Quy trình phân lập arn từ mô chuột thí nghiệm trong nghiên cứu sinh y

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE 2014, Vol. 59, No. 6BC, pp. 110-116 This paper is available online at QUY TRÌNH PHÂN LẬP ARN TỪ MÔ CHUỘT THÍ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU SINH Y Chu Đình Tới Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Tóm tắt. Trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh y nói riêng, vật chất di truyền như ADN và ARN được sử dụng để nghiên cứu, chẩn đoán, phát triển phương pháp điều trị bệnh là rất phổ biến và cần thiết. Việc phân lập ARN từ tế bào động vật như thế nào sẽ có quyết định đến hiệu quả và tính chính xác của các nghiên cứu tiếp theo. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một phương pháp phân lập ARN từ các mô bào chuột thí nghiệm sử dụng TRI Reagent để phục vụ nghiên cứu sinh y. Kết quả cho thấy phương pháp phân lập của chúng tôi đảm bảo chất lượng, số lượng và tính toàn vẹn của ARN, tương đương với phương pháp đối chứng sử dụng kít phân lập. Phương pháp của chúng tôi tuy mất thời gian hơn nhưng lại có chi phí thấp hơn phương pháp đối chứng. Từ khóa: ARN, phân lập ARN, TRI Reagent. 1. Mở đầu Axit ribonucleic (ARN - Việt hóa, tên tiếng Anh là Ribonucleic acid - ARN) là vật liệu di truyền ở mức phân tử, cùng với axit deoxyribo nucleic (AND - Việt hóa, tên tiếng Anh là Deoxyribonucleic acid - DNA) [5, 7]. Trong cơ thể người và động vật có vú, ARN có chức năng vận chuyển thông tin di truyền từ AND đến riboxom để tổng hợp protein. Trong nghiên cứu sinh y, khi sử dụng các công cụ sinh học phân tử như phản ứng PCR, Micrroarray. . . nếu phát hiện được ARN của một gen nào đó, chứng tỏ gen đó có chức năng, tức có “khả năng” sao mã thành các protein chức năng và biểu hiện ra kiểu hình. Ngoài ra, dựa vào mức độ biểu hiện ARN nhiều hay ít của một gen cụ thể ta có thể biết được mức độ hoạt động của gen đó như thế nào trong điều kiện nghiên cứu. Do đó, việc phân lập ARN từ các mô bào người và động vật thí nghiệm là hết sức quan trọng, số lượng, chất lượng và tính toàn vẹn của ARN đóng vai trò quyết định trong các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo. Về cơ bản có ba loại phân tử ARN tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein bao gồm ARN thông tin (messenger ARN, mARN), ARN vận chuyển (transfer ARN, tARN), và ARN riboxom (ribosomal ARN, rARN) [5]. mARN tham gia vào quá trình dịnh mã tại riboxom để sinh tổng hợp protein nên được quan tâm trong các phương pháp nghiên cứu sinh y hiện đại. Trên tế bào động vật nói riêng, và eukaryote nói chung, mỗi riboxom hoàn chỉnh có hai tiểu đơn vị bé (40S) và lớn (60S), trong đó tiểu đơn vị 40S được cấu thành từ rARN 18S và 33 protein, còn tiểu đơn vị 60S được cấu thành từ rARN 28S, rARN 5,8S và 49 protein. Việc phân lập ARN để tiến Tác giả liên lạc: Chu Đình Tới, địa chỉ e-mail: chudinhtoi.hnue@gmail.com 110 Quy trình phân lập ARN từ mô chuột thí nghiệm trong nghiên cứu sinh y hành nghiên cứu trong sinh y, là nhắm đến mARN, nhưng thực tế, việc này rất phức tạp, nên người ta phân lập ARN tổng số, tuy nhiên quá trình dịch