Sàng lọc và xây dựng quy trình định lượng Polyphenol từ một số dược liệu hướng tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 221 SÀNG LỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG POLYPHENOL TỪ MỘT SỐ DƢỢC LIỆU HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ, BẢO VỆ GAN Huỳnh Thị Như Thuý*, Nguyễn Hữu Lạc Thuỷ*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Ngày nay, các chứng bệnh về gan đang trở thành một trong số bệnh phổ biến và có nguy cơ tử vong cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Nh}n d}n thường dùng thuốc có tác dụng bảo vệ gan chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật. Y học hiện đại sử dụng dưới dạng cao chiết toàn phần hay hoạt chất tinh khiết. Hiện nay, một trong những hướng phát triển là chứng minh tác dụng của cao toàn phần, cao ph}n đoạn và hoạt chất tinh khiết của dược liệu bằng những mô hình thử nghiệm với các trang thiết bị hiện đại để có kết luận khoa học. Nghiên cứu này nhằm góp phần tìm ra dược liệu, hoạt chất có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan làm cơ sở nghiên cứu thuốc có tác dụng hỗ trợ, bảo vệ gan. Đối tượng nghiên cứu: 50 mẫu nguyên liệu được thu mua ở nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp Hồ Chí Minh. Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của 50 dược liệu bằng phương ph{p đo quang phổ với phép thử DPPH. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol trong c{c dược liệu tiềm năng bằng phương ph{p đo quang với thuốc thử Folin - Ciocalteu. Thử tác dụng bảo vệ gan in vivo theo hướng chống oxy hóa của dược liệu tiềm năng trên mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid. Kết quả: Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá. Đã s|ng lọc được 5/50 dược liệu có hoạt tính chống oxy hoá, ức chế trên 85% ở cùng nồng độ 60 g/ml: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc, Kim ngân hoa. Chọn dung môi có khả năng chiết cao toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá tốt nhất: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc: cồn 70%; Kim ngân hoa: cồn 50%. X{c định IC50 của các cao toàn phần. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol. Với phương ph{p quang phổ UV - Vis dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu, quy trình đã được thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 0,0141x + 0,0267, R2 = 1,00 với khoảng nồng độ khảo sát 10,0 – 60,0 (μg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,7 %) v| độ đúng (tỉ lệ phục hồi 99,86%). Mẫu thử Polyphenol (%) IC50 (µg/ml) Cao cồn 70% Cốt khí củ 10,09 30,67 Cao cồn 70% Hậu phác 9,34 33,20 Cao cồn 70% Trâm mốc 9,20 85,54 Cao cồn 50% Kim ngân hoa 7,93 162,39 Cao cồn 70% Hòe 7,29 118,48 Thử tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa in vivo. Cao cồn 70% Cốt khí củ có tác dụng bảo vệ gan ở liều 0,9 v| 1,8 g/kg (tương đương 6,11 g v| 12,22 g dược liệu khô/kg). Kết luận: Cao cồn 70% Cốt khí củ là cao chiết có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất trong 50 mẫu nguyên liệu (tương đương 200 mẫu cao), đồng thời có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan in vivo. Từ khóa: cốt khí củ, sàng lọc, DPPH, Folin–Ciocalteu, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, cyclophosphamid *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 091.551.7890 Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 222 ABSTRACT SCREENING AND DETERMINATION OF POLYPHENOL OF MEDICAL PLANTS ON