Phương pháp HPLC

Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế HPLC là ch  vi t t t c a 04 ch  cái   u b ng ti ng ữ ế ắ ủ ữ đầ ằ ế Anh c a ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao ( High ủ ươ ắ ỏ ệ ă Perform ance Liquid Chrom atography) ,tr c kia g i là ướ ọ ph ng pháp s c ký l ng cao áp (High Pressure Liquid ươ ắ ỏ Chrom atography) Ph ng pháp này ra  i t  n m  1967­1968 trên c  ươ đờ ừ ă ơ s  phát tri n và c i ti n t  ph ng pháp s c ký c t c  ở ể ả ế ừ ươ ắ ộ ổ i n . Hi n nay ph ng pháp HPLC ngày càng phát tri n đ ể ệ ươ ể và hi n  i hoá cao nh  s  phát tri n nhanh chóng c a ệ đạ ờ ự ể ủ ngành ch  t o m áy phân tích .Hi n nay nó áp d ng r t ế ạ ệ ụ ấ l n trong nhi u nghành ki m  nghi m   c bi t là  ng ớ ề ể ệ đặ ệ ứ d ng cho nghành ki m  nghi m   Thu c . Và nó hi n là ụ ể ệ ố ệ công c   c l c trong phân tích các thu c  a thành ph n ụ đắ ự ố đ ầ cho phép  nh tính và  nh l ng .đị đị ượ Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế 1 ­ Khái ni m  ệ : S cắ  ký l ng hi u n ng cao là m t ph ng pháp ỏ ệ ă ộ ươ chia tách trong  ó pha  ng là châït l ng và pha tnh ch a trong đ độ ỏ ĩ ứ c t là  ch t  r n  ã  c phân chia d i d ng ti u phân ho c m t ộ ấ ắ đ đượ ướ ạ ể ặ ộ ch t l ng ph  lên m t ch t m ang r n ,hay m t ch t m ang  ã ấ ỏ ủ ộ ấ ắ ộ ấ đ c bi n  i b ng liên k t hoá h c v i các nhóm  ch c h u c  đượ ế đổ ằ ế ọ ớ ứ ữ ơ .Quá trình s c ký l ng d a trên c  ch  h p ph ,phân b  ,trao  i ắ ỏ ự ơ ế ấ ụ ố đổ Ion hay phân lo i theo kích c  ( Rây phân t  ) . ạ ỡ ử 2­ Nguyên t c c a quá trình s c ký trong c t : ắ ủ ắ ộ Pha tnh là m t y u t  quan tr ng quy t  nh b n ch t c a quá ĩ ộ ế ố ọ ế đị ả ấ ủ trình s c ký  và l ai s c ký . ắ ọ ắ N u pha tnh là ch t h p ph  thì ta có S c ký h p ph  pha ế ĩ ấ ấ ụ ắ ấ ụ thu n ho c pha  o . ậ ặ đả          N u pha tnh là ch t trao  i Ion  thì ta có S c ký trao  i ion ế ĩ ấ đổ ắ đổ  . N u pha tnh là ch t L ng thì ta có S c ký phân b  hay s c ế ĩ ấ ỏ ắ ố ắ ký chi t . ế Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế   N u pha tnh là G el thì ta có S c ký Gel hay Rây phân t   .ế ĩ ắ ử Cùng v i pha tnh   r a r i ch t phân tích ra kh i c t ớ ĩ để ử ả ấ ỏ ộ ,chúng ta c n có m t pha  üng . ầ ộ độ Nh  v y n u chúng ta n p m u phân tích g m  h n h p ch t ư ậ ế ạ ẫ ồ ỗ ợ ấ phân tích A,B,C .. Vào c t phân tích ,k t qu  các ch t A,B,C.. S  ộ ế ả ấ ẽ c tách ra kh i nhau sau khi  i qua c t .Q uy t  nh hi u qu  đượ ỏ đ ộ ế đị ệ ả c a s  tách s c ký    ây là t ng h p các t ng tác . ủ ự ắ ở đ ổ ợ ươ Cháút phán têch A  +B+C Pha ténh Pha âäüng F2 F3 F1 Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế T ng c a 03 t ng tác này s  quy t  nh ch t nào ổ ủ ươ ẽ ế đị ấ c r a r i ra kh i c t tr c tiên khi l c l u gi  trên đượ ử ả ỏ ộ ướ ự ư ữ c t là nh  nh t  ( F1) .và ng c l i . ộ ỏ ấ ượ ạ i v i m i ch t ,s  l u gi   c qui  nh b i 03 Đố ớ ỗ ấ ự ư ữ đượ đị ở l c  F1,F2,F3 .Trong  ó F1 và F2 gi  vai trò quy t ự đ ữ ế nh .còn F3 là y u t   nh h ng không l n . đị ế ố ả ưở ớ   ây F1 là l c gi  ch t phân tích trên c t .F2 là Ở đ ự ữ ấ ộ l c kéo c a pha  ng  i v i ch t phân tích ra kh i c t ự ủ độ đố ớ ấ ỏ ộ .  Nh  v y v i các ch t khác nhau thì F1 và F2 là ư ậ ớ ấ khác nhau ,K t qu  là các ch t khác nhau s  di chuy n ế ả ấ ẽ ể trong c t v i t c   khác nhau và tách ra kh i nhau  khi ộ ớ ố độ ỏ ra kh i c t .    ( nh  hình d i  ây )ỏ ộ ư ướ đ   Ph n I : C  s  lý thuy t :ầ ơ ở ế Ph n m inh ho  quá trình tách các ch t A và B ầ ạ ấ trong c t tách s c ký ộ ắ Th i gian ờ A B Pha  ngđộ Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế 3 ­ Phân lo i s c ký :ạ ắ Theo c  ch  tách s c ký ng i ta phân loaüi nh  sau : ơ ế ắ ườ ư 3.1 S c ký h p ph  :  ắ ấ ụ Quá trình s c ký d a trên s  h p ph  m nh ,y u khác nhau c a ắ ự ự ấ ụ ạ ế ủ pha tnh  i v i các ch t tan và s  r a gi i ( ph n h p ph  ) c a ĩ đố ớ ấ ự ử ả ả ấ ụ ủ pha  ng   kéo ch t tan ra kh i c t .S  tách m t h n h p ph  độ để ấ ỏ ộ ự ộ ỗ ợ ụ thu c vào  tính ch t  ng h c c a ch t h p ph  . Trong tr ng ộ ấ độ ọ ủ ấ ấ ụ ườ lo i này có 02 lo i h p ph  :ạ ạ ấ ụ + S c ký h p ph  pha thu n ( NP ­ HPLC) :  Pha tnh phân c c ắ ấ ụ ậ ĩ ự ,pha  ng không phân c c .