Quy trình duplex PCR xác định nhiễm trùng mycoplasma hyopneumoniae - Mycoplasma hyorhinis trên mẫu phổi, dịch khớp và dịch xoang miệng trên heo

AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 59 QUY TRÌNH DUPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHIỄM TRÙNG MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE - MYCOPLASMA HYORHINIS TRÊN MẪU PHỔI, DỊCH KHỚP VÀ DỊCH XOANG MIỆNG TRÊN HEO Đỗ Tiến Duy1, Nguyễn Tất Toàn1 1Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thông tin chung: Ngày nhận bài: 11/10/2018 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 29/03/2019 Ngày chấp nhận đăng: 02/2020 Title: Duplex pcr protocol for detection of mycoplasma hyopneumoniae - mycoplasma hyorhinis on lung, joint exudates and oral fluid specimens from pigs Keywords: duplex-PCR, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, pigs Từ khóa: Duplex-PCR, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, heo ABSTRACT The study aims at building and optimizing a duplex PCR protocol for simultaneously detection of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis in pigs. Duplex PCR was built completely including an optimized parameters: primer concentrations of Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, and Mhr37p-R were 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM; and 0.5 µM, respectively. d-PCR thermal reaction was in total 35 cycles of initial denaturation at 94 oC for 3 minutes, second denaturation at 94 oC for 1 min., annealing at 45 oC for 1 min., extension at 72 oC for 1 min. and the final extension at 72 oC for 5 min. The d-PCR had a high specificity and sensitivity to be able to detect minimum 20.9 copies/ng (Mhp) and 15.0 copies/ng (Mhr). The d-PCR is highly applicable since 11/11 field samples were matched with s-PCR in result. TÓM TẮT Nghiên cứu thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình duplex PCR phát hiện đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyorhinis (Mhr) trên heo. Duplex PCR được xây dựng thành công với các thông số tối ưu như sau: Nồng độ mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, và Mhr37p-R lần lượt là 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; và 0,5 µM. Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng d-PCR bao gồm giai đoạn tiền biến tính ở 94 oC trong 3phút, biến tính ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút, kéo dài ở 72 oC trong 1 phút và giai đoạn hậu kéo dài ở 72 oC trong 5 phút, lặp lại trong 35 chu kỳ. Quy trình d-PCR có đặc hiệu và độ nhạy cao với khả năng phát hiện tối thiểu 20,9 copies/ng (Mhp) và 15,0 copies/ng (Mhr). Quy trình d-PCR có tính ứng dụng cao khi 11/11 mẫu thực địa cho kết quả đồng nhất với quy trình s-PCR. 1. GIỚI THIỆU Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyorhinis (Mhr) thuộc nhóm vi khuẩn nhỏ nhất, không có thành tế bào, thuộc giống Mycoplasma và có khả năng gây bệnh trên heo. Mhr là vi khuẩn gây viêm khớp, viêm màng thanh dịch và sự tham gia của mầm bệnh này trong các ca bệnh hô hấp cũng được ghi nhận (Kobayashi và cs., 1996; Lobo và cs., 