mã xảy ra trên riboxom, nên việc tách được các riboxom, và xác định được tính nguyên vẹn của riboxom chứng tỏ đã phân lập được mARN. Hiện có rất nhiều phương pháp phân lập ARN từ mô bào động vật, trong đó những phương pháp phổ biến như sử dụng phenol - chloroform, TRI Reagent, Trizol, và kít RNeasy Mini Kit [2-4, 6]. Mỗi phương pháp đều có các ưu nhược điểm riêng, nhưng tựu chung các phương pháp sử dụng kít phân lập sẽ nhanh chóng và cho ARN chất lượng tốt hơn, nhưng tốt kém hơn. Các phương pháp còn lại thường tốn thời gian, nhưng chi phí rẻ. Do vậy, việc xây dựng một phương pháp phân lập ARN có giá thành và thời gian hợp lí để phục vụ công tác nghiên cứu sinh y là rất cần thiết. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu * Chuột Vật liệu nghiên cứu là chuột sạch bệnh, dòng B57LB/6, từ 5 - 10 tuần tuổi, được lấy các mô như cơ, mỡ, tim và gan cho việc phân lập ARN. * Dụng cụ, sinh phẩm và hóa chất Các dụng cụ và hóa chất để thu thập mô động vật như: kéo, panh kẹp vô trùng, ống đựng mẫu vật (eppendorf), nitơ lỏng, dung dịch khử ARN (ARN away) để tránh tạp nhiễm, cồn sát trùng 70%, gang tay. Các hóa chất để phân lập, kiểm tra chất lượng ARN gồm: Tri-reagent, BCP Phase Separation Reagent (Molecular research center, BP151), Isopropanol (POCH, 751500111), cồn 75% (Chempur, 113964200), ARNse free water (hoặc nước cất vô trùng và không chứa ADN, ARN), ARNse inhibitor (Life Technologies, AM2694), agarose để đổ gel, Cresol để nhuộm ARN, dung dịch đệm TBE Buffer 1X và Gelred. Tri-reagent và BCP Phase Separation Reagent được giữ ở tủ lạnh (4 ◦C), cồn 75% được pha từ cồn tinh khiết với nước vô trùng không có vật chất di truyền và giữ ở nhiệt độ -20 ◦C, Isopropanol và ARNse inhibitor cũng được giữ ở nhiệt độ -20 ◦C. Cột phâp lập ARN (RNeasy Mini kit - hãng Qiagen, 74106). Các thiết bị máy móc để phân lập, định lượng và kiểm tra chất lượng ARN: tủ lạnh -80 ◦C để giữ mẫu vật, máy nghiền mẫu vật (Homogenizer), ống nghiệm thủy tinh để nghiền mẫu (homogenizing tubles), máy li tâm, máy tính và đầu đọc kiểm tra hàm lượng, chất lượng ARN (NanoDrop), máy scan UV để kiểm tra tính nguyên vẹn của ARN. 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Lấy mẫu mô động vật Mẫu được sử dụng để phân lập ARN trong thí nghiệm này gồm mô mỡ (mỡ đùi), gan, tim và cơ mặt trong đùi của chuột thí nghiệm, quy trình lấy mẫu được tiến hành như sau: - Giết chuột: Chuột được giết bằng thao tác kéo giãn cơ để làm đứt hành não. - Sát trùng: Chuột thí nghiệm sau khi chết, được phun sát trùng bằng cồn 70%, để tránh tạp nhiễm. - Mổ thu mẫu: Sau khi sát trùng, chuột được mổ và thu mỡ đùi, rồi sau đó mổ cơ bụng để thu gan, mổ xoang ngực thu tim, và sau đó thu cơ đùi. Các thao tác được thực hiện bằng kéo và 111 Chu Đình Tới pank vô trùng. Thao tác thực hiện càng nhanh càng tốt, để tránh hàm lượng mARN trong cơ bị giảm do các enzym tự thân. Mỗi loại mô của từng chuột được đựng trong một eppendof riêng, được đánh số, ghi nhãn, và được để ngay trong dung dịch nitơ lỏng cho đông cứng lại với mục đích bảo toàn ARN. Với cơ tim, do trong tim có thể có chứa những cục máu đông, sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu, nên khi thu tim, chúng ta cần thực hiện thao tác cắt đôi tim, dùng pank gạt hết máu trước khi cho vào ống eppendof. - Bảo quản mẫu: Nếu không tiến hành phân lập ARN ngay, thì mẫu đông cứng trong ni tở lỏng sẽ được lấy ra, đựng vào các hộp chứa và cất vào tủ -80 ◦C, ở điều kiện này, mARN sẽ được bảo quản trong nhiều năm. