.
Tuy nhiên, cũng như phản ứng PCR thông
thường, Real-time PCR có thể bị ức chế bởi một
số thành phần tồn tại ngay trong chính phản
ứng như hàm lượng bản mẫu, nhiệt độ bắt cặp
của mồi, nồng độ của mẫu dò Chính vì vậy,
chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện
cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo
ra phản ứng Real-time PCR với hiệu quả tối ưu
nhất, bao gồm: Nhiệt độ bắt cặp của mồi, Khảo
sát nồng độ mồi, Khảo sát nồng độ mẫu dò
Taqman.
Độ lập lại của phản ứng Real-time PCR
Đây cũng là một yếu tố quan trọng. Trên
cùng một mẫu, kết quả thu nhận có thể khác
nhau giữa các lần thí nghiệm cũng như giữa các
phòng thí nghiệm. Khả năng gây ra sự khác biệt
này có thể là do thao tác của người thực hiện, sự
biến động của các thành phần hóa chất trong
phản ứng Real-time PCR(4), Để đánh giá độ
lập lại của phản ứng Real-time PCR, chúng tôi
tiến hành khảo sát độ lập lại của phản ứng trong
cùng một lần thí nghiệm và giữa các lần thí
nghiệm(10).
Đường chuẩn
Đường chuẩn là một khái niệm rất quan
trọng và chuyên biệt cho phản ứng Real-time
PCR. Thông qua đường chuẩn giúp chúng ta có
thể xác định một cách chính xác hàm lượng acid
nucleic trong mẫu ta cần quan tâm. Ngoài ra,
đường chuẩn cũng giúp chúng ta đánh giá liệu
các điều kiện của phản ứng Real-time PCR mà
chúng ta chọn là tối ưu hóa hay chưa. Một phản
ứng Real-time PCR tối ưu phải là phản ứng cho
E% từ 90-105% và R2 phải đạt ≥ 0,99. Ngoài ra
tiêu chuẩn tiên quyết một đường chuẩn đạt yêu
cầu, hệ số góc của đường chuẩn phải đạt từ -3,32
đến -3,8(5). Trong quá trình làm nghiên cứu này,
chúng tôi đã tiến hành kiểm tra so sánh với
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 185
đường chuẩn của công ty Khoa Thương – Việt
Nam. Chúng tôi dùng một nồng độ là 3 x 102
trong bộ chuẩn thương mại của công ty Khoa
Thương Việt Nam để kiểm tra chất lượng đường
chuẩn. Tiến hành định lượng cùng đường
chuẩn, phản ứng được lập lại 3 lần.
Độ nhạy của phản ứng
Độ nhạy được xác định trên mẫu huyết
thanh ở người nhiễm virus viêm gan B với nồng
độ là 4,5 × 107 copies/ml.
Tiến hành quy trình Real-time PCR
Phản ứng Real-time PCR của các mẫu bệnh
phẩm luôn chạy tiến hành cùng một lúc với
đường chuẩn (mẫu chứng dương) và một mẫu
nước (mẫu chứng âm).
Phân tích số liệu
Số liệu đem đi phân tích với các test chỉ lấy
từ 33 mẫu phát hiện và định lượng được với cả
hai kỹ thuật của bộ môn và bệnh viện. Dữ liệu
được phân tích và mô tả bằng test Wilcoxon(9),
test phi tham số Spearman(9) và biểu đồ Bland và
Altman(2,3). Tất cả dữ liệu thống kê sẽ được thực
hiện bởi phần mềm SPSS 17,0 và Medcalc
11,3,0,0.
KẾT QUẢ
Từ 30/08/2009 đến 30/12/2009, có 46 bệnh
nhân đến xét nghiệm viêm gan B thỏa tiêu
chuẩn chọn mẫu được đưa vào nghiên cứu.
Chúng tôi đã phát hiện và định lượng được 34
trường hợp có mang virus viêm gan B trong cơ
thể, 12 trường hợp còn lại có kết quả âm tính.
Nhiệt độ bắt cặp của mồi
Sau khi khảo sát các phổ nhiệt độ từ 59 –
61oC, chúng tôi nhận thấy 60oC là nhiệt độ bắt
cặp thích hợp nhất.
Hình 1: Nhiệt độ bắt cặp của mồi
Khảo sát nồng độ mồi
Tại nồng độ mồi là 400 nM thì E% là 100,0%
và R2 ≥ 0,99. Vậy 400 nM là nồng độ mồi tối ưu
cho phản ứng của chúng tôi.
Hình 2: Khảo sát nồng độ mồi
Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman
200 nM là nồng độ mẫu dò tối ưu với E% là
100,0% và R2 ≥ 0,99.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 186
Hình 3: Khảo sát nồng độ mẫu dò
Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR:
Độ lập lại trong một phản ứng (intraassay)
Trị số trung bình của hai nồng độ pha loãng
10-1 và 10-3 lần lượt là 18,14 và 27,08.