2011). AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 60 Mhp và Mhr cùng với nhiều mầm bệnh khác cộng hợp gây suy hô hấp nghiêm trọng trên heo, hội chứng hô hấp phức hợp (Brockmeier và cs., 2002; Thacker và Thanawongnuwech, 2004). Viêm phổi do Mhp rất phổ biến trên heo ở nhiều nước trên thế giới (Brockmeier và cs., 2002) và nước ta (Nguyễn Thị Phước Ninh và cs., 2006), tuy nhiên Mhr chưa được nhiều nhà khoa học đánh giá khả năng sinh bệnh và yếu tố độc lực. Ở một số khảo sát mới, viêm phổi do Mhr khó phân biệt với Mhp hay sự nhiễm đồng thời Mhp và Mhr trong ca viêm phổi mãn tính làm tăng cao tổn thương, hư hại phế quản, màng phổi (Lin và cs., 2006; Lobo và cs., 2011). 10% Mhr được phân lập từ dịch mũi của heo nái, 20% trên mô phổi heo con kiểm soát sạch bệnh (SPF), 66% ở heo con thương phẩm (Kobish & Friis, 1996) và 30 - 40% trên dịch mũi của heo sau cai sữa, cho thấy khả năng khu trú của vi khuẩn trên đường hô hấp của heo mọi lứa tuổi. Sự chẩn đoán đồng thời Mhp và Mhr trên ca bệnh rối loạn hô hấp, viêm đa màng thanh dịch và viêm khớp có tính thực tiễn cao, bởi do bệnh trên heo có khuynh hướng diễn ra ở dạng hội chứng, kết hợp nhiều dấu hiệu lâm sàng phức tạp như hô hấp, tiêu chảy và viêm khớp (Thacker & Thanawongnuwech, 2004; Đỗ Tiến Duy & Nguyễn Tất Toàn, 2013). Đánh giá sự nhiễm ghép Mhp và Mhr trong các ca bệnh trên heo sẽ giúp người làm công tác thú y trong việc phòng trị bệnh tốt hơn. Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá, tối ưu hóa và áp dụng quy trình duplex PCR chẩn đoán Mhp và Mhr trên heo ở điều kiện thực tiễn trong nước từ kết quả nghiên cứu của nước ngoài. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung và nguyên liệu nghiên cứu Nghiên cứu gồm ba bước cơ bản như sau: [1] Thử nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn (s-PCR) phát hiện riêng lẽ Mhp và Mhr; [2] Xây dựng, tối ưu hóa quy trình PCR đôi (d-PCR) phát hiện đồng thời Mhp và Mhr; [3] Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa xác định Mhp và Mhr trên mẫu bệnh phẩm phổi và dịch khớp. 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 2.2.1 Đối chứng và mẫu bệnh phẩm DNA kháng nguyên đối chứng (Mhp, 619 ng/µL; Mhr, 476 ng/µL) ly trích từ bệnh phẩm dương tính và xác định nồng độ ước lượng qua mật độ quang học (máy đo OD Thermo Scientific, Mỹ). DNA E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., Staphylococcus aureus (Bệnh viện thú y, Trường ĐHNL Tp.HCM) làm đối chứng phản ứng chéo cho quy trình d-PCR. 11 mẫu bệnh phẩm (2 mẫu dịch hầu họng, 3 mẫu dịch khớp và 6 mẫu mô phổi) được thu thập ở các ca bệnh trên heo. 2.2.2 Các cặp mồi/primers cho phản ứng PCR Mồi đặc hiệu khuyếch đại sản phẩm s-PCR và d- PCR cho Mhp [Mhp16s-F: 5’- ACTAGATAGGAAATGCTCTAG-3’ và Mhp16s-R: 5’- ATACTACTCAGGCGGATCATTTAAC-3’], có sản phẩm 430bp (Barate và cs., 2012); và khuyếch đại sản phẩm cho Mhr [Mhr37p-F: 5’- GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-’3 và Mhr37p- R: 5’-GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’], có sản phẩm 346bp (Caron và cs., 2000). 