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thu mẫu (mỡ đùi, cơ đùi, gan và tim) từ 5 chuột thí nghiệm được đánh số từ 1 đến 5, tổng số mẫu là 20. 2.2.2. Quy trình phân lập ARN nghiên cứu Trên cơ sở kế thừa các phương pháp phân lập ANR của các nhà nghiên cứu trước và phương pháp đã được chúng tôi sử dụng cho mô mỡ và tế bào mỡ trong công trình đã công bố năm 2014 [3], chúng tôi tiến hành phân lập ARN từ các mô của chuột, có mở rộng áp dụng với các mô khác như tim, cơ và gan theo quy trình sau: - Bước 1: Nghiền mẫu 100 - 200 mg mỗi mô mẫu được nghiền trong 1 mL dung dịch Tri-reagent đựng trong ống thủy tinh nghiền mẫu vật chuyên dụng, sau khi nghiền dung dịch mẫu được đựng trong ống eppendof 1,5 mL vô trùng, bảo quản ở -80 ◦C nếu không tiến hành bước tiếp theo. Với mô mỡ và gan có thể sử dùng máy nghiền (homogenizer) bình thường với đầu nghiền bằng nhựa, vì các mô này mềm, dễ vỡ. Với các mô như cơ tim, cơ đùi, có cấu trúc cơ chắc, dai, nên trước khi nghiền bằng máy nghiền bình thường, chúng tôi làm vỡ mô thành các mảnh nhỏ trong dung dịch nitơ lỏng bằng cối và chày sứ. Hoặc nghiền các mô này bằng máy nghiền chuyên dụng với đầu nghiền kim loại có gắn dao cắt. Ở bước này, thao tác được tiến hành nhanh, nghiền khi mô còn đông cứng bởi nitơ lỏng để tránh thất thoát và phá hủy mARN. Dung dịch mẫu sau khi nghiền được đựng trong eppendof được đặt trong đá lạnh, nếu như không chuyển ngay đến tủ lạnh -80 ◦C được. - Bước 2: Tách lớp dung dịch Dung dịch mẫu trong Tri reagent được li tâm ở tốc độ 10000 RPM trong 10 phút ở 4 ◦C. Trong thời gian này có thể chuẩn bị các eppendof 1,5 mL mới, viết nhãn, để đựng mẫu. Sau khi li tâm, dùng pipet 1 mL thu phần dịch nổi phía trên, bỏ cặn ở đáy ống nghiệm và cho dịch nổi này vào các eppendof mới thu được khoảng 750 µL. Ở bước này, với các mô mỡ, sau khi li tâm sẽ thấy một lớp mỡ trên bề mặt dung dịch và khi thu cần tránh không thu lớp mỡ này. Dùng pipet 200 µL lấy 75 µL dung dịch BCP cho vào từng mẫu, lắc đều bằng tay hoặc Votex trong 15 giây, để mẫu trong đá lạnh hoặc ngăn mát của tủ lạnh trong 10 - 15 phút. Sau thời gian này sẽ thấy dung dịch được chia làm hai lớp với màu trắng chứa ARN ở phía trên và phía dưới có màu hồng của Tri regent nơi có chứa protein với ADN ở trên mặt, và các thành phần hữu cơ khác của mô bào. 112 Quy trình phân lập ARN từ mô chuột thí nghiệm trong nghiên cứu sinh y - Bước 3: Kết tủa ARN Li tâm mẫu ở tốc độ 12000 RPM trong 15 phút ở 4 ◦C. Chuyển lớp dung dịch phía trên (có màu trắng, tránh thu lớp tiếp giáp với lớp màu hồng ở dưới, vì đó là ADN), chuyển sang ống eppendof mới. Bước này sẽ thu được khoảng 450 µL. Lấy một lượng tương đương (450 µL) dung dịch isopropanol 100% lạnh (được giữ ở nhiệt độ -20 ◦C trước đó) cho vào từng mẫu, lắc