độ ự + S c ký h p ph  pha  o (RP ­ HPLC) :  Pha tnh không phân ắ ấ ụ đả ĩ c c ,pha  ng phân c c .ự độ ự     Lo i s c ký này  c áp d ng r t thành công   tách các h n ạ ắ đượ ụ ấ để ỗ h p các ch t có tính ch t g n t ng t  nhau và thu c lo i không ợ ấ ấ ầ ươ ự ộ ạ phân c c,phân c c y u hay trung bình nh  các Vitam in,thu c h  ự ự ế ư ố ạ nhi t gi m   au ....ệ ả đ   Hi n nay chúng ta  ang s  d ng ch  có lo i s c ký này m à ệ đ ử ụ ỉ ạ ắ thôi. Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế Ch  y u hi n nay chúng ta s  d ng l ai s c ký h p ủ ế ệ ử ụ ọ ắ ấ ph  pha  o ( RP )ụ đả Trong d c  i n USP khi chúng ta tra c u c t có ượ đ ể ứ ộ giá tr t ng  ng nh  sau :ị ươ ứ ư L1  : RP 18     Kích th c h t t ng  ng t  5 ­ 10 ướ ạ ươ ứ ừ µm   L7  : RP 8       Kích th c h t t ng  ng t  5 ­ 10 ướ ạ ươ ứ ừ µm   L3  : Si 60       Kích th c h t t ng  ng t  5 ­ 10 ướ ạ ươ ứ ừ µm        Và còn m t s  lo i c t khác nh  c t Diol , C t NHộ ố ạ ộ ư ộ ộ 2 ,CN  . . vv  Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế 4  ­   Các  i l ng  c tr ng  c a s c ký   đạ ượ đặ ư ủ ắ đồ K t qu  c a quá trinh tách các ch t  c Detector ế ả ủ ấ đượ phát hi n ghi thành s c ký    nh  hình trên ệ ắ đồ ư Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế to t’r2 t’r1 tr1 tr2 To : Th i gian l u ch t ờ ư ế t’r1 : Th i gian l u th c ch t ờ ư ự ấ A t’r2 : Th i gian l u th c ch t ờ ư ự ấ B tr1 : Th i gian l u ch t Aờ ư ấ tr2 : Th i gian l u ch t Bờ ư ấ Ph n I : C  s  lý thuy t ầ ơ ở ế T  các thông s  c a các peak trên  ây ,nhi u  i l ng  c ừ ố ủ đ ề đạ ượ đặ tr ng v  lý thuy t  c  a ra   ư ề ế đượ đư để dánh giá m t quá trình s c ộ ắ ký .D i  ây là m t s   i l ng th ng dùng trong th c t  ướ đ ộ ố đạ ượ ườ ự ế và cách thay  i các  i l ng này có l iü cho quá trình phân đổ đạ ượ ơ tích s c ký.ắ 4.1 Th i gian l u th c t’r : Retention tim e ờ ư ự   Th i gian l u c a m t ch t là th i gian tính t  khi b m  m u ờ ư ủ ộ ấ ờ ừ ơ ẫ vào c t cho  n khi ch t  ó ra kh i c t  t giá tr c c  i. ộ đế ấ đ ỏ ộ đạ ị ự đạ Th i gian l u c a m i ch t là h ng  nh và các ch t khác nhau ờ ư ủ ỗ ấ ằ đị ấ thì th i gian l u s  khác nhau trên cùng m t  i u ki n s c ký ờ ư ẽ ộ đề ệ ắ ã ch n .Vì v y th i gian l u là  i l ng   phát hi n  nh đ ọ ậ ờ ư đạ ượ để ệ đị tính các ch t.ấ Th i gian l u ph  thu c vào các y u t  : ờ ư ụ ộ ế ố + B n ch t s c ký c a pha tnh.ả ấ ắ ủ ĩ + B n ch t ,thành ph n,t c   c a pha  ng ả ấ ầ ố độ ủ độ + C u t o và b n ch t phân t  c a ch t tanấ ạ ả ấ ử ủ ấ + Trong m t s  tr ng h p th i gian l u còn ph  thuộ ố ườ ợ ờ ư ụ ộc vào  pH c a pha  ng .ủ độ Trong m t phép phân tích n u trộ ế  nh  quá thì s  tách kém  ,còn n u ỏ ự ế tr  quá l n thì peak b  doãng và   l p l i c a Peak r t kém  ,th i ớ ị độ ặ ạ ủ ấ ờ gian phân tích r t dài  ng th i kéo theo nhi u v n   khác nh  ấ đồ ờ ề ấ đề ư hao t n dung m ôi,hoá ch t,   chính xác c a phép phân tích kém .ố ấ độ ủ  thay  i th i gian l u chúng ta d a vào các y u t  trên  ã trình Để đổ ờ ư ự ế ố đ bày . 4.2 H  s  dung l ng K’ :ệ ố ượ   Capacity Factor    H  s  dung l ng c a m t ch t cho bi t kh  n ng phân b  c a ệ ố ượ ủ ộ ấ ế ả ă ố ủ ch t  ó trong hai pha c ng v i s c ch a c t t c là t  s  gi a ấ đ ộ ớ ứ ứ ộ ứ ỷ ố ữ l ng ch t tan trong pha tnh và l ng ch t tan trong pha  ng   ượ ấ ĩ ượ ấ độ ở trong th i  i m  cân b ng .ờ đ ể ằ K’ =  ( tR ­ t0)/ t0       N u K’ế   nh  thì tR c ng nh  và s  tách kém  . N u K’ỏ ũ ỏ ự ế    l n thì Peak b  doãng . Trong th c t  K’ớ ị ự ế   t  1­ 5 là t i  u ừ ố ư . Ph n I : C  s  lý ầ ơ ở thuy tế 4.3 ­   ch n l c Độ ọ ọ α :      ch n l c Độ ọ ọ α cho bi t hi u qu  tách c a h  th ng s c ế ệ ả ủ ệ ố ắ ký ,khi 02 ch t A ,B có K’Aấ   và K’B khác  nhau thì m i ớ có kh  n ng tách .,m c   tách bi u th      ch n l c ả ă ứ độ ể ị ở Độ ọ ọ α  .  