ANTIOXIDANT ACTIVITIES, HEPATOPROTECTIVE EFFECT Huynh Thi Nhu Thuy, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:221 - 228 Background – Objectives: Nowadays, hepatitis is becoming one of the common, high risk of death deseases in Viet Nam and around the world. People often use medical plants to protect liver. Morden medicine use extract, pure subtances. Demonstrating the effect of extracts, pure subtances by test methods and modern equipments is currently a development trend. The aim of the present study was to indicate more antioxidant, hepatoprotective medical plants, constituents. That will be the basis for hepatoprotective drug studies. Materials: 50 antioxidant medical plants were purchased in Pharmacy of traditional medicines, in District 5, Ho Chi Minh city. Methods: UV–visible spectroscopy method with DPPH for screening of 50 medical plants on antioxidant activities. Determination and validation of Folin-Ciocalteu for the determinatin of polyphenol content in antioxidant medical plants. In vivo, hepatoprotective effect was evaluated in mice induced liver damage by cyclophosphamid. Results: Screening in vitro of herbal plant on antioxidant activities. The best results were obtained for 5/50 antioxidant medical plants which inhibit over 85% at the same concentration - 60 g/ml: Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. Polygonaceae (1), Magnolia officinalis Rehd. et Wils Magnoliaceae (2), Styphnolobium japonicum L. Fabaceae (3), Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae (4), Syzygium cumini L. Myrtaceae (5). Ethanol 70% is the best solvent for strongest antioxidant properties: (1), (2), (3), (5), 50% ethanol is the best for (4). Determinate IC50 of whole extracts. Determination and validation for the determinatin of polyphenol content. The determinatin of polyphenol content by Folin-Ciocalteu was validated specificity, showed linearity range (10.0– 60.0 g/mL; ŷ = 0.0141x + 0.0267, R2 = 1.00), repeatability with RSD = 2.7 % and accuracy with recovery ratio 99,86 %. Samples Polyphenol(%) IC50 (µg/ml) 70% ethanol extract (1) 10.09 30.67 70% ethanol extract (2) 9.34 33.20 70% ethanol extract (5) 9.20 85.54 50% ethanol extract (4) 7.93 162.39 70% ethanol extract (3) 7.29 118.48 In vivo hepatoprotective effect. 70% ethanol extract (1) has hepatoprotective effect at dose 0.9; 1.8 g/kg (equivalent to 6.11 g; 12.22 g dried herb/kg). Conclusions: The highest antioxidant activities, hepatoprotective effect in 50 medical plants (200 extracts) is 70% ethanol extract of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. Polygonaceae. Keywords: Polygonum cuspidatum, screening, DPPH, Folin – Ciocalteu, antioxidant activity. ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là một t{c nh}n độc hại gây ra nhiều bệnh nhƣ bệnh về đƣờng tim mạch, các bệnh về g n, ung thƣ Về mặt hóa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học với các hợp chất nhƣ protein, lipid, c rbohydr t, < trong cơ thể Điều này dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây nên các bệnh Do đó, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc ức chế các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do l| điều cần thiết(3) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 223 Ngày nay, các chứng bệnh về g n đ ng trở thành một trong số bệnh phổ biến v| có nguy cơ tử vong cao ở Việt N m cũng nhƣ trên thế giới. Hiện nay, một trong những hƣớng phát triển là chứng minh tác dụng