2.2.3 Dụng cụ và hóa chất Kit IVApDNA Extraction kit (Công Ty Việt Á, Tp.HCM) sử dụng chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm. Go taq® green master mix và Go taq® G2 Hot Start green master mix (Promega, Mỹ), nước không nuclease (Promega, Mỹ) sử dụng trong phản ứng s-PCR và d-PCR bởi máy khuyếch đại PCR (Techne, Anh). 2.3 Phương pháp tiến hành 2.3.1 Kiểm tra đặc tính chung của các mồi Tính chất chung và sự đặc hiệu mồi được kiểm tra gồm: Chiều dài cơ sở phù hợp khoảng 18 - 24 nucleotides, GC chiếm 35 - 60%, khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp rất thấp (kết quả không trình bày; công cụ PrimerSelect, Lasergene). Hai cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu để khuyếch đại AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 61 đoạn gen mã hóa 16s rRNA (Barate và cs., 2012) và 37p (Caron và cs., 2000) đặc hiệu cho các chủng Mhp và Mhr, tương ứng (NCBI, GeneBank). 2.3.2 Thử nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn (s-PCR) Quy trình s-PCR phát hiện Mhp và Mhr được thực hiện với primer tương ứng, 25 µL tổng phản ứng với thành phần sử dụng Go taq® green master mix, 2X (Bảng 2) và chu trình luân nhiệt gồm ba giai đoạn: Giai đoạn 1 (1 chu kỳ), tiền biến tính ở 94 oC trong 3 phút; giai đoạn 2 (35 chu kỳ), biến tính ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút và kéo dài sản phẩm ở 72 oC trong 1 phút; giai đoạn 3 (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm cuối cùng ở 72 oC trong 5 phút. Bảng 1. Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện Mhp và Mhr Sản phẩm khuyếch đại s-PCR có băng tương ứng (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) với đối chứng dương và thang chuẩn (ladder 100bp; Promega, Mỹ) được giải trình (Công ty Nam Khoa, Tp.HCM). Trình tự giải mã được sánh cặp tương đồng với 100 trình tự gen 16s rRNA (Mhp) và 37p (Mhr) tham chiếu từ ngân hàng dữ liệu gen (GenBank, NCBI) bởi phần mềm BioEdit và BLAST (NCBI). Các bước chuẩn hóa s-PCR được tham khảo (Đỗ Tiến Duy và cs., 2014) gồm xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu (ToC), nồng độ mồi tối ưu và lượng Master Mix (Go taq® green, Promega, Mỹ) cho phản ứng khuyếch đại (Bảng 2) và chu trình luân nhiệt ba bước được giữ nguyên. Bảng 2. Các nghiệm thức (NT) chuẩn hóa s-PCR cho Mhp/Mhr Nồng độ mồi* (µL) Nhiệt độ bắt cặp (ToC)/ Master mix (µL) 43 oC 45 oC 47 oC 49 oC 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 0,25 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 0,5 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 0,75 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 *, mồi tương ứng cho Mhp hay Mhr Mhp Mhr Thành phần µL Nồng độ cuối µL Nồng độ cuối Go taq® green master mix, 2X 12 12 Mhp16s-F 25 µM 0,5 0,5 µM Mhr37p-F 25 µM 0,5 0,5 µM Mhp16s-R 25 µM 0,5 0,5 µM Mhr37p-R 25 µM 0,5 0,5 µM DNA Mhp đối chứng 619 ng/µL 3 206 ng/µL DNA Mhr đối chứng 476 ng/µL 3 158 ng/µL Nước DEPC không nuclease vừa đủ 25 µL AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 62 2.3.3 Xây dựng, tối ưu hóa quy trình d-PCR Hai cặp mồi với đặc tính (Bảng 1), nồng độ và nhiệt độ bắt cặp tối ưu ở s-PCR, dùng cho thiết kế một phản