α  =  K’B  / K’A     V i  i u ki n K’B  > K’Aớ đề ệ    v i  ớ α càng khác 1 thì kh  n ng tách càng rõ ràngả ă α= 1.02 α= 1.16 α= 1.20 Ph n I : C  s  lý ầ ơ ở thuy tế   4.2 S   a lý thuy t  N:ố đĩ ế   S   a lý thuy t là  i l ng bi u th  hi u n ng c a c t trong m t ố đĩ ế đạ ượ ể ị ệ ă ủ ộ ộ i u ki n s c ký nh t  nh .M i  a lý thuy t trong c t s c ký đ ề ệ ắ ấ đị ỗ đĩ ế ộ ă gi ng nh   là m t l p pha tnh có chi u cao là H ,T t nhiên l p ố ư ộ ớ ĩ ề ấ ớ này có tính ch t  ng  t c là m t khu v c c a h  phân tách m à ấ độ ứ ộ ự ủ ệ trong  ó m t cân b ng nhi t  ng  h c  c thi t l p gi a n ìng đ ộ ằ ệ độ ọ đượ ế ậ ữ ồ  trung bình c a ch t tan trong pha tnh và pha  ng .độ ủ ấ ĩ độ B  dày H ph  thu c vào nhi u y u t  : ề ụ ộ ề ế ố +  ng kính và   h p ph  c a h t pha tnh Đườ độ ấ ụ ủ ạ ĩ + T c   và   nh t (   phân c c )c a pha  ng ố độ độ ớ độ ự ủ độ + H  s  khuy ch tán c a các ch t  trong c t .ệ ố ế ủ ấ ộ Vì v y v i m t  i u kiên s c ký xác  nh thì chi u cao H ậ ớ ộ đ ề ắ đị ề c ng h ng  nh  i v i m t ch t phân tích  và s   a lý thuy t c a ũ ằ đị đố ớ ộ ấ ố đĩ ế ủ c t c ng  c xác  nh.ộ ũ đượ đị Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế   4.2 S   a lý thuy t  N:ố đĩ ế   S   a lý thuy t N  c tính theo công th c sau : ố đĩ ế đượ ứ    N = 5,54 ( tR / W 0,5)2   Trong  ó :   tRđ       :  Th i gian l u c a ch t phân ờ ư ủ ấ tích .          W 0,5 :   r ng t i  i m  1/2 c a Peak .Độ ộ ạ đ ể ủ  Trong th c t  N n m  trong kho ng 2500  n 5500 là v a ự ế ằ ả đế ừ  .đủ Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế 4.3   phân gi i R : ( Resolution )Độ ả      phân gi i là  i l ng bi u th    tách c a các ch t ra kh i Độ ả đạ ượ ể ị độ ủ ấ ỏ nhau  trên m t  i u ki n s c ký   ã cho.   phân gi i c a 02 ộ đ ề ệ ắ đ Độ ả ủ Peak c nh nhau ph i  c tính theo công th c sau :ạ ả đượ ứ R= 2( t’RB ­ t’RA)/ (wa + wB) Trong th c t  n u các Peak cân  i ( Gass) thì   phân gi i ự ế ế đố độ ả t i thi u   02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép  nh l ng R=1,5 ố ể để đị ượ là phù h p ợ + N u R nh  thì các Peak ch a tách h n ,vi c tính toán di n tích ế ỏ ư ẳ ệ ệ Peak s  không chính xác ,lúc này ph i tìm  cách t ng R theo 03 ẽ ả ă cách sau: * Làm  thay  i K’ b ng cách thay  i l c r a gi i c a pha đổ ằ đổ ự ử ả ủ ng ( Thay  i    phân c c n u là RP ­  HPLC ,thay  ôíi c ng độ đổ độ ự ế đ ườ  ion n u là IE ­  HPLC ....)  độ ế * Làm  t ng s   a lý thuy t c a c t b ng cách dùng c t dài ă ố đĩ ế ủ ộ ằ ộ h n ho c c t có kích th c nh  h n . ơ ặ ộ ướ ỏ ơ Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế 4.3   phân gi i R : ( Resolution )Độ ả     * Làm  t ng   ch n l c ă độ ọ ọ α b ng cách dùng c t khác phù h p ằ ộ ợ h n v i quá trình tách ho c thay  i thành ph n pha  ng .ơ ớ ặ đổ ầ độ          + N u R l n quá thì th i gian phân tích s  lâu,t n nhi u pha ế ớ ờ ẽ ố ề ng ,  nh y s  kém .   kh c ph c  ta có th  thay  i h  pha độ độ ạ ẽ Để ắ ụ ể đổ ệ ng hay dùng ch ng trình Gradient dung m ôi . Tuy nhiên trong độ ươ quá trình ch y s c ký dùng ch ng trình dung m ôi thì m t s  pha ạ ắ ươ ộ ố ng có t  l  thay  i s  kéo theo s  thay  i  ng n n làm   nh độ ỷ ệ đổ ẽ ự đổ đườ ề ả h ng r t l n  n th i gian l u và di n tích c a các Peak ta phân ưở ấ ớ đế ờ ư ệ ủ tích . Trong th c t  nên h n ch  s  d ng ch ng trình Gradient ự ế ạ ế ử ụ ươ dung m ôi m à ch  y u là chúng ta ph i tìm   c h  pha  ng r a ủ ế ả đượ ệ độ ử gi i phù h p,  áp  ng các yêu c u trong quá trình phân tích .ả ợ đ ứ ầ Ph n I : C  s  lý ầ ơ ở thuy tế 4.4 H  s  không  i x ng T : ( Tailing factor)ệ ố đố ứ     H  s  không  i x ng T cho bi t m c   không  i x ng c a ệ ố đố ứ ế ứ độ đố ứ ủ Peak trên s c ký   thu  c .ắ đồ đượ T  c tính b ng t  s    r ng c a 02 n a Peak t i  i m  đượ ằ ỷ ố độ ộ ủ ử ạ đ ể 1/10 chi u cao Peak : ề  Peak d ng  ôïi x ng hình Gauss trên th c t  khó  t  c vì v y ạ đ ứ ự ế đạ đượ ậ ph i quan tâm   n h  s  không  i x ng T, ả đế ệ ố đố ứ ba T = a/b Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế 4.4H  s  không  i x ng T : ( Tailing factor)ệ ố đố ứ     * Khi T ≤  2.5 thì phép  nh l ng  c ch p nh n đị ượ đượ ấ ậ * Khi T > 2.5 thì   i m  cu i c a Peak r t khó xác đ ể ố ủ ấ nh ,vì v y phép  nh l ng c n ph i thay  i các đị ậ đị ượ ầ ả đổ i u ki n s c ký   làm  cho Peack cân  i h n theo đ ề ệ ắ để đố ơ các cách sau :  + Làm  gi m  th  tích ch t t c là  oaün n i t  c t ả ể ế ứ đ ố ừ ộ êïn Detector .