của cao toàn phần, cao ph}n đoạn và hoạt chất tinh khiết củ dƣợc liệu bằng những mô hình thử nghiệm với các trang thiết bị hiện đại để có kết luận khoa học. Mục tiêu củ đề tài là: sàng lọc một số dƣợc liệu có tính chống oxy hoá in vitro, xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng polyphenol trong các cao chiết tiềm năng nhằm chọn r dƣợc liệu có tác dụng chống oxy hoá tốt nhất, thử tác dụng bảo vệ gan in vivo của cao chiết tiềm năng ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 50 mẫu nguyên liệu đƣợc thu mua ở nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp HCM. Thiết bị chính Hệ thống quang phổ UV - Vis Shimadzu 2550 (Japan), cân phân tích Sartorius Practum 224-1S (0,1 mg; 0,01 mg). Các thiết bị n|y đã đƣợc hiệu chuẩn theo quy định. Dung môi - hóa chất Natri carbonat, sắt (III) clorid (Trung Quốc), thuốc thử Folin - Ciocalteu, 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH Merck – Đức), cyclophosphamid, acid tricloroacetic, acid thiobarbituric Sigma – Aldrich (Mỹ). Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá Chiết xuất cao toàn phần Cân 50 g mỗi bột dƣợc liệu, chiết bằng phƣơng ph{p ngấm kiệt, khảo sát với các dung môi chiết cồn 96%, 70%, 50% và cồn 25%. Toàn bộ dịch chiết đƣợc thu hồi dung m i đến cao đặc. Chọn dung môi chiết và c{c dƣợc liệu cho kết quả thử nghiệm DPPH cao nhất. T{ch ph}n đoạn cao toàn phần Chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần từ n–hexan, cloroform và ethyl acetat. Dịch chiết từng ph}n đoạn đƣợc thu hồi dung m i đến c o đặc, các mẫu cao n-hexan, cao cloroform và cao ethyl acetat là mẫu thử cho thử nghiệm sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa. Thử nghiệm sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá (phép thử DPPH) Mẫu thử (các mẫu thử cùng nồng độ 60 g/ml): cân 0,15 g lần lƣợt các cao (toàn phần 96%; 70%; 50%; 25% v| c{c c o ph}n đoạn) hòa t n v| điền đầy bằng meth nol trong bình định mức 100 ml. Lọc lấy dịch, lấy chính xác 2 ml dịch lọc n|y cho v|o bình định mức 50 ml, điền đầy bằng methanol (dịch thử T). Pha các dung dịch vitamin C ở các nồng độ 1,25; 2,50; 3,75; 5,00; 6,25 µg/ml trong methanol. Thuốc thử DPPH: DPPH hòa tan trong methanol nồng độ 0,15 mg/ml (bảo quản ở 4 oC, tránh ánh sáng). Phản ứng x{c định hoạt tính chống oxy hóa Trong bình định mức 10 ml, cho 2 ml thuốc thử DPPH, 1 ml dung dịch thử nghiệm, điền meth nol đến vạch Để yên 30 phút, tránh ánh sáng, quét phổ trong khoảng bƣớc sóng 200 – 800 nm để tìm bƣớc sóng cực đại. Tiến hành song song với mẫu đối chứng trong cùng điều kiện nhƣng kh ng có dung dịch thử. Mẫu trắng sử dụng l| meth nol X{c định độ hấp thu tại bƣớc sóng hấp thu cực đại, phần trăm hoạt tính chống oxy hó S% đƣợc x{c định theo công thức sau: Từ kết quả khảo sát, chọn c{c dƣợc liệu có hoạt tính chống oxy ho{ c o có %S > 85% để khảo sát IC50 v| x{c định h|m lƣợng polyphenol. Xác định IC50 của các mẫu thử và vitamin C Pha các dung dịch thử nghiệm có nồng độ tăng dần cho tác dụng với cùng một lƣợng DPPH X{c định độ hấp thu và xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính X{c định IC50 từ phƣơng trình hồi quy. Giá trị IC50 mẫu thử có Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 224 nồng độ càng thấp, tác dụng loại bỏ gốc tự do càng mạnh, khả năng chống oxy hóa càng cao. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol Chọn cao toàn phần hoặc c o ph}n đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất đã khảo sát, tiến hành xây dựng quy trình định lƣợng polyphenol bằng phƣơng ph{p qu ng phổ với thuốc thử FC. Mẫu đối chiếu Dung dịch acid gallic 20 µg/ml (ddA). Mẫu thử Cân chính xác khoảng 1 g cao cồn 70% Cốt khí củ cho v|o bình định mức 100 ml, thêm nƣớc đến vạch, siêu âm ở 50 ± 5 oC trong 15 phút, lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc cho v|o bình định mức 100 ml điền đến vạch bằng nƣớc cất thu đƣợc dung dịch thử (T). Khảo s{t quy trình định lượng polyphenol Quét phổ mẫu thử và mẫu đối chiếu trong khoảng bƣớc sóng từ 400 – 800 nm, x{c định cực đại hấp thu. Khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối chiếu A, dịch chiết T với thuốc thử FC Trong bình định mức 10 ml: cho lần lƣợt X ml (0,5; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0) dung dịch đối chiếu A (hoặc dung dịch thử T), cố định 1 ml thuốc thử FC và 5 ml dung dịch natri carbonat 20%. Lắc đều, x{c định độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại đã khảo sát. Chọn thể tích dung dịch thử T cho độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại tƣơng đƣơng với mẫu đối chiếu A. Đồng thời khảo s{t độ ổn định của mẫu dung dịch đối chiếu A, dung dịch thử T tại các thời điểm 0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 25’, 30’, 35’, 40’, 45’, 50’, 55’, 60’ Từ các kết quả khảo sát, viết dự thảo quy trình và thẩm định theo quy định của ICH. Thẩm định quy trình Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng dẫn của ICH(4) bao gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính x{c, độ đúng Quy trình s u khi đạt yêu cầu thẩm định đƣợc ứng dụng định lƣợng các mẫu c o dƣợc liệu tiềm năng đã đƣợc sàng lọc. Thử tác dụng sinh học trên mô hình in vivo X{c định độc tính cấp đường uống(1,2) Số lƣợng chuột thí nghiệm: 10 con, hoặc tuỳ vào số liều thử nghiệm. Nhiệt độ phòng thử nghiệm: 29 – 300C. Chuột nhịn đói 12 giờ trƣớc khi tiến hành thử nghiệm. Cho chuột uống liều cao cồn 70% Cốt khí củ liều cao nhất qua kim với thể tích 20 ml/kg. Theo dõi các phản ứng xảy ra trên chuột trong vòng 72 giờ Đ{nh gi{ dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (chết hay sống) của chuột thử nghiệm. Tính tần suất chuột chết ở các lô khảo sát và tính liều LD50. Mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid (CY)(1,2) Cân chuột trƣớc khi tiêm cyclophosphamid, khi cho uống mẫu thử v| trƣớc khi định lƣợng MDA. Thời gian cho uống hằng ngày từ 8 đến 9 giờ sáng, uống liên tục trong 8 ngày. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ tách lấy gan chuột đem định lƣợng MDA. Bảng 1: Bố trí thí nghiệm Nhóm Lô (n=9) Liều thử nghiệm Tiêm phúc mạc CY CY (-) Chứng bình thường Nước cất - CY (+) Chứng bệnh lý Nước cất 150 mg/kg Cao cồn 70% Cốt khí củ 0,9 g cao/kg thể trọng chuột Cao cồn 70% Cốt khí củ 1,8 g cao/kg thể trọng chuột Silymarin 0,1 g/kg thể trọng chuột X{c định h|m lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột: Cách tiến hành Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 %, tỷ lệ khối lƣợng gan - Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 225 thể tích dung dịch KCl (1:9), trong 1 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút, 0 - 5 oC S u đó, lấy 2 ml dịch đồng thể cho định lƣợng MDA), bổ sung dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vừ đủ 3 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37 oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid trichloroacetic TCA 10% S u đó, đem ly tâm hỗn hợp ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 