ứng chung d-PCR, với kích thước sản phẩm khác nhau (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) đủ để nhận diện rõ ràng trên gel điện di. Tối ưu hóa d- PCR gồm: [1] Xác định khả năng hoạt động của mồi trong d-PCR; [2] Xác định nồng độ mồi trong phản ứng d-PCR; [3] Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi trong phản ứng d-PCR; [4] Xác định lượng Master mix tối ưu trong d-PCR; và [5] Xác định nồng độ DNA khuôn tối thiểu được phát hiện bởi d-PCR. Mỗi phản ứng tương ứng của các thí nghiệm lặp lại 3 lần và kèm theo đối chứng âm và thử nghiệm phản ứng chéo với DNA của một số vi khuẩn phổ biến (E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., Staphylococcus aureus) để xác định tính chính xác của thí nghiệm. Đánh giá khả năng hoạt động của mồi trong d- PCR Cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R và cặp mồi Mhr37p-F, Mhr37p-R được thử nghiệm trên cùng môi trường và điều kiện phản ứng ở d-PCR, mô tả ở Bảng 2. Quy trình d-PCR thực hiện cùng điều kiện ba giai đoạn: Giai đoạn 1 (1 chu kỳ), tiền biến tính ở 94 oC trong 1 phút; giai đoạn 2 (35 chu kỳ), biến tính ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút và kéo dài sản phẩm ở 72 oC trong 1 phút; giai đoạn 3 (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm cuối cùng ở 72 oC trong 5 phút. Thành phần phản ứng trong tổng thể tích (25 µL) như sau: 12 µL Go taq® G2 Hot Start green master mix, 2X; 0,5 µL cho mỗi đoạn mồi (Mhp16s-F 25 µM, Mh16s- R 25 µM, Mhr37p-F 25 µM, Mhr37p-R 25 µM), 3 µL DNA đối chứng dương với tỷ lệ 1:1 (Mhp/Mhr), và nước DEPC thêm vào cho đủ tổng thể tích. Xác định nồng độ mồi tối ưu trong d-PCR Nồng độ của mỗi mồi khác nhau (0,25 µM, 0,5 µM, 0,75 µM và 1,0 µM) được khảo sát với điều kiện phản ứng luân nhiệt giống như thí nghiệm đánh giá khả năng hoạt động của mồi ở trên. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu trong d-PCR Nồng độ các cặp mồi tối ưu từ thí nghiệm trước được áp dụng để đánh giá các thang nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn ở 43 oC, 45 oC, 47 oC, 49 oC và thành phần phản ứng khác được giữ nguyên như hai thí nghiệm trên. Xác định lượng Master mix tối ưu trong d- PCR Nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ưu từ các thí nghiệm trước đó được dùng trong phản ứng d- PCR nhằm xác định lượng Master mix vừa đủ. Lượng Master mix khảo sát ở 10 µL, 12 µL và 14 µL. Thành phần phản ứng khác được giữ nguyên như các thí nghiệm trên. Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu phát hiện bởi d-PCR Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu được phát hiện bởi d-PCR dựa theo chỉ số LOD (Limit of Detection). LOD được xác định khi ở một nồng độ nhất định, phương pháp xét nghiệm phát hiện sự hiện diện của gen đích 95%, tỷ lệ âm tính giả ≤ 5% (ISO 24276, 2006). DNA đối chứng dương (Mhp và Mhr) được tinh sạch bằng chloroform/isopropanol, và sau đó được đo mật độ quang học (OD; máy đo OD Thermo Scientific, Mỹ). Số copies/ng ước lượng được tính toán theo công thức từ phần mềm trực tuyến ( Pha loãng DNA đối chứng tinh sạch theo cấp số 100, 10-1, 10-2, 10-3,.., 10-11 