đ + Thay  i thành ph n pha  ng sao cho kh  n ng đổ ầ độ ả ă r a gi i t ng lên ử ả ă + G i m  b t l ng m u  a vào c t  b ng cách ả ớ ượ ẫ đư ộ ằ pha loãng m u hay gi m  th  tích tiêm  m u .ẫ ả ể ẫ   Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế 5  Phân lo i s c ký và  ng d ng :ạ ắ ứ ụ + Theo c  ch  chia tách c a s c ký ,ng i ta phân ra các lo i sau ơ ế ủ ắ ườ ạ ây :đ S c ký h p ph  ( NP ­  HPLC và RP  ­  HPLC); s c ký phân b  ­  s c ắ ấ ụ ắ ố ắ ký chi t ( LLC); s c ký trao  i ion ( IE  ­  HPLC) ;  s c ký rây phân ế ắ đổ ắ t  ­  s c ký gel ( IG  ­  HPLC) .Nh ng th c t  hiên nay chúng ta ử ắ ư ự ế hi n ch   ang  ng d ng s c ký h p ph  vào phân tích m u .ệ ỉ đ ứ ụ ắ ấ ụ ẫ 5.1 S c ký h p ph  : ắ ấ ụ    * Quá trình s c ký d a trên s  h p ph  m nh y u khác nhau c a ắ ự ự ấ ụ ạ ế ủ pha tnh  i v i các ch t tan và s  r a gi i (ph n h p ph ) cu  ĩ đố ớ ấ ự ử ả ả ấ ụ ả pha  ng   kéo ch t tan ra kh i c t .S  tách m t h n h p ph  độ để ấ ỏ ộ ự ộ ỗ ợ ụ thu c vào tính ch t  ng h c c a ch t h p ph  .Trong lo i này có ộ ấ độ ọ ủ ấ ấ ụ ạ 02 ki u ể h p ph :ấ ụ Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế + S c ký h p ph  pha thu n (NP­HPLC): Pha ắ ấ ụ ậ tnh phân c c ,pha  ng không phân c c .ĩ ự độ ự + S c ký h p ph  pha  o ( RP ­ HPLC): Pha ắ ấ ụ đả tnh không phân c c pha  ng phân c c .ĩ ự độ ự Lo i s c ký này  c áp d ng r t r ng rãi ạ ắ đượ ụ ấ ộ ,thành công   tách các h n h p các ch t có tính để ỗ ợ ấ ch t g n t ng t  nhau và thu c lo i không phân ấ ầ ươ ự ộ ạ c c ,phân c c y u hay trung bình nh  các Vitam in, ự ự ế ư các thu c h  hi t gi m   au .......ố ạ ệ ả đ Ph n I : C  s  lý thuy tầ ơ ở ế I­ M áy HP:C g m  các b  ph n c  b n  c tóm  t t trên s  ồ ộ ậ ơ ả đượ ắ ơ đồ sau  :  Degasse Pump Tiím m uẫ Column Detector Ph n II : Hầ th ng HPLCệ ố Trong  ó : đ 1­ Bình ch a dung m ôi pha  üng ứ độ 2­ B  ph n kh  khí ộ ậ ử 3­ B m  cao áp ơ 4­B  ph n tiêm  m u ( b ng tay hay Autosam ple)ộ ậ ẫ ằ 5­C t s c ký ( Pha tnh ) (   ngòai m ôi tr ng hay trong b   i u ộ ắ ĩ để ườ ộ đ ề nhi t )ệ 6­ Detector ( nh n tín hi u )ậ ệ 7­H  th ng m áy tính g n ph n m m  nh n,tín hi u và s  lý d  li u ệ ố ắ ầ ề ậ ệ ử ữ ệ và  i u khi n h  th ng HPLC.đ ề ể ệ ố 8­ In d  li u .ữ ệ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố II.1 ­ Bình  ng dung m ôiđự ­ Hi n t i m áy HPLC th ng  có 04  ng dung ệ ạ ườ đườ m ôi vào  u b m  cao áp .Cho phép chúng ta s  d ng 04 đầ ơ ử ụ bình ch a dung m ôi cùng 1 l n   r aó gi i theo t  l  ứ ầ để ư ả ỷ ệ m ong m u n và t ng t  l  dung m ôi c a 04  ng là 100 ố ổ ỷ ệ ủ đườ %  . Tuy nhiên theo kinh nghi m  thì chúng ta ít khi s  ệ ử d ng 04  ng dung m ôi cùng m t lúc m à chúng ta chi ụ đườ ộ s  d ng t i  a là 03và 02  ng   cho h  pha  ng ử ụ ố đ đườ để ệ độ luôn  c pha tr n  ng nh t h n,h  pha  üng  n đượ ộ đồ ấ ơ ệ độ đơ gi n h n   quá trình r a gi i  n  nh .ả ơ để ử ả ổ đị Hi n 04  ng dung m ôi ph c v  ch  y u cho ệ đườ ụ ụ ủ ế vi c r a gi i G radial dung m ôi theo th i gian và công tác ệ ử ả ờ xây d ng tiêu chu n .ự ẩ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố L u ý : ­ T t c  các dung m ôi dùng ư ấ ả cho HPLC  u ph i là dung m ôi tinh đề ả khi t và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho ế HPLC Hay dung m ôi tinh khi t phân tích .ế ­ T t c  các hóa ch t dùng   pha ấ ả ấ để m u và pha h   m  ph i  c s  d ng ẫ ệ đệ ả đượ ử ụ là hóa ch t ấ tinh khi tế  phân tích .   Nh m  m c  ích tránh h ng c t s c ký ằ ụ đ ỏ ộ ắ hay nhi u  ng n n,t o ra các Peak ễ đườ ề ạ t p trong quá trình phân tích .ạ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố  II.2 B  kh  khí  Degasse :ộ ử   M c  ích c a b  kh  khí nh m  lo i tr  các b t ụ đ ủ ộ ử ằ ạ ừ ọ nh  còn sót l i trong dung m ôi pha  ng  .ỏ ạ độ Nêïu nh  trong quá trình phân tích m à dung m ôi ư pha  ng còn sót các b t khí thì m t s  hi n t ng sau độ ọ ộ ố ệ ượ ây s  s y ra đ ẽ ả ­ T  l  pha  ng c a các  ng ỷ ệ độ ủ đườ dung m ôi l y không  úng s  làm  cho th i gian l u c a ấ đ ẽ ờ ư ủ Peak thay  i .đổ ­ Trong tr ng h p b t quá nhi u B  kh  khí ườ ợ ọ ề ộ ử không th  lo i tr  h t  c thì có th  Pum p s  không hút ể ạ ừ ế đượ ể ẽ c dung m ôi  (B  e) khi  ó áp su t không lên và m áy đượ ị đ ấ s c ký s  ng ng ho t  ng .ắ ẽ ừ ạ độ Trong b t c  tr ng h p nào nêu trên c ng cho k t qu  ấ ứ ườ ợ ũ ế ả phân tích sai . Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố II.3­ Pum p Cao áp :  ­ M c  ích   b m  pha  ng vào c t th c hi n quá ụ đ để ơ độ ộ ự ệ trình chia tách s c ký .Pum p ph i t o  c áp su t cao ắ ả ạ đượ ấ kho ng 3000­6000 PSI ho c 250 at  n ­ 500 at ( 1at ả ặ đế =0.98 Bar) và pum p  ph i t o dòng liên t c .L u l ng ả ạ ụ ư ượ b m  t  0.1  n 9.999 m l/phút .(hi n nay  ã có nhi u ơ ừ đế ệ đ ề lo i Pum p có áp su t r t cao lên  n 1200 bar)ạ ấ ấ đế ­ M áy s c ký l ng c a chúng ta hi n nay th ng có áp ắ ỏ ủ ệ ườ su t tôïi  a 412 Bar. T c   dòng 0.1­9.999 m l/phútấ đ ố độ  . ­ T c   b m  là h ng  nh theo thông s   ã  c cài ố độ ơ ằ đị ố đ đượ t . Hi n t i b m   có 2 đặ ệ ạ ơ Pistone   thay phiên nhau  y để đẩ dung m ôi liên t c .ụ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố II.4 B  ph n tiêm  m u ( injection):ộ ậ ẫ   êØ  a m u vào c t phân tích theo ph ng pháp Đ đư ẫ ộ ươ không ng ng dòng ch y  . V i dung tích c a loop là 5 ­  ừ ả ớ ủ 100µl . Có  02 cách l y m u vào trong c t : B ng tiêm  ấ ẫ ộ ằ m u th  công( tiêm  b ng tay ) và tiêm  m u t  ẫ ủ ằ ẫ ự ng( Autosam ple) .độ II.5 C t s c ký :ộ ắ C t ch a pha tnh  c coi là trái tim  c a h  th ng ộ ứ ĩ đượ ủ ệ ố s c ký l ng hi u n ng cao .ắ ỏ ệ ă ­ C t pha tnh thông th ng làm  b ng thép không r ộ ĩ ườ ằ ỉ ,chi u dài c t kho ng 10 ­30cm  , ng kính trong 1­ề ộ ả đườ 10m m  ,h t ch t nh i c  ạ ấ ồ ỡ φ = 5­10 µm .(ngoài ra còn có  m t s  tr ng h p  c bi t v  kích th c và kích c  ộ ố ườ ợ đặ ệ ề ướ ỡ h t....)ạ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố   ­V i ch t nh i c t c  ớ ấ ồ ộ ỡ φ = 1.8 ­5 µm  có th  dùng ể c t ng n    ( 3­10 cm  ) và nh  (  ng kính trong 1­4.6 ộ ắ ỏ đườ m m )lo i c t na  có hi u n ng tách cao.ạ ộ ỳ ệ ă ­ Ch t nh i c t tùy theo l ai c t  và ki u s c ký ấ ồ ộ ọ ộ ể ắ ( trong các d c  i n USP 23 ,24 có tiêu chu n hóa ượ đ ể ẩ các l ai c t ) ọ ộ ­ Thông th ng ch t nh i c t là Silicagel (pha ườ ấ ồ ộ thu n)ậ      ho c là Silicagel  ã  c Silan hóa ho c  c bao ặ đ đượ ặ đượ m t l p m ng h u c  ( pha  o ) ,ngoài ra ng i ta ộ ớ ỏ ữ ơ đả ườ còng dùng các lo i h t khác nh  :Nhôm  O xit,Polym e ạ ạ ư x p ,ch t trao  i ion.ố ấ đổ *  i v i m t s  ph ng pháp phân tích  òi h i ph i có Đố ớ ộ ố ươ đ ỏ ả nhi t   cao ho c th p h n nhi t   phòng thì c t ệ độ ặ ấ ơ ệ độ ộ c  t trong b  ph n  i u nhi t  (Oven colum n)đượ đặ ộ ậ đ ề ệ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố II.6 ­ Detector : ­ Là b  ph n Phát hi n các ch t khi chúng ra kh i ộ ậ ệ ấ ỏ c t và cho các tín hi u ghi trên s c ký     có th  ộ ệ ă đồ để ể nh tính và  nh l ng .Tùy theo tính ch t c a các đị đị ượ ấ ủ ch t c n phân tích m à ng i ta s  d ng loaüi Detector ấ ầ ườ ử ụ thích h p và ph i tho  m ãn  i u ki n trong m t vùng ợ ả ả đề ệ ộ n ng   nh t  nh c a ch t phân tích ồ độ ấ đị ủ ấ  A=k.C Trong : A là tín hi u  o  cệ đ đượ C N ng   ch t phân tích ồ độ ấ k là h ng s  th c nghi m  c a Detector  ã ằ ố ự ệ ủ đ ch n ọ Tín hi u này có th  là :   h p th  quang ; C ng   ệ ể độ ấ ụ ườ độ phát x  ,c ng    i n  th  ,  d n  i n ;  d n nhi t ạ ườ độ đ ệ ế độ ẫ đ ệ độ ẫ ệ ;chi t su t ..ế ấ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố   Trên c  s   ó ng i ta ch  t o các l ai Detector ơ ở đ ườ ế ạ ọ sau :  + Detector quang ph  t  ngo i 200 ­ 380 nm    phát ổ ử ạ để hi n UVệ +  Detector quang ph  t  ngo i kh  ki n ( UV ­   VIS): ổ ử ạ ả ế 190 ­ 900 nm    phát hi n các ch t h p th  quang để ệ ấ ấ ụ . ây là lo i thông d ng nh tđ ạ ụ ấ   +Detector hu nh quang  êí phát hi n các ch t h u c  ỳ đ ệ ấ ữ ơ phát hu nh quang t  nhiên c ng nh  các d n ch t có ỳ ự ũ ư ẫ ấ hu nh quang .Là lo i Detector có   ch n l c cao ỳ ạ độ ọ ọ nh t .ấ +Lo i hi n  i  i h n có Detector Diod Array  ,ELSD ạ ệ đạ đạ ơ (Detector tán x  bay h i ) các Detector này có kh  ạ ơ ả n ng quét ch ng ph     nh tính các ch t theo   ă ồ ổ để đị ấ độ h p thu c c  i c a các ch t .