5 oC. Sau khi ly tâm lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml thiobarbituric acid 0,8% ở 100 oC trong 15 phút v| đo qu ng ở λ = 532 nm H|m lƣợng MDA nM/g protein đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. KẾT QUẢ Kết quả sàng lọc bằng phép thử DPPH tác dụng chống oxy hoá 50 mẫu dƣợc liệu 13/200 cao chiết có hoạt tính chống oxy hoá > 85% ở nồng độ 60 g/ml là củ c{c dƣợc liệu: Hậu phác, Trà, Cốt khí củ, Hòe, Kim ngân hoa, Diệp hạ châu, Trâm mốc Trong đó, h i dƣợc liệu Trà và Diệp hạ ch}u đã có nhiều công trình công bố hoạt tính chống oxy hoá(5,6). Do đó 5 dƣợc liệu Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Kim ngân hoa, Trâm mốc đƣợc chọn cho các nghiên cứu sàng lọc tiếp theo. Cồn 70% l| dung m i đƣợc chọn chiết cao toàn phần c{c dƣợc liệu: Cốt khí củ, Hậu phác, Hoè, Trâm mốc với tác dụng chống oxy hoá tốt nhất, cồn 50% đƣợc chọn chiết cao toàn phần của Kim ngân hoa. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hoá bằng phép thử DPPH các cao phân đoạn và cao toàn phần: Bảng 2: Kết quả sàng lọc chọn dung môi chiết cao toàn phần của 5 dược liệu tiềm năng Tên mẫu dược liệu Cao cồn 96% Cao cồn 70% Cao cồn 50% Cao cồn 25% A S% A S% A S% A S% 1 Cốt khí củ 0,1477 78,9 0,0343 95,1 0,0511 92,7 0,0728 89,6 2 Hậu phác 0,1919 72,6 0,0553 92,1 0,2962 57,7 0,3081 56,0 3 Hòe 0,2416 65,5 0,1400 80,0 0,2094 70,1 0,1568 77,6 4 Trâm mốc 0,1708 75,6 0,0931 86,7 0,2220 68,3 0,1828 73,9 5 Kim ngân hoa 0,1288 81,6 0,1751 75,0 0,0574 91,8 0,0693 90,1 Bảng 3: Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các phân đoạn (nồng độ 60 g/ml) Độ hấp thu (A) và % ức chế Cốt khí củ Hậu phác Hòe Trâm mốc Kim ngân hoa Cao toàn phần (A) % ức chế 0,0343 95,1% 0,0553 92,1% 0,1400 80,0% 0,0931 86,7% 0,0574 91,8% A cao n–hexan (A) % ức chế 0,2941 58,0% 0,5546 20,8% 0,6687 4,5% 0,6988 0,2% 0,3809 45,6% A cao cloroform (A) % ức chế 0,3333 52,4% 0,3851 45,0% 0,6231 11,0% 0,6854 2,1% 0,4586 34,5% A cao ethyl acetat (A) % ức chế 0,0602 91,4% 0,077 89,0% 0,4796 31,5% 0,098 86,0% 0,0735 89,5% Cao toàn phần củ 5 dƣợc liệu dƣợc chọn đều có hoạt tính chống oxy hoá tốt hơn so với c{c c o ph}n đoạn Do đó tiếp tục chọn 5 mẫu cao toàn phần x{c định IC50 và xác định hàm lƣợng polyphenol trong cao chiết. Kết quả xác định IC50 của các cao cồn toàn phần và vitamin C Kết quả thực nghiệm trên cho thấy cao Cốt khí củ có IC50 thấp nhất. Nhóm hợp chất polyphenol trong dƣợc liệu đã đƣợc các tài liệu chứng minh có liên qu n đến tác dụng chống oxy hoá. Vì vậy, h|m lƣợng polyphenol đƣợc khảo s{t để khẳng định thêm hoạt tính chống oxy hoá. Chọn cao Cốt khí củ để làm mẫu thử khảo sát và xây dựng quy trình định lƣợng polyphenol trong các cao Hậu phác, cao Hòe, cao Trâm mốc, cao Kim ngân hoa (Hình 1). Kết quả khảo sát quy trình định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp quang phổ với thuốc thử FC: Cực đại hấp thu dung dịch đối chiếu acid gallic là 761,8 nm; dung dịch thử T là 761 nm, vì vậy chọn bƣớc sóng 761 nm là cực đại hấp thu của quy trình. Kết quả khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối chiếu A, dung dịch thử T với thuốc thử FC 1 ml thuốc thử FC đủ phản ứng với nồng độ 60 µg/ml dung dịch đối chiếu A tƣơng đƣơng 3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 226 ml); và 1 ml thuốc thử FC phản ứng với nồng độ 600 µg/ml dung dịch thử T, thời gian ổn định sau 10 phút đến 60 phút. Dự thảo quy trình định lƣợng polyphenol trong cao cồn 70%: Thực hiện phản