để tiến hành chạy d-PCR tìm lượng tối thiểu phát hiện. 2.3.4 Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa xác định Mhp và Mhr trên mẫu bệnh phẩm Tổng cộng 11 mẫu gồm có 2 mẫu dịch hầu họng (thu thập bằng phương pháp dây từng cotton, Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy, 2013), 3 mẫu dịch khớp và 6 mẫu mô phổi được thu thập ngẫu nhiên trong các ca bệnh trên heo (Bệnh viện thú y, Trường ĐHNL Tp.HCM). s-PCR và d-PCR tối ưu được ứng dụng để xác định Mhp và Mhr trên 3 loại bệnh phẩm trên. Sự tương đồng giữa s-PCR và d-PCR được tính toán với trị số Kappa (Blackman & Koval, 2000). AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 63 Sản phẩm s-PCR và d-PCR ở tất cả thí nghiệm được điện di trên gel agarose (1,5%, TBE 0,5x, 100V; máy VWRC®), hòa tan 3 µL/25mL Ethidium bromide (Invitrogen brand, Mỹ), và kết quả điện di được đọc trên máy chiếu tia UV trực tiếp (máy Vilber Lourmat, Pháp). 3. KẾT QUẢ 3.1 Quy trình s-PCR xác định Mhp và Mhr Hai cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R và Mhr37p-F, Mhr37p-R khuyếch đại sản phẩm (Hình 1A, B) hoàn toàn đặc hiệu (gen 16s, Mhp; gien 37p, Mhr) so với các chủng tham chiếu trên ngân hàng dữ liệu gen. Ở s-PCR Mhp, nhiệt độ bắt cặp 45 oC, 47 oC và 49 oC có sản phẩm khuyếch đại tốt tương tự nhau (băng sáng rõ và không có vạch phụ) trên gel điện di. Hoạt động của cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R tốt ở khoảng dao động nhiệt độ rộng giúp cho việc xét nghiệm hiệu quả ở các điều kiện nhiệt hay máy luôn nhiệt khác nhau. Qua thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi, 0,5 µM là nồng độ tốt nhất cho vạch sản phẩm sáng rõ ở các thang nhiệt độ khác nhau; trong khi sản phẩm khuyếch đại mờ trên gel điện di ở nồng độ 0,25 µM và xuất hiện sản phẩm phụ ở 0,75 µM. Lượng master mix tối ưu cho sản phẩm s-PCR tốt qua khảo sát ở 10 µL, sản phẩm yếu ở 8 µL, trong khi sẽ dư thừa ở 12 µL mặc dù sản phẩm s-PCR tốt như ở 10 µL. Hình 1. Sản phẩm khuyếch đại s-PCR [A]: Băng sản phẩm 430bp của Mhp ở giếng 3, 4; [B]: Băng sản phẩm 346bp của Mhr ở giếng 3, 4; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhr từ s-PCR chuẩn hóa ở 45oC từ NT1-NT9 (giếng 1 - 9), đối chứng âm (giếng 10) và thang chuẩn (L). AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 64 3.3 Quy trình d-PCR tối ưu hóa Hình 2A trình diễn kết quả đánh giá hoạt động của 2 cặp primer (Mhp16s-F, Mhp16s-R và Mhr37p-F, Mhr37p-R) trong phản ứng d-PCR. Chất lượng sản phẩm khuyếch đại 430bp của Mhp và 346bp của Mhr rất tương đồng nhau. Độ dày băng sản phẩm yếu hơn s-PCR trong cùng điều kiện, nguyên liệu phản ứng nên hiệu chỉnh d-PCR để tìm thông số tối ưu là công đoạn quan trọng. Nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1 µM mồi đều cho sản phẩm khuyếch đại tốt, băng sản phẩm rõ và sáng. Ở nồng độ mồi 0,25 µM kết quả khuyếch đại kém hơn các nồng độ còn lại; trong khi 0,5 µM là nồng độ hữu hiệu với kết quả tốt và hạn chế dư thừa trong phản ứng. Ở kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp, các mức nhiệt độ 45 oC, 47 oC và 49 oC mồi hoạt động tốt cho băng sản phẩm sáng, rõ và không có sản phẩm phụ (Hình 2C). Ở cả 3 nhiệt độ bắt cặp này kết quả khuyếch đại tương đương nhau mặc dù sản phẩm d-PCR của Mhp kém hơn so với các thang nhiệt độ bắt cặp khác (giếng số 8 đến 11; hình 2C). Ở 45 oC là nhiệt độ bắt cặp lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo. Thể tích Master mix 12 µL cho sản phẩm khuyếch đại rõ và sáng nhất. Quy trình d-PCR yêu cầu lượng thành phần phản ứng (Master mix) cao hơn so với s-PCR. Sự cạnh tranh nguyên liệu phản ứng (Polymerase, dNTP và MgCl2) có thể xảy ra giữa các cặp mồi khuyếch đại sản phẩm đặc trưng khác nhau. Nồng độ DNA tinh sạch của Mhp (9,7 ng/µL, tương đương 2,09.1010) và của Mhr (5,6 ng/µL, tương đương 1,5.1010) được xem như nồng độ mẫu gốc để tiến hành xác định tính nhạy cảm của d-PCR. Ở độ pha loãng 10-9, không còn sản phẩm d-PCR xuất hiện, được xem là giới hạn thấp nhất (Mhp: 20,9 copies/ng; Mhr: 15,0 copies/ng) mà phản ứng có thể xét nghiệm. Sự chính xác của kết quả được lặp lại 10 với mẫu ở nồng độ pha loãng 10-9 cho kết quả hoàn toàn giống nhau. Hình 2. Sản phẩm khuyếch đại d-PCR. AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 65 [A]: Băng sản phẩm 430bp của Mhp s-PCR (giếng 2), băng sản phẩm 346bp của Mhr s-PCR (giếng 3), và băng sản phẩm của Mhp và Mhr trong d-PCR (giếng 4, 5); [B]: Kết quả xác định sự đặc hiệu của d-PCR, chỉ có băng sản phẩm Mhp và Mhr xuất hiện (giếng 2), các giếng còn lại âm tính với các vi khuẩn kiểm tra; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhp/Mhr qua các nhiệt độ bắt cặp khác nhau (45 oC, giếng 3 - 5; 47 oC, giếng 6 - 8; 49 oC, giếng 9 - 11); thang chuẩn (L) và đối chứng âm (giếng 2). 3.4 Kết quả ứng dụng d-PCR tối ưu hóa Kết quả d-PCR hoàn toàn trùng khớp với kết quả s- PCR khi xét nghiệm Mhp/Mhr trên 11 mẫu thực địa (Bảng 3). Chỉ số Kappa đạt tối đa (1.0). Quy trình d-PCR khuyếch đại sản phẩm Mhp yếu hơn s-PCR ở 2 mẫu dịch hầu họng. Mẫu dịch hầu họng thu thập bằng dây thừng cotton là phương pháp mới để chẩn đoán các mầm bệnh vi-rút trên heo (Prickett và cs., 2008, Prickett và cs., 2010; Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy, 2013), tuy nhiên Mhp có khả năng phát hiện thấp hơn so với mô phổi (kết quả chưa công bố), có thể do lượng mầm bệnh hiện diện trong dịch miệng thấp. Ngược lại, Mycoplasma (Mhp, Mhr) hiện diện cao ở dịch tiết mũi heo (Kobish & Friis, 1996), do đó cần có thử nghiệm sâu hơn xác định khả năng phát hiện Mhp và Mhr qua mẫu dịch ngoáy mũi bằng kỹ thuật d-PCR tối ưu của nghiên cứu này. Bảng 3. Tương đồng kết quả d-PCR và s-PCR Mẫu xét nghiệm s-PCR d-PCR T Kí hiệu Mhp Mhr Mhp Mhr 1 M-1 - + - + 2 M-4 - - - - 3 M-6 - + - + 4 M-7 + + + + 5 M-9 + + + + 6 M-20 + + + + 7 H-2 + - + - 8 H-3 + - + - 9 D-1 + + + + 10 D-2 + - + - 11 D-6 + + + + M: Mẫu mô; D: Dịch khớp; và H: Dịch hầu họng 4. THẢO LUẬN Ở s-PCR Mhr, nhiệt độ bắt cặp tối ưu ở 47 oC và 49 oC cho phản ứng khuyếch đại ở các điều kiện nồng độ mồi và Master mix thay đổi. Ở 45 oC, sản phẩm khuyếch đại sáng rõ qua gel điện di ở nồng độ mồi 0,5 µM và 0,75 µM (Hình 1C). Ở 43 oC, sản phẩm s-PCR chỉ tốt ở lượng Master mix lớn (10 µL và 12 