ấ ự đạ ủ ấ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố   ­ Ngoài ra còn có m t s  lo i Detector khác là : ộ ố ạ + Detector  i n hóa  :  o dòng ,c c ph  ,  d n đ ệ Đ ự ổ độ ẫ , i n l ng ..)đ ệ ượ + DetectorChi t su t vi sai : Detector khúc x  ế ấ ạ ( thông th ng dùng cho  o các ch t  ng )ườ đ ấ đườ + Detector  o   d n nhi t ,hi u  ng nhi t ..đ độ ẫ ệ ệ ứ ệ II.6 ­ B  ph n ghi tín hi u ộ ậ ệ     ­   ghi tín hi u phát hi n do Detector truy n sang .Để ệ ệ ề    + Trong các m áy th  h  c  thì s  d ng m áy ghi ế ệ ũ ử ụ n gi n có th  v  s c ký  ,th i gian l u,di n tích đơ ả ể ẽ ắ đồ ờ ư ệ c a Peak ,chi u cao ..ủ ề Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố + Các m áy th  h  m i  u dùng ph n m m  ch y ế ệ ớ đề ầ ề ạ trên m áy tính nó có th  l u t t c  các thông s ,ph    ể ư ấ ả ố ổ đồ và các thông s  c a Peak nh  tính  i x ng,h  s  ố ủ ư đố ứ ệ ố phân gi i .... trong quá trình phân tích  ng th i s  lý ả đồ ờ ử ,tính toán các thông s  theo yêu c u c a ng i s  ố ầ ủ ườ ử d ng nh  : N ng  ,RSD, ...ụ ư ồ độ II.7 In k t qu  :ế ả + Sau khi  ã phân tích xong các m u ta s  in k t đ ẫ ẽ ế qu  do ph n m m  tính toán ra gi y   hoàn thi n h  ả ầ ề ấ để ệ ồ s  . ơ Ph n II: H th ng HPLC ầ ệ ố Ph n III : ầ CH N  I U KI N S C KÝỌ ĐỀ Ệ Ắ M u n có m t k t qu  táh t t nh t ta ph i tìm   c các ố ộ ế ả ố ấ ả đượ i u ki n s c ký t t nh t cho m t h n h p m u ; Các đ ề ệ ắ ố ấ ộ ỗ ợ ẫ i u ki n  ó bao g m  :đ ề ệ đ ồ Pha tnh : ĩ ­ Lo i pha tnh ạ ĩ ­ Kích th c c t ướ ộ Pha  ng : độ Thành ph n và t  l  ,pH , t c   dòng, nhi t ầ ỷ ệ ố độ ệ  ... N u là ch ng trình r a gi i Isocraticđộ ế ươ ử ả  Thành ph n và t  l  ,pH , t c   dòng, ầ ỷ ệ ố độ nhi t   và ch ng trình dung m ôi ... N u là ch ng ệ độ ươ ế ươ trình r a gi i Gradient.ử ả H  th ng trang b :ệ ố ị ­ Lo i Detector:ạ ­ Van tiêm  m u,th  tích tiêm  ẫ ể ­ H   ng d n ệ đườ ẫ Các y u t  khácế ố  : nhi t   ,  nh y c a detector ệ độ độ ạ ủ b c sóng phân tích ướ Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ III.1 : L a ch n pha tnh ự ọ ĩ ­ D a vào các tài li u ,D c  i n ,thành ph n và ự ệ ượ đ ể ầ tính ch t c a các ch t có trong m u phân tích .....ta l a ấ ủ ấ ẫ ự ch n c t s c ký phù h p có th  là c t pha thu n, c t pha ọ ộ ắ ợ ể ộ ậ ộ o hay các lo i c t khác nhau ...đả ạ ộ Chúng ta thông th ng dùng 02 lo i c t pha thu n ( ườ ạ ộ ậ NP) và c t pha  o ( RP)ộ đả Ngoài ra ta có th  dùng m t s  lo i c t khác nh  ể ộ ố ạ ộ ư c t CN ,c t NHộ ộ 2 ,.... Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ C t pha thu n ( NP)ộ ậ : Silicagel trung tính  Pha tnh :ĩ C t này là lo i c t dùng   tách các ch t không ộ ạ ộ để ấ phân c c hay ít phân c c .Trên b  m t ho t  ng c a nó ự ự ề ặ ạ độ ủ có ch a các nhóm  OH phân c c  a n c .ứ ự ư ướ Ví d  c t Lichrosorb Si 40,Si 60...  C u t o c t nh  ụ ộ ấ ạ ộ ư sau :                   OH       OH       OH           ­ O ­ Si ­ O ­ Si ­ O ­ Si ­ O ­                    OH       OH       OH    Pha  ng : dùng cho loaüi này là các dung m ôi không phân độ c c hay ít phân c c nh  : ự ự ư M ethanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc ... Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ III.1 : L a ch n pha tnh ự ọ ĩ  C t pha  o ( RP) : ( Silicagel  ã Alkyl hóa )ộ đả đ    Dùng   tách các ch t không phân c c ,ít phân c c ,các để ấ ự ự ch t phân c c có th  t o c p Ion .Trên b  m t ho t  ng ấ ự ể ạ ặ ề ặ ạ độ các nhóm  O H  ã b  Alkyl hóa t c là thay th  nguyên t  H đ ị ứ ế ử b ng các m ch Carbon th ng ( C8 hay C18  t ng  ng ằ ạ ẳ ươ đươ RP 8 hay RP 18) hay các m ch Carbon vòng( Phenyl­ ạ t ng  ng c t Phenyl )ươ đươ ộ  vì th  nó ít phân c c hay phân c c r t ít .ế ự ự ấ Ví d  nh  c t Lichrosor ­Lichrospher RP 8 ...... ODS , C t ụ ư ộ ộ Nucleosil C18........ Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ  Pha  ngĐộ  : Pha  ng dùng trong lo i này là các dung độ ạ m ôi có phân c c nh  :M ethanol ,Acetonitril,,n c hay các ự ư ướ lo i dung d ch  m  ,h n h p c a các dung m ôi­ m  .