ứng theo bảng 1. Bảng 4: Pha chế các dung dịch thử nghiệm Mẫu đối chiếu Mẫu thử Mẫu trắng Dung dịch đối chiếu (ml) 1,0 0,0 0,0 Dung dịch thử (ml) 1,0 1,0 0,0 Thuốc thử FC (ml) 1,0 1,0 1,0 Dung dịch Na2CO3 20% (ml) 5,0 5,0 5,0 Nước cất vừa đủ (ml) 10 y = 1,6037x + 0,82 R² = 0,997 0 50 100 150 0 20 40 60 80 % S Nồng độ (µg/ml) Cốt khí củ; y = 1,6037x + 0,82 với R2 = 0,9977; IC50 30,67 µg/ml Hậu phác; y = 1,4798x + 0,8647 với R2 = 0,9946; IC50 33,20 µg/ml Trâm mốc; y = 0,5457 + 4,9557 với R2 = 0,996; IC50 85,54 µg/ml Hòe; y = 0,3757x + 5,4929 với R2 = 0,9988; IC50 118,48 µg/ml Kim ngân hoa; y = 0,3036x + 0,6976 với R2 = 0,9992; IC50 162,39 µg/ml Vitamin C; y = 9,4197x + 1,4061 với R2 = 0,9996; IC50 5,16 µg/ml Hình 1: Đồ thị tương quan giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của một số mẫu dược liệu khảo sát và chất đối chiếu vitamin C Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 227 Lắc đều, để yên các bình phản ứng trong 15 phút H|m lƣợng P % polyphenol đƣợc tính từ độ hấp thu của mẫu đối chiếu và mẫu thử tại bƣớc sóng 761 nm. Mẫu đối chiếu: dung dịch acid gallic: 20 µg/ml. H|m lƣợng P (%) polyphenol (qui về acid g llic đƣợc tính theo công thức sau: AC: độ hấp thu mẫu đối chiếu AT: độ hấp thu của mẫu thử m: khối lượng mẫu thử (g) C%: độ tinh khiết acid gallic (98%) H%: độ ẩm cao chiết (5,4%) Kết quả thẩm định quy trình Kết quả khảo sát độ đặc hiệu - Mẫu trắng không có tín hiệu tại bƣớc sóng cực đại của mẫu đối chiếu và mẫu thử. - Cực đại hấp thu của mẫu thử λ = 761 nm tƣơng đƣơng với cực đại hấp thu của mẫu đối chiếu λ = 761,8 nm - Khi thêm một lƣợng chất đối chiếu vào mẫu thử thì độ hấp thu của mẫu thử A761 = 0,3002 tăng lên A761 = 0,4160 so với trƣớc khi thêm chất đối chiếu. Kết luận: quy trình đạt độ đặc hiệu. Kết quả thẩm định quy trình định lượng polyphenol Bảng 5: Kết quả các thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình Chỉ tiêu Kết quả Khoảng tuyến tính Phương trình hồi quy ŷ = 0,0141x + 0,0267 Hệ số R 2 = 1 (khoảng nồng độ khảo sát 10,0 – 60,0 μg/ml) Độ lặp lại RSD% của hàm lượng polyphenol 2,7 % Độ đúng Tỷ lệ phục hồi 99,86 % Kết quả ứng dụng quy trình định lƣợng các mẫu cao toàn phần Từ kết quả ở bảng 6, có thể kết luận cao Cốt khí củ có h|m lƣợng polyphenol cao nhất ≈10% và hoạt tính oxy hóa hiệu quả nhất so với 50 dƣợc liệu sàng lọc b n đầu. Bảng 6: Kết quả định lượng polyphenol trong các cao toàn phần và IC50 của c{c dược liệu Mẫu thử Polyphenol (%) IC50 (µg/ml) Cao cồn 70% Cốt khí củ 10,09 30,67 Cao cồn 70% Hậu phác 9,34 33,20 Cao cồn 70% Trâm mốc 9,20 85,54 Cao cồn 50% Kim ngân hoa 7,93 162,39 Cao cồn 70% Hòe 7,29 118,48 Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan in vivo Kết quả xác định độc tính cấp đường uống cao cồn 70% Cốt khí củ Từ kết quả khảo s{t độc tính cấp đƣờng uống của cao cồn 70%, tính đƣợc liều tối đ không gây chết chuột (LD0) là 19,5 g/kg thể trọng chuột tƣơng đƣơng 132,5 g dƣợc liệu khô). Kiến nghị liều thử nghiệm là 0,9 g/kg (1/22 LD0 và tƣơng đƣơng với 6,11 g dƣợc liệu khô/kg thể trọng chuột) và 1,8 g/kg (1/11 LD0 v| tƣơng đƣơng với 12,22 g m dƣợc liệu khô/kg thể trọng chuột). Kết quả khảo s{t h|m lƣợng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột đƣợc trình bày ở bảng 7. Bảng 7: Kết quả khảo s{t h|m lượng MDA trong gan chuột Nhóm Lô (n=9) Hàm lượng MDA (nM/g protein) CY (-) Chứng sinh lý 30,576 ± 2,023 CY (+) Chứng bệnh lý 67,813 ± 2,556 ** Cao cồn 70% Cốt khí củ 0,9 g/kg 39,842 ± 5,732 # Cao cồn 70% Cốt