đều. Đưa mẫu vào ngăn đá -20 ◦C trong 30 phút (có thể bảo quản như thế này trong vài tháng). Li tâm ở tốc độ tối đa (13200 -14000 RPM, tùy theo loại máy li tâm) trong 10 phút ở 4 ◦C. - Bước 4: Rửa ARN Sau khi li tâm, dùng pipet 1 mL loại bỏ dung dịch phía trên, giữ lại cặn trắng ở đáy (căn trắng này là ARN) của ống eppendof. Lấy 0,8 mL cồn 75% (đã được giữ lạnh ở -20 ◦C) cho vào mỗi mẫu, lắc đều để cặn trắng tách ra khỏi đáy ống nghiệm (thực tế cặn trắng này không thể hòa tan trong cồn, nên chỉ cần lắc cho cặn tách khỏi đáy là được). Đưa mẫu vào bảo quản ở -20 ◦C qua đêm (bước này có thể để đến hàng tháng). Li tâm ở tốc độ tối đa trong 10 phút ở 4 ◦C, bỏ dung dịch phía trên, giữ lại cặn. Lặp lại bước rửa bằng cồn này trong 2 - 3 lần. Lần cuối cùng, sau khi bỏ cồn ở phía trên, còn cặn ở đáy ống nghiệm, cho ống nghiệm vào máy li tâm, và li tâm với tốc độ tối đa trong 1 phút, dùng pipet 20 µL loại bỏ hoàn toàn lớp cồn còn lại ở đáy ống nghiệm xung quanh cặn trắng. Đemmẫu sấy khô dưới buồng cấy vô trùng ở nhiệt độ phòng, bằng cách mở nắp ống nghiệm. Thời gian khoảng 10 - 30 phút, khi thấy cặn trắng ở cuối ống nghiệm chuyển thành không màu hoặc bị khô và tách ra khỏi đáy ống nghiệm là được. - Bước 5: Hoàn nguyên A Sau khi sấy khô ARN, ARN được hoàn nguyên trong nước cất vô trùng, đã khử ADN và ARN với 30 µL nước/mẫu. Nước này có thể mua ở các công ti sinh phẩm, hoặc tự làm bằng cách dùng lọc vi khuẩn lọc nước cất 2 lần, rồi đem hấp khủ trùng hai lần. Để bảo quản ARN được lâu, và tránh hiện tượng giảm nồng độ, tốt nhất nên hoàn nguyên ARN trong nước cất có chứa chất bất hoạt emzym phân giải ARN - ARNse inhibitor (Superase-In). Dung dịch ARN được để trong tủ lạnh 4 ◦C với thời gian 30 phút trước khi kiểm tra số lượng và chất lượng (bước này có thể tiến hành sau, khi đó đem ARN cất ở tủ -80 ◦C). - Bước 6: Xác định số lượng và chất lượng ARN Có nhiều cách để xác định số lượng và chất lượng ARN[1], trong đó phương pháp phổ biến hiện nay vừa đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm ARN là sử dụng máy quang phổ “giọt nano” (NanoDrop spectrometer), trong đó chất lượng ARN được xác định dựa vào hai tỉ số giữa các bước sóng là 260/280 và 260/230, ARN có chất lượng tốt khi có hai tỉ số này tiệm cận 2,0. * Xác định tính nguyên vẹn của ARN Mặc dù đã được xác định chất lượng bằng kĩ thuật NanoDrop, nhưng để khẳng định ARN được phân lập tốt và có thể sử dụng trong các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại, đắt tiền như RT-qPCR, Mcroarray. Chúng tôi tiến hành kiểm tra tính toàn vẹn của ARN bằng phương pháp điện di trên thạch 1,5% (thạch được chuẩn bị trước có chứa Gelred với tỉ lệ 1/10000). 113 Chu Đình Tới * Phương pháp phân lập ARN đối chứng ARN được phân lập bằng phương pháp thương quy theo hướng dẫn của hãng Qiagen sử dụng kít phân lập RNeasy Mini kit (Qiagen, 74106). Phương pháp này cũng đã được chúng tôi sử dụng, kiểm chứng trong công trình đã công bố [3]. 