ạ ị đệ ỗ ợ ủ đệ S  tách c a ch t nh i lo i c t này có   l p l i cao ự ủ ấ ồ ạ ộ độ ặ ạ và nó  c  ng d ng ch  y u trong phân tích D c đượ ứ ụ ủ ế ượ ph m  . Hi n nay chúng ta ch  s  d ng lo i này là ch  ẩ ệ ỉ ử ụ ạ ủ y u .ế Hi n nay pha tnh trên n n Silicagel  ã có hàng tr m  ệ ĩ ề đ ă ch t khác nhau tùy thu c vào nhóm  th  c a nguyên t  ấ ộ ế ủ ử H ,ngoài ra còn có các l ai pha tnh trên n n Oxid ọ ĩ ề Nhôm ,trên n n ch t h u c  cao phân t ,trên n n m ch ề ấ ữ ơ ử ề ạ các bon...... Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ III.2 : L a ch n pha  ngự ọ độ ­ D a vào các tài li u ,D c  i n ,thành ph n và ự ệ ượ đ ể ầ tính ch t c a các ch t có trong m u phân tích .....ta l a ấ ủ ấ ẫ ự ch n pha  ng phù h p   cho quá trình r a gi i tách ọ độ ợ để ử ả hoàn toàn các ch t có trong m u  áp  ng  y   các tiêu ấ ẫ đ ứ đầ đủ chu n c a peak  ã trình bày  ng th i ph i có th i gian ẩ ủ đ đồ ờ ả ờ phân tiïch phù h p nh m  ti t ki m   c dung m ôi,hóa ợ ằ ế ệ đượ ch t,th i gian phân tích m u, gi m  thi u s  ho t  ng c a ấ ờ ẫ ả ể ự ạ độ ủ thi t b  .   ế ị ­ Pha  ng có th  làm  thay  i : độ ể đổ +   ch n l c Độ ọ ọ α + Th i gian l uờ ư Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ ­ Pha  ng có th  làm  thay  i : độ ể đổ + Hi u n ng tách c a c tệ ă ủ ộ +   phân gi i Độ ả + Tính  i x ng c a Peak đố ứ ủ Do  ó ,Trong m t pha tnh  ã ch n n u ta ch n đ ộ ĩ đ ọ ế ọ c pha  ng có thành ph n phù h p thì ta s  có hi u đượ độ ầ ợ ẽ ệ su t tách s c ký t t nh t  i v i h n h p các ch t c n ấ ắ ố ấ đố ớ ỗ ợ ấ ầ phân tích . Chính vì v y pha  ng c n có c u yêu c u ậ độ ầ ầ ầ sau : + Pha  ng ph i tr  v i pha tnh  ã có .Không  c độ ả ơ ớ ĩ đ đượ làm  cho pha tnh b  bi n  i hóa h c . ( vd giá tr pH : 2.5< ĩ ị ế đổ ọ ị pH <8.5) Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ +Pha  ng ph i hòa tan  c các ch t phân tích thì độ ả đượ ấ m i r a gi i  c chúng.(  c bi t ph i chú ý khi thay  i ớ ử ả đượ đặ ệ ả đổ pha  ng ph i r a c t b ng dung m ôi phù h p   không độ ả ử ộ ằ ợ để làm  t a các ch t có trong c t ,hay pha  ng có s n trong ủ ấ ộ độ ẵ c t  vd :  m  phosphat r  ngay b ng ACN hay M eOH s  ộ đệ ưả ằ ẽ b  k t t a trên colum n)ị ế ủ + Pha  ng ph i b n v ng theo th i gian : càng b n độ ả ề ữ ờ ề lâu càng t t nh ng ít nh t là chúng là pha  ng không b  ố ư ấ độ ị phân h y trong su t th i gia phân tích m u ).ủ ố ờ ẫ + Ph i có   tinh khi t cao : dung m ôi cho HPLC, ả độ ế hoá ch t tinh khi t phân tích .ấ ế +Ph i nhanh  t cân b ng trong quá trình s c kýả đạ ằ ắ Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ + Ph i phù h p v i lo i Detector : vd UV ­ VIS thì ả ợ ớ ạ dung m ôi không  c h p th  quang (đượ ấ ụ vd acid acetic   b c sáng th p < 220 ở ướ ấ nm) . Detector hu nh quang thì dung m ôi không  c phát ỳ đượ quang. + Ph i kinh t  ,không quá hi m  và  t ả ế ế đắ Trong h  s c ký h p ph  pha  o ( RP ­ HPLC) pha  ng ệ ắ ấ ụ đả độ là dung m ôi phân c c là : N c,ACN,M eOH ,acid hay Base ự ướ h u c  và m t vài Am in hay Am inoacid ..ữ ơ ộ + Do s  thêm  n c vào dung m ôi h u c  t o thành ự ướ ữ ơ ạ m t pha  ng phân c c h n ch t h u c  nguyên m t m ình ộ độ ự ơ ấ ữ ơ ộ nó .Vd thêm  n c vào ACN hay M eO H .. S  t o  c pha ướ ẽ ạ đượ ng phân c c h n nó . T t nhiên   phân c c ph  thu c độ ự ơ ấ độ ự ụ ộ vào t  l  n c  c thêm  vào. ỷ ệ ướ đượ Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ +  Ngòai các dung m ôi chính thì trong thành ph n ầ pha  ng trong r t nhi u tr ng h p tách RP­ HPLC còn độ ấ ề ườ ợ có thêm  h n h p  m  pH    n  nh pH.Ch t t o ỗ ợ đệ để ổ đị ấ ạ ph c,t o c p ion   t o ra s  r a gi i t t nh t . ứ ạ ặ để ạ ự ử ả ố ấ + Khi ch n dung m ôi ta th ng d a vào l c r a r i ọ ườ ự ự ử ả E c a dung m ôi theo b ng sau: ủ ả B NG   PHÂN C C C A M T S  DUNG M ÔIẢ ĐỘ Ự Ủ Ộ Ố 01­ n Hexan                      0.1 04 ­ M ethanol  5.11 02­Tetra Chloro Carbon 1.6 05­ Actenitril             5.8 03­ Toluen       2.4 06­ N c c t ướ ấ 10.20 Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ ­ Vi c l a ch n  i u ki n s c ký là công vi c h t ệ ự ọ đ ề ệ ắ ệ ế s c c n thi t trong quá trình xây d ng ch ng trình s c ký ứ ầ ế ự ươ ắ . Ch  khi l a ch n  i u kiên s c ký t t,phù h p thì chúng ta ỉ ự ọ đ ề ắ ố ợ m i có th   nh tính, nh l ng  c các l ai thu c  a ớ ể đị đị ượ đượ ọ ố đ thành ph n m t cách nhanh chóng và hi u qu  cao .