khí củ 1,8 g/kg 40,147 ± 2,862 ## Silymarin 0,1 g/kg 33,089 ± 2,864 ## ** P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. # P < 0,05 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. ## P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Mẫu thử nghiệm đƣợc cho uống ở liều 0,9 và 1,8 g/kg thể trọng chuột trong 8 ngày trên chuột bị gây tổn thƣơng g n bằng cyclophosphamid thể hiện tác dụng bảo vệ g n theo hƣớng chống oxy hóa. Cụ thể, h|m lƣợng MDA ở lô chuột Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 228 uống liều 0,9 và 1,8 g/kg giảm lần lƣợt là: 41,2%; 40,8% so với l đối chiếu silym rin, h|m lƣợng MDA ở lô này giảm 51,2%. BÀN LUẬN Bằng phương pháp quang phổ với thuốc thử DPPH, chúng tôi đã sàng lọc và chọn được 5/200 dược liệu có tác dụng chống oxy hóa (S%>80%); nồng độ cồn để chiết cao chiết cũng ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa. Trong số 5 dược liệu, 4 loại được chiết bằng cồn 70% hiệu quả hơn Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc so với Kim ngân hoa (cồn 50%). Các cao phân đoạn đều có hoạt tính kém hơn cao cồn toàn phần, IC50 của cao cốt khí củ thấp nhất và tương đương với 16% so với vitamin C. Kết quả này tương thích với kết quả xác định hàm lượng polyphenol trong cao cốt khí củ bằng quy trình đo quang với thuốc thử Folin-Ciocaltue. Bảng 2 và 3 trình bày kết quả thử nghiệm chống oxy hóa bằng thuốc thử DPPH. Bảng 6 trình bày kết quả định lượng polyphenol và IC50 của các mẫu khảo sát. Từ kết quả ở bảng 2, 3 và 6, chúng tôi chọn cao cồn 70% chiết từ dược liệu cố khí củ để khảo sát in vivo hoạt tính bảo vệ gan so sánh với silymarin. Mẫu thử thể hiện tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa qua hàm lượng MDA ở lô chuột uống liều 0,9 và 1,8 g/kg giảm lần lượt là: 41,2%; 40,8% so với lô đối chiếu silymarin, hàm lượng MDA giảm 51,2%. Bảng 7 trình bày kết quả khảo sát hoạt tính bảo vệ gan khi gây độc bằng cyclophosphamid và so sánh với chất đối chiếu silymarin. KẾT LUẬN Bằng phƣơng ph{p s|ng lọc hoạt tính chống oxy hoá với thuốc thử DPPH và kết hợp với thử nghiệm xây dựng v| định lƣợng polyphenol trong các cao chiết, chúng t i đã x{c định đƣợc cao chiết bằng cồn 70% củ dƣợc liệu Cốt khí củ (IC50 30,67 µg/ml; P% polyphenol 10%) có tác dụng chống oxy hóa khi so sánh với chứng dƣơng vit min C; từ kết quả khảo sát in vivo trên chuột thực nghiệm và so với chất đối chiếu silymarin, có thể sơ bộ x{c định tác dụng bảo vệ gan củ dƣợc liệu Cốt khí củ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế, Viện Dƣợc Liệu 2006 , Phƣơng ph{p nghiên cứu tác dụng dƣợc lý từ dƣợc thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 102-110, 174-175, 279-290. 2. Đỗ Trung Đ|m 2014 , Phƣơng ph{p x{c định độc tính cấp của thuốc. 3. Gi sson I, Ischiropoulos H et l 2002 , “The rel tionship between oxidative/nitrative stress and pathological inclusions in Alzheimer’s nd P rkinson’s dise se”, Free Radical Biology & Medicine, 32 (12), pp. 1264-1275. 4. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp. 1–13. 5. Rich rd S , Joshu A , M rio GF 2014 , “Ch pter 4 – Antioxid nt C p city of Green Te C melli sinensis ”, Processing and Impact on Antioxidants in Beverages, pp. 33–39. 6. Shih-Hua F, Yerra KR, Yew-Min T 2008 , “Anti-oxidant and inflammatory mediator's growth inhibitory effects of compounds isol ted from Phyll nthus urin ri ”, Journal of Ethnopharmacology, 116 (2), pp. 333-340. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018