Hình 4: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại
trong một phản ứng
Độ lập lại giữa các lần thí nghiệm
(interassay)
Kết quả trị số trung bình của hai nồng độ
pha loãng 10-1 và 10-3 lần lượt 18,38 và 26,61.
Hình 5: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại
giữa các lần thí nghiệm
Đường chuẩn
Kết quả giá trị virus trung bình sau 3 lần thử
nghiệm là 2,73 × 102 copies/ml, khác biệt không
đáng kể so với giá trị lý thuyết là 0,27 × 102
copies/ml. đường chuẩn mà chúng tôi xây dựng
được có R2 là 0,999 và E% là 100% và hệ số góc là
-3,58.
Hình 6: Đường chuẩn
Độ nhạy của phản ứng
Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 100
copies/ml.
Hình 7: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 187
BÀN LUẬN
Phân tích kỹ thuật
Nhiệt độ bắt cặp của mồi
Với một phổ nhiệt độ từ 59 – 61oC, chúng tôi
nhận thấy chu kỳ ngưỡng của sản phẩm khuếch
đại ở tất cả các nhiệt độ khảo sát không có sự
khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, tại nhiệt độ 60oC
sản phẩm khuếch đại có tín hiệu huỳnh quang
cao hơn so với tín hiệu huỳnh quang của sản
phẩm khuếch đại tại các nhiệt độ khác. Vì vậy,
chúng tôi chọn nhiệt độ 60oC là nhiệt độ bắt cặp
thích hợp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với
nghiên cứu trước đó(10,13).
Khảo sát nồng độ mồi
Kết quả cho thấy tại nồng độ mồi là 400 nM
thì E% và R2 nằm trong giới hạn tối ưu của phản
ứng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên
cứu trước đó(10). Như vậy 400 nM là nồng độ
mồi tối ưu.
Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman
Chúng tôi nhận thấy với các nồng độ mẫu
dò khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại với
chu kỳ ngưỡng tương tự nhau, nhưng với nồng
độ mẫu dò là 200 nM thì với E% là 100,0% và R2
≥ 0,99. Như vậy, 200 nM là nồng độ mẫu dò tối
ưu cho phản ứng Real-time PCR.
Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR
Khoảng biến thiên của giá trị trung bình
không quá 1 Ct, chứng tỏ phản ứng Real-time
PCR của chúng tôi có tính lập lại cao.
Đường chuẩn
Việc sử dụng biological standard để tạo
đường chuẩn có các lợi điểm so với dùng gam
đường chuẩn thương mai trên thị trường:
- Rẻ tiền, sản xuất được số lượng lớn.
- Dễ lưu trữ, dễ chuẩn bị.
- Chủ động được các khoảng cách về nồng
độ, không bị giới hạn.
- Có thể sử dụng hóa chất của các hãng khác
nhau.
Ở nghiên cứu này, đường chuẩn mà chúng
tôi xây dựng được có R2 là 0,999 và E% là 100%
và hệ số gốc là -3,58.
Độ nhạy của phản ứng
Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là
100 copies/ml, vì tại đó phản ứng cho tín hiệu
tốt còn ở nồng độ 50 copies/ml tín hiệu thấp
và 10 copies/ml, phản ứng không có tín hiệu
được ghi nhận.
Chất lượng của xét nghiệm
Test Wilcoxon cho thấy không có sự khác
biệt về thống kê giữa kết quả của hai kỹ thuật.
Bên cạnh đó, test phi tham số Spearman cho
thấy có mối tương quan giữa kỹ thuật Real-time
PCR của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử
trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM.
Hình 8: Biểu đồ Bland và Altman
Hơn thế nữa, biểu đồ Bland và Altman cho
chúng ta biết kết quả định lượng của
BVĐHYD theo log10 copies/ml có thể thấp hơn
0,074 nhưng cũng có thể cao hơn 0,052 so với
kết quả của bộ môn. Áp dụng vào lâm sàng,
chúng tôi thấy sự chênh nhau giữa hai kết quả
là không quá 10 copies/ml. Kế đến, chúng tôi
thấy trung bình của sự khác biệt gần giá trị 0,
phương trình y = b + ax có hệ số a và b cũng
gần với giá trị 0, nên sự khác biệt về kết quả
giữa hai kỹ thuật là gần như không đáng kể.
Vậy hai kỹ thuật này có thể thay thế cho
nhau.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 188
Tóm lại, các kết quả kể trên chứng tỏ có sự
tương đồng về mặt kỹ thuật của xét nghiệm Real-
time PCR giữa bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân
Tử trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM.
KẾT LUẬN
Định lượng nồng độ HBV – DNA trong máu
là một thông số sinh học quan trọng và cần thiết
để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu
chiều hướng phát triển của bệnh và là cơ sở để
các bác sĩ lâm sàng chỉ định và đánh giá hiệu
quả điều trị.