2.3. Kết quả và thảo luận * Phương pháp nghiên cứu đảm bảo số lượng và chất lượng ARN Ở thí nghiệm này, sau khi phân lập ARN, số lượng và chất lượng ARN được xác định bằng cách pipet 1,6 µL dung dịch ARN cho vào đầu đọc máy NanoDrop spectrometer và chạy phầm mềm trên máy tính. Kết quả ARN phân lập từ 20 mẫu mô chuột bằng phương pháp nghiên cứu và phương pháp đối chứng như trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân lập ARN từ mô chuột thí nghiệm theo phương pháp nghiên cứu (NC) và đối chứng (ĐC) Stt Chuột Mẫumô Nồng độ ARN (ng/µL) Tổng số ARN (ng/32µL) Tỉ số (260/280) Tỉ số (260/230) Đánh giá ARN A. Phân lập theo phương pháp nghiên cứu 1 1 Mỡ-1 241,97 7259,10 2,00 2,01 tốt 2 2 Mỡ-2 133,76 4012,80 2,06 2,01 tốt 3 3 Mỡ-3 176,47 5294,10 2,02 1,94 tốt 4 4 Mỡ-4 164,36 4930,80 2,02 2,08 tốt 5 5 Mỡ-5 123,41 3702,30 2,02 2,03 tốt 6 1 Gan-1 1661,7 106348,80 2,02 2,06 tốt 7 2 Gan-2 1496,38 95768,32 2,02 1,91 tốt 8 3 Gan-3 1327,55 84963,20 2,04 2,04 tốt 9 4 Gan-4 1302,46 83357,44 2,02 1,91 tốt 10 5 Gan-5 2082,59 133285,76 2,01 1,91 tốt 11 1 Cơ-1 134,45 4033,50 2,04 1,95 tốt 12 2 Cơ-2 57,94 1738,20 1,96 1,91 tốt 13 3 Cơ-3 108,45 3253,50 1,98 1,96 tốt 14 4 Cơ-4 97,73 2931,90 1,97 1,92 tốt 15 5 Cơ-5 71,17 2135,10 1,98 1,97 tốt 16 1 Tim-1 276,63 8298,90 2,06 2,02 tốt 17 2 Tim-2 420,59 12617,70 2,02 2,06 tốt 18 3 Tim-3 141,31 4239,30 2,05 1,95 tốt 19 4 Tim-4 422,38 12671,40 2,03 2,06 tốt 20 5 Tim-5 327,66 9829,80 2,05 2,03 tốt B. Phân lập theo phương pháp đối chứng sử dụng RNeasy Mini kit 1 1 Mỡ-1 223,67 7157,44 1,98 2,04 tốt 6 1 Gan-1 1560,06 49921,92 2,11 2,05 tốt 11 1 Cơ-1 114,51 3664,32 2,06 1,98 tốt 16 1 Tim-1 279,82 8954,24 2,09 1,99 tốt Bảng 1 cho thấy, tất cả 25 mẫu mô chuột được phân lập bằng phương pháp trên cho ARN với nồng độ cao (hầu hết trên 100 ng/µL) và chất lượng đảm bảo, thể hiện qua hai tỉ số 260/280 và 260/230 đều sấp sỉ 2,0 khi được kiểm tra bằng máy quang phổ kế giọt nano. So sách kết quả 114 Quy trình phân lập ARN từ mô chuột thí nghiệm trong nghiên cứu sinh y phân lập giữa phương pháp thí nghiệm (A) và phương pháp đối chứng (B) cho thấy phương pháp phân lập của chúng tôi cho số lượng và chất lương ARN tương đương với phương pháp đối chứng. Bảng 1 cũng chỉ ra rằng, phương pháp phân lập ARN này có thể áp dụng cho cả các mô khác ngoài mô mỡ, như mô tim, mô cơ và mô gan. Trong đó, cùng một khối lượng mô ban đầu (100 - 200 mg), mô gan cho tổng số ARN nhiều nhất trong khi ít nhất ở mô cơ. * Phương pháp nghiên cứu tốn thời gian hơn nhưng giá thành rẻ hơn phương pháp đối chứng Bảng 2. Thời gian và chi phí ước tính cho phân lập ARN Phương pháp phân lập ARN Thời gian ước tính/ 1 mẫu(1) Chi phí ước tính/ 1 mẫu(2) Chất lượng ARN Nghiên cứu 2,5 - 3,5 giờ 228 - 330 Đô la Mỹ Tốt Đối chứng 1,5 - 2,0 giờ 350 - 450 Đô la Mỹ Tốt (1)Thời gian được tính từ thời điểm bắt đầu phân lập ARN; (2) Chi phí được tính cho mẫu vật, vật liệu và máy móc nghiên cứu Dựa trên thời gian và chi phí ướng tính (Bảng 2) cho việc phân lập ARN từ một mẫu mô chuột, chúng ta có thể thấy phương pháp của chúng tôi tiêu tốn thời gian nhiều hơn so với phương pháp đối chứng. Tuy nhiên khi so sánh về chi phí thì phương pháp này ưu điểm hơn phương pháp đối chứng. Trong khi cả hai phương pháp đều cho chất lượng ARN tốt như trình bày trong Bảng 1. * Phương pháp nghiên cứu đảm bảo tính toàn vẹn của ARN Ở đây, chúng tôi chỉ kiểm tra đại diện 1 mẫu/1 loại mô, trừ cơ tim là 2 mẫu. Dựa trên nồng độ ARN, chúng tôi tính toán, pha loãng để đạt được nồng độ 100 µg ARN/15 µL dung dịnh, dung dịch này gồm nước cất vô trùng không chứa ADN, ARN và Cresol (với tỉ lệ pha loãng Cresol là 1/5). 