µL). Như vậy, s-PCR Mhr hoạt động tốt ở nhiệt độ bắt cặp 45 oC đến 49 oC với nồng độ mồi là 0,5 µM và 0,75 µM và lượng Master mix 10 và 12 µL. Thông số tối ưu từ s-PCR Mhp và s-PCR Mhr cho phép thiết kế, chuẩn hóa quy trình d-PCR được chính xác, nhanh chóng hơn. Quy trình d-PCR yêu cầu hai mồi phải có nhiệt độ bắt cặp gần giống nhau, nồng độ mồi tương thích và hạn chế sự cạnh tranh nguyên liệu phản ứng khuyếch đại (Octavian, 1997; AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 66 Henegarui và cs., 1997). Nhiệt độ bắt cặp tối ưu 45 oC đến 49 oC, nồng độ mồi từ 0,5 µM đến 0,75 µ và lượng Master mix từ 10 µL đến 12 µL được chọn làm cơ sở phát triển d-PCR. Hình 2B chứng minh tính đặc hiệu của d-PCR, khi không có bất kỳ phản ứng chéo nào với DNA đối chứng từ các mầm bệnh khác. Xác định khả năng phản ứng chéo với loài Mycoplasma hyosynoviae và Mycoplasma flocculate kí sinh trên khớp và đường hô hấp heo (Freeman và cs., 1984) rất cần thiết trong kỹ thuật xét nghiệm, tuy nhiên nghiên cứu này không có điều kiện thực hiện. Cả 3 mẫu dịch khớp thu thập từ 3 heo có biểu hiện lâm sàng rối loạn hô hấp và viêm khớp dương tính với Mhp qua d-PCR. Mhp chưa từng được phân lập hay xác định bởi kỹ thuật sinh học phân tử từ dịch khớp trên heo (Makhanon và cs., 2012), trong khi tỷ lệ hiện diện Mhr lại rất cao (Kobish & Friis, 1996; Makhanon và cs., 2012). 79% Mycoplasma pneumonia hiện diện trong 24 bệnh nhân viêm khớp (Johnson và cs., 2007). Do đó nghiên cứu xác định tỷ lệ đồng nhiễm Mhp và Mhr trên heo viêm khớp (áp dụng phương pháp lấy mẫu hạn chế tối đa vấy nhiễm) sẽ giúp hiểu rõ vai trò gây bệnh và dịch tễ của chúng. Quy trình d-PCR được xây dựng, tối ưu thành công và tương đồng hoàn toàn với s-PCR trong việc xác định Mhp và Mhr trên cả mẫu đối chứng và mẫu bệnh phẩm (phổi, dịch khớp, dịch miệng) thu thập thực địa. Độ nhạy của d-PCR rất cao khi khuyếch đại Mhp (20,9 copies/ng) và Mhr (15,0 copies/ng). d-PCR tối ưu nhất ở nồng độ mồi Mhp16s-F; Mhp16s-R; Mhr37p-F; Mhr37p-R lần lượt là 0,5; 0,5; 0,5; 0,5 µM; ở thể tích Master mix 12 µL, và nhiệt độ bắt cặp 45 oC. TÀI LIỆU THAM KHẢO Barate, A.K., Lee, H.Y., Jeong, H.W., Lam, Q.T., Joo, H.G & Hahn, T.W. (2012). An improved multiplex PCR for diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyohinis. Korean Journal of Veterinary Research, 52, 39-43. Blackman, N.J., & Koval, J.J. (2000). Interval estimation for Cohen's kappa as a measure of agreement. Statistics in Medicine, 19, 723– 741. Brockmeier, S., Halbur, & Thacker, E. (2002). Porcine respiratory disease complex. In Textbook of Polymicrobial Disease (Brogden, KA., Guthmiller, JM., eds). Washington, DC: ASM Press, 231-258. Caron, J., Ouardani, M., & Dea, S. (2000). Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes. J Clin Microbiol, 38, 1390-1396. Đỗ Tiến Duy & Nguyễn Tất Toàn. (2013). Khảo sát biểu hiện lâm sàng, bệnh lý mô học phổi viêm và căn nguyên gây bệnh trên heo cai sữa có triệu chứng hô hấp tại một số trại chăn nuôi khu vực phía Nam. Tạp chí KHKT Thú y, 20, 44-52. Đỗ Tiến Duy., Lê Thị Hạnh Dung., Lê Thanh Hiền., & Nguyễn Tất Toàn. (2014). Tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiện Haemophilus parasuis trên heo con có dấu hiệu rối loạn hô hấp từ các trại chăn nuôi ở một số tỉnh phía Nam. Tạp chí KHKT Thú y, 21, 8-17. Freeman, M.J., Armstrong, C.H., & Freeman- Sands, L.L. (1984). Serological cross- reactivity of porcine reference antisera to Mycoplasma hyopneumoniae, M. flocculare, M. hyorhinis and M. hyosynoviae indicated by the enzyme-linked immunosorbent assay, complement fixation and indirect hemagglutination tests. Can J Comp Med, 48, 202-207. Henegarui, O., Heerema, N.A., Dlouhy, S.R., Vance, G.H. & Vogt, P. (1997). Multiplex PCR: Critical parameters and step –by- step protocol. BioTechniques, 23, 504-511. Johnson, S.M., Bruckner, F., & Collins, D. (2007). Distribution of Mycoplasma AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 67 pneumoniae and Mycoplasma salivarium in the synovial fluid of arthritis patient. Journal of Clinical Microbiology, 45, 953–957. Kobayashi, H., Morozumi, T., Miyamoto, C., & Shimizu, M. (1995). Mycoplasma hyorhinis infection levels in lung of piglets with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome. J Vet Med Sci, 58, 109-113. Kobisch, M., & Friis, N.F. (1996). Swine mycoplasmoses. Revue Scientifique et Technique, 15, 1569–1605. Lin, J.H., Chen, S.P., Yeh, K.S., & Weng, C.N. (2006). Mycoplasma hyorhinis in Taiwan: Diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen. Veterinary Microbiology, 15, 111– 116. Lobo, E., Poveda, C., Gupta, R., Suarez, A., Hernández, Y., Ramírez, A., & Poveda, J.B (2011). Mycoplasmas hyorhinis in different regions of Cuba. Diagnosis. Braz J Microbiol, 42, 721-725. Makhanon, M., Tummaruk, P., Thongkamkoon, P., Thanawongnuwech, R., & Prapasarakul, N. (2012). Comparison of detection procedures of Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, and Mycoplasma hyorhinis in lungs, tonsils, and synovial fluid of slaughtered pigs and their distributions in Thailand. Trop Ani Health Prod, 44, 313–318. Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy. (2013). Xác định một số virus gây rối loạn hô hấp trên heo qua mẫu dịch xoang miệng và mẫu mô. Tạp chí KHKT Thú y, 20, 41-49. . Nguyễn Thị Phước Ninh., Đỗ Tiến Duy., Nguyễn Tất Toàn., Nguyễn Ngọc Tuân., & Trần Thị Dân. (2006). Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae và một số vi khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp trên phổi heo. Tạp chí KHKT Thú Y, 13, 12-15. Octavian, H. (1997). Troubleshooting for PCR and multiplex PCR. Yale University, US. Retrieved from medicine.yale.edu/labs/henegariu/tavi/trblesht. html. Prickett, J.R., Kim, K., Simer, R., Yoon, K.J, & Zimmerman, J. (2008). Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. Journal of Swine Health and Production, 16, 86-91. Prickett, J.R., & Zimmerman, J,J. (2010). The development of oral fluid-based diagnostics and applications in veterinary medicine. Animal Health Reseach Reviews, 11, 207-216. Thacker, E.L., & Thanawongnuwech, R. (2004). Porcine respiratory disease complex (PRDC). Thai Journal of Veterinary Medicine, 32, 125- 134.