ầ ộ ệ ả ­ T t nhiên ph n lý thuy t nói r t nhi u v  các ấ ầ ế ấ ề ề ph ng pháp ch n  i u ki n s c ký tuy nhiên   ch n ươ ọ đ ề ệ ắ để ọ c ch ng trình s c ký t t  i h i ph i có th i gian ,tài đượ ươ ắ ố đồ ỏ ả ờ li u và m t ph n kinh nghi m  c a nh ng ng i làm  s c ký ệ ộ ầ ệ ủ ữ ườ ắ Ph n IIIầ  : Ch n Ði u ki n s c kýọ ề ệ ắ Ph n IV : Ti n hănh s c kýầ ế ắ  ­  IV ­1 Chu n b  d ng c  và m áy m óc :ẩ ị ụ ụ + M áy HPLC ph i  c ki m  ch ng theo  nh k    ả đượ ể ứ đị ỳ để b o  m  m áy h at  ng t t cho k t qu  phân tích có   ả đả ọ độ ố ế ả độ úng,  l p l i,tuy n tính,t  l  dung m ôi ,t c  ô dòng,n ng đ độ ặ ạ ế ỷ ệ ố đ ă l ng  èn ü .... úng theo yêu c u thông s  c a m áy do ượ đ đ ầ ố ủ nhà s n xu t  t ra . ả ấ đặ +  c bi t c t s c ký ph i  c ki m  tra v  s   a Đặ ệ ộ ắ ả đượ ể ề ố đĩ lý thuy t theo  nh k  hay khi có nghi ng  v  kh  n ng ế đị ỳ ờ ề ả ă tách ,và r a  úng qui  nh sau m i l n ch y s c ký : ử đ đị ỗ ầ ạ ắ vd : V i s c ký pha thu n NP­HPLC :ớ ắ ậ  r a b ng ử ằ M eOH Không r  b ng N cưẳ ằ ướ        V i s c ký pha  o RP­HPLC : Khi ch y pha ớ ắ đả ạ ng có các lo i m u i thì ph i r a n c tr c cho s ch độ ạ ố ả ử ướ ướ ạ m u i ,sau  ó r a ố đ ử ­T  l  ACN hay M eOH : N c ( 50 : 50 ) cho s ch ỷ ệ ướ ạ h t các ch t còn  ng l i trong c t  ng th i   b o v  ế ấ đọ ạ ộ đồ ờ để ả ệ c t không b  M c khi   lâu . Tuy t  i tình tr ng ch  r a ộ ị ố để ệ đố ạ ỉ ử b ng n c 100%  sau  oú   c t  m t th i gian không s  ằ ướ đ để ộ ộ ờ ử d ng ch c ch n c t s  b  m c ,h ng không th  dùng  c ụ ắ ắ ộ ẽ ị ố ỏ ể đượ . Xin l u ý n u r  c t không t t thì k t qu  ch y s c ký ư ế ưẳ ộ ố ế ả ạ ắ s  không th   áp  ng  c các yêu c u phân tích .ẽ ể đ ứ đượ ầ 4.2 ­ Chu n b  dung m ôi pha  ng :ẩ ị độ   Các dung m ôi dùng cho s c ký là lo i tinh khi t ắ ạ ế HPLC Các hóa ch t dùng ph i là lo ûi PA  ấ ả ạ Pha dung m ôi  úng ,chính xác theo  úng t  l   ã đ đ ỷ ệ đ nêu ,   n  nh dung m ôi  úng th i gian theo chuyên lu n để ổ đị đ ờ ậ ã yêu c u .L c dung m ôi qua m àng l c 0.2 ­ 0.45 đ ầ ọ ọ µm   ,Siêu âm   u i b t khí đ ổ ọ Ph n IV : Ti n hănh s c kýầ ế ắ ­4.3 Chu n b  m u  o HPLC :ẩ ị ẫ đ + M u Th  : S  lý m u th  theo  úng chuyên ẫ ử ử ẫ ử đ lu n ,qui trình theo nguyên t c : ậ ắ ­ Dung m ôi hòa tan ho t ch t ph i hòa tan trong pha ạ ấ ả ng ,trong nhi u tr ng h p dùng dung m ôi pha  ng   độ ề ườ ợ độ để hòa tan m u ẫ ­ Ph i lo i b  các ch t không tan trong pha ả ạ ỏ ấ ng ho c không r  gi i  c b ng cách l c hay chi t ..độ ặ ưẳ ả đượ ằ ọ ế ­Ph i l c và ly tâm  ,l c m u qua m àng l c 0.2 ­ 0.45 ả ọ ọ ẫ ọ µm   ­ N ng   m u   m c v a ph i,không v t quá kh  ồ độ ẫ ở ứ ừ ả ượ ả n ng tách c a c t.Có th  gây ra ngh n c t. ă ủ ộ ể ẽ ộ Ph n VI : K Thu t ti n hănh s c ầ ỹ ậ ế ắ ký ­M u chu n : ẫ ẩ Pha dung d ch chu n có thành ph n gi ng nh  m u ị ẩ ầ ố ư ẫ th  trong cùng dung m ôi ,riêng v  n ng   các thành ph n ử ề ồ độ ầ giôïng nh  m u th  là t t nh t ,ngoài ra có th  dùng n ng ư ẫ ử ố ấ ể ồ  khác nh ng ph i n m  trong kho ng tuy n tính  ã kh o độ ư ả ằ ả ế đ ả sát c a t ng thành ph n.ủ ừ ầ 4.4 Cách  o HPLC : đ M i m áy có cách v n hành khác nhau tùy thuôcü ỗ ậ vào hãng s n xu t ,ph n m n s c ký . Tuy nhiên cách v n ả ấ ầ ề ắ ậ hành luôn ph i theo nguyên t ïc sau : ả ă    + ch y m áy v i dung m ôi pha  ng    u i h t b t ạ ớ độ để đ ỏ ế ọ khí có trong h  th ng  ng d n tr c khi cho vào c t. ệ ố ố ẫ ướ ộ Ph n VI : K Thu t ti n hănh s c ầ ỹ ậ ế ắ ký      +  t  y   các  i u ki n s c ký  nh  :Đặ đầ đủ đề ệ ắ ư           * C u hình m áy ấ *  T  l  các dung m ôi pha  ng ỷ ệ độ *  B c sóng,thành ph n m u, các ướ ầ ẫ thông s  c a quá trình phân tích yêu c u .ố ủ ầ Ph n VI : K Thu t ti n hănh s c ầ ỹ ậ ế ắ ký Ph n Vầ H thệ ng ố s c ký Merck - ắ Hitachi vă ph n m m di u ầ ề ề khi n ể D7000 – Multi HSM manager (S  b  sung sau)ẽ ổ Ng i vi tườ ế KS Phan Hi n L ngề ươ M ail : luonghoak8@ ym ail.com