15 µL ARN (100 µg) được pitpet vào mỗi giếng của thạch 1,5% và chạy ở điều kiện 90V trong 30 - 40 phút, khi kiểm tra thấy các vạch mẫu ở giữa của thạch thì dừng lại. Kết quả được đọc bằng máy đọc UV như trình bày ở Hình 1. Hình 1. Kiểm tra tính toàn vẹn ARN Hình 1 cho thấy, ARN phân lập từ các mô chuột bằng phương pháp trên đảm bảo tính toàn vẹn với hai tiểu phần ARN riboxom phân biệt rõ ràng như thể hiện ở vạch 28S và 18S. Với kết quả này, chúng tôi có thể sử dụng ARN đã được phân lập cho các mục đích xa hơn. 115 Chu Đình Tới 3. Kết luận Trên đây chúng tôi đã giới thiệu chi tiết quy trình, trình tự các bước phân lập ARN từ mô động vật để nghiên cứu trong sinh y. Áp dụng quy trình này vào việc phân lập ARN từ các mô mỡ, cơ, tim và gan của chuột thí nghiệm cho thấy: - Số lượng ARN được đảm bảo; - Chất lượng ARN tốt và tính nguyên vẹn của ARN được bảo toàn; - Phương pháp phân lập ANR của chúng tôi mặc dù tốn nhiều thời gian hơn, nhưng chi phí lại rẻ hơn so với phương pháp đối chứng sử dụng kít thương mại. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Barbas, C.F., et al., 2007. Quantitation of DNA and ARN. Cold Spring Harbor Protocols, 11: p. pdb.ip47. [2] Chomczynski, P. and N. Sacchi, 2006. The single-step method of ARN isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protocols, 1(2): pp. 581-585. [3] Chu, D.-T., et al., 2014. Expression of Adipocyte Biomarkers in a Primary Cell Culture Models Reflects Preweaning Adipobiology. Journal of Biological Chemistry, . 289(26): pp. 18478-18488. [4] Cirera, S., 2013. Highly efficient method for isolation of total ARN from adipose tissue. BMC Research Notes, 6(1): p. 472. [5] Higgs, P.G., 2000. ARN secondary structure: physical and computational aspects. Quarterly Reviews of Biophysics, 33(03): pp. 199-253. [6] Liu, X. and S. Harada, 2001. ARN Isolation from Mammalian Samples, in Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. [7] Mattick, J.S. and M.J. Gagen, 2001. The Evolution of Controlled Multitasked Gene Networks: The Role of Introns and Other Noncoding RNAs in the Development of Complex Organisms. Molecular Biology and Evolution, 18(9): pp.1611-1630. ABSTRACT A method to isolate ARN from mouse tissue DNA and ARN are commonly used to investigate, diagnose and develop promising methods to prevent and treat health disorders in humans and animals. ARN that is isolated from animal cells is an important research material in modern biomedical laboratories. In this paper we present a method to isolate ARN from mouse tissue using TRI Reagent. The results show that this method provides an ARN of good quantity, quality and integrity when compared to a control method using a RNeasy Mini kit. The TRI Reagent method required more time but it cost less than the control method. 116