Nghiên cứu này đạt được kết quả như sau:
Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time
PCR:
- Nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C.
- Nồng độ mồi là 400 nM.
- Nồng độ mẫu dò Taqman là 100 nM.
- Độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml.
- Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có
R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là
đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu
cho virus viêm gan B.
- Bên cạnh đó, có 34 trường hợp trong tổng
số 46 người đến xét nghiệm, phát hiện có virus
viêm gan B và định lượng được số lượng DNA
đích ban đầu có trong cơ thể.
- Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh
viện ĐHYD TpHCM.
Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học
phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong
các lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. Qua nghiên
cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật
Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA
với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh
– Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Qua đó,
bộ môn có thể tiến hành làm thường quy xét
nghiệm này trong phát hiện, điều trị và theo dõi
bệnh nhân viêm gan B. Chúng tôi hy vọng rằng
kỹ thuật này sẽ là công cụ hỗ trợ cho những
nghiên cứu tiếp theo.
Tuy nhiên nghiên cứu vẫn không thể tránh
khỏi những hạn chế do thời gian tiến hành
tương đối ngắn và về tài chính không đủ nên số
lượng mẫu chưa đủ lớn. Chúng tôi hy vọng
trong thời gian tới sẽ có những đề tài tiếp tục
đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn và so sánh
với các phương pháp định lượng khác, ứng
dụng Real-time PCR trong việc theo dõi hiệu
quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B,
cũng như ứng dụng đường chuẩn tự dựng này
với những bộ Kit khác giúp giảm giá thành của
xét nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. AASLD. "American Association for the Study of Liver Diseases".
Available from:
2. Bland J M, Altman D G. (1995): "Comparing methods of
measurement: why plotting difference against standard method
is misleading. Lancet". 346(8982):1085-7.
3. Bland J M, Altman D G. (1986): "Statistical methods for assessing
agreement between two methods of clinical measurement.
Lancet".1(8476):307-10.
4. Bustin S A. (2002): "Quantification of mRNA using real-time
reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol
Endocrinol".29(1):23-39.
5. Đỗ Đình Hồ, Đỗ Như Hiền. (2006): "Giáo trình Sinh Học Phân Tử
(trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch)".
6. Gurtsevitch V E. (2008): "Human oncogenic viruses: hepatitis B
and hepatitis C viruses and their role in hepatocarcinogenesis.
Biochemistry (Mosc)". 73(5):504-13.
7. Hendricks D A, Stowe B J, Hoo B S, Kolberg J, Irvine B D,
Neuwald P D, et al. (1995): "Quantitation of HBV DNA in
human serum using a branched DNA (bDNA) signal
amplification assay. Am J Clin Pathol". 104(5):537-46.
8. Huy T T, Ushijima H, Win K M, Luengrojanakul P, Shrestha P
K, Zhong Z H, et al. (2003): "High prevalence of hepatitis B virus
pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship
with genotype and chronicity. J Clin Microbiol".41(12):5449-55.
9. Konnick E Q, Erali M, Ashwood E R, Hillyard D R. (2005):
"Evaluation of the COBAS amplicor HBV monitor assay and
comparison with the ultrasensitive HBV hybrid capture 2 assay
for quantification of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol".
43(2):596-603.
10. Ngô Như Hòa, Lê Trường Giang. (1997): "Thống Kê Y Học".
11. Pas S D, Fries E, De Man R A, Osterhaus A D, Niesters H G.
(2000): "Development of a quantitative real-time detection assay
for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial
assays. J Clin Microbiol".38(8):2897-901.
12. Pawlotsky J M. (2003): "Hepatitis B virus (HBV) DNA assays
(methods and practical use) and viral kinetics. J Hepatol". 39
Suppl 1:S31-5.
13. Payungporn S, Tangkijvanich P, Jantaradsamee P,
Theamboonlers A, Poovorawan Y. (2004): "Simultaneous
quantitation and genotyping of hepatitis B virus by real-time
PCR and melting curve analysis. J Virol Methods".120(2):131-40.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 189
14. Phạm Hùng Vân. (2009): "PCR và Real-time PCR Các vấn đề cơ
bản và các áp dụng thường gặp".
15. Sitnik R, Paes A, Mangueira C P, Pinho J R. (2010): "A real-time
quantitative assay for hepatitis B DNA virus (HBV) developed to
detect all HBV genotypes. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo".52(3):119-24.
16. WHO. World Health Organization. Available from:
/en/index.html.
17. Zhao J R, Bai Y J, Zhang Q H, Wan Y, Li D, Yan X J.(2005):
"Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using
TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol".
11(4):508-10.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- phat_hien_va_dinh_luong_hepatitis_b_virus_dna_bang_ky_thuat.pdf