Seminar: Oxyrase

Vi sinh thực phẩmNhóm thực hiện:Bùi Thuý LoanVăn Thị ThuýTrần Minh TuấnSeminarOXYRASETổng quan về oxyraseĐặc tính và cơ chế hoạt động của oxyrase Phân đoạn màng có chức năng tương tự oxyrase Một số sản phẩm oxyrase hiện nayCác triển vọng trong tương lai 1) Tổng quan về oxyrase1.1 Định nghĩa1.2 Nguồn gốc1.3 Lợi ích Định nghĩaOxyrase là tên thương mại được đặt cho enzyme có khả năng khử oxy (hay enzyme mang chuỗi chuyển e- đóng vai trò quan trọng cho quá trình hô hấp mà bản chất là cytochrome)Theo định nghĩa của công ty OXYRASE Inc. Oxyrase là hỗn hợp thương mại của 2 loại enzym monooxygenase và dioxygenase có khả năng loại bỏ oxy một cách nhanh chóng và hoàn toàn ra khỏi môi trường lỏng và bán rắn (OXYRASE Inc., 1991).Một đơn vị hoạt tính Oxyrase được định nghĩa là lượng enzyme để khử 1,0% oxy hòa tan trong 1 giây trong 1 ml.Nguồn gốcPhân đoạn màng E.coli : Adler phát hiện oxyrase từ phân đoạn tế bào có chứa enzyme hô hấp có khả năng hình thành môi trường kỵ khí. Schnaitman (1970): E.ColiPhân đoạn váchPhân đoạn màngCytochrome và các enzyme khử khử O2 hoà tan thành H2O 1/3 protein màng bao1/2 phospholipidNhư vậy phân đoạn màng tế bào có chứa Oxyrase, cụ thể là ở bào quan MesosomeNguồn gốcLợi ích của oxyraseNhững khó khăn khi thao tác với đối tượng là vi sinh vật kị khí:Nhìn về mặt lý thuyết: Tập hợp vi sinh vật kị khí lớn, đa dạng Một số có khả năng gây bệnh cho ngườiTrong thực nghiệm: VSV kị khí rất khó nuôi cấy và tăng sinh. Nguyên nhân cốt lỏi chính là phải tạo được môi trường có điều kiện kị khí đảm bảo cho VSV kị khí có thể sống và sau đó là tăng sinh. Tại sao vấn đề này gặp khó khăn??? Trong thực tế: cho chất khử vào tạo môi trường kị khí chính chất khử tạo thành các peroxyde hữu cơ ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vậtSử dụng hệ thống rút không khí, bơm chân không, tạo hỗn hơp khí nhằm loại oxy hệ thống này lại khá cồng kềnh và phức tạp.Nếu tạo được môi trường kị khí thao tác khó khănOxyrase đã giải quyết vấn đề trênOxyrasePhục hồi và tăng sinh nhanh chóng các VSVKKCác đĩa nuôi cấy VSV kỵ khí có thể ủ chung với các đĩa nuôi cấy VSV hiếu khí trong cùng tủ ấm. Thao tác đơn giản, tiết kiệm không gian Khử oxy H2O, nhanh hiệu quả2) Đặc tính và cơ chế hoạt động của Oxyrase2.1 Các đặc tính của Oxyrase2.2 Cơ chế hoạt động của Oxyrase2.3 Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng vi sinh vật kị khíCác đặc tính của oxyraseKhử O2 thành H2O khi có mặt của chất cho điện tử. Phạm vi hoạt động của oxyrase:pH: 3.5-7.0Nhiệt độ: nhiệt độ phòng - 500CMối tương quan giữa nồng độ chất cho điện tử và nồng độ O2 hoà tan. Nồng độ chất cho điện tử phải tương ứng với nồng độ O2 hoà tan (1-10mM; <1mM). Cơ chế hoạt động của Oxyrase Về mặt bản chất: mono- và di-oxygenase. Xúc tác khử O2 thành nước. (lấy trực tiếp nguyên tử oxy từ không khí để thực hiện phản ứng oxi hóa cơ chất.) Là những enzyme quan trọng trong các quá trình biến dưỡng năng lượng và trao đổi chất. Đặc tính của oxyrase Về mặt lưu trữ: Ổn định trong 1 năm hoặc lâu hơn nếu Oxyrase được giữ đông ở -100C hoặc lạnh hơn. Quá trình đông và giải đông không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của nó.Vẫn hoạt động tốt trong 30 ngày nếu giữ ở nhiệt độ 2-80C.Giữ ở nhiệt độ phòng rất mau mất hoạt tính.Cơ chế hoạt động của oxyraseỞ vi khuẩn: Oxyrase nằm trên màng tế bào và thực hiện chức năng hô hấp. Oxyrase sử dụng hai loại cơ chất khác nhau: phân tử oxy và chất cho điện tử. Các chất cho điện tử bao gồm formate, lactate, succinate, -glycerophosphate.Khả năng hoạt động của oxyrase tăng hay giảm phụ thuộc vào bản chất của chất cho điện tửCơ chế hoạt động của oxyraseViệc khử O2 của enzyme màng phụ thuộc vào khả năng của hệ cytochrome, trong đó, Ubiquinone đóng vai trò chủ đạo nghĩa là thiếu Ubiquinone, hệ màng không thực hiện được chức năng khử O2 Chất cho điện tử sau khi bị oxi hóa thành chất khác không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV kị khí như: Lactate  pyruvate, formate  CO2 + H2O.* Hệ thống Oxyrase không làm thay đổi đáng kể pH của môi trường như hệ thống CO2 (Retsema et al,1991) Tác động của oxyrase lên sự tăng trưởng của vi sinh vật kị khíKhi dùng Oxyrase cần chú ý: Tạo được môi trường kị khí hay không? Có tác dụng kích thích sinh trưởng của VSV mục tiêu hay không? Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính và tốc độ khử O2 của enzyme Oxyrase và các phân đoạn màng có tính năng tương tự khác. Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng của Salmonella, Listeria,Campylobacter, E.coli O157 Tác động của oxyrase lên sự tăng trưởng của Salmonella và ListeriaTheo kết quả thực nghiệm của Fahimeh NirooMand và Daniel Y.C. Fung trong nghiên cứu “Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng của Salmonella spp. và Listeria monocytogenes trong môi trường tiền tăng sinh phổ quát” (1992)Tiền tăng sinh: môi trường này có tác dụng phục hồi VSV mục tiêu có trong mẫu trước khi thực hiện tăng sinh chúng trong môi trường chuyên biệt. Tác động của oxyrase lên sự tăng trưởng của CampylobacterMột số Campylobacter nuôi cấy thành công khi có sự hiện diện của Oxyrase trong môi trường nuôi cấy.Nuôi cấy lắc C. jejuni và C. coli ở 42oC trong dịch nuôi cấy brucella có sự hiện diện của Oxyrase. Khi gia tăng nồng độ Oxyrase từ 0-0,8 đơn vị/ml thì sự tăng trưởng của Campylobacter cũng tăng theo. Trong dãy nồng độ này, sự tăng trưởng nhanh nhất và thời gian thế hệ ngắn nhất của Campylobacter đạt được khi môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của Oxyrase ở nồng độ ≥ 0,6 đơn vị/ml. Ảnh hưởng của oxyrase lên Campylobacter chủ yếu trong pha log hơn là pha ổn định.Tác động của oxyrase lên sự tăng trưởng của E.coli O157OxyraseTM làm gia tăng sự tăng trưởng của E. Coli O157 O157 trong các mẫu thực phẩm và môi trường(Phebus et al. 1993; Thippareddi et al. 1995; Jiang et al.1998)Jiang et al. (1998): môi trường có OxyraseTM giúp hồi phục lượng nhỏ E. Coli O157 trong mẫu. Đặc biệt là trong trường hợp có các vi sinh vật cạnh tranh khác.3. Phân đoạn màng có chức năng tương tự oxyrase3.1 Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn3.2 Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi khuẩn (non- bacterial source)3. Phân đoạn màng có chức năng tương tự oxyrase3.1 Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn3.2 Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi khuẩn (non- bacterial source)Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn Chủng thí nghiệmCác bước thực hiệnTăng sinhThu nhận các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngChủng thí nghiệmChủng sử dụng: từ American Type Culture Collection (ATCC), Rock ville, MD gồm:Escherichia coli (E8) ATCC 11775Acetobacter xylinum ATCC 12878Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans ATTC33448Ngoài ra còn sử dụng các chủng: Pseudomonas aeruginosa, Acetobacter vinlandii, Mycobacterium phlei và cả Salnonella typhimurium Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn Chủng thí nghiệmCác bước thực hiệnTăng sinhThu nhận các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngPhân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn Chủng thí nghiệmCác bước thực hiệnTăng sinhThu nhận các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngEscherichia coli (E8) ATCC 11775Tăng sinhQui mô nhỏ: E.coli trong 250ml BHI, lắc 250v/ph trong 24hQuy mô lớn: nuôi tế bào E.coli trong các thiết bị lên men 2l , với mức thông khí là 0.5-1.0 thể tích/diện tích chất lỏng/phút ở 37oC trong 24hBảo quản trên thạch nghiêng BHI và cấy chuyền hàng thángAcetobacter xylinum ATCC 12878Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans ATTC33448Khôi phục tế bào trên môi trường manitol có pH 6,0 ± 0,2, ở 30oC trong 48h Tăng sinhQui mô nhỏ: chủng khởi động (1 – 2%) ủ trong 250 ml BHI – mannitol trong các bình 500 ml, sau đó đặt trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút Qui mô lớn: A. xylinum và G. oxydans được nuôi cấy trong các thiết bị lên men 2 lít với mức thông khí là 0,5 – 1,0 dung tích khí / dung tích chất lỏng ở 300C trong thời gian 36h và 24h . Bảo quản ở ở 40C cho tới khi cần sử dụng, cấy chuyền hàng tháng để duy trì trạng thái sống.Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn Chủng thí nghiệmCác bước thực hiệnTăng sinhThu nhận các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngThu nhận các phân đoạn màngPhân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn Chủng thí nghiệmCác bước thực hiệnTăng sinhThu nhận các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngThanh trùng các phân đoạn màngSử dụng phương pháp lọc vô trùngPhân đoạn màng của E. coli (E8) và Gluconobacter được lọc 2 lần bằng lọc có đường kính lỗ là 0,45µm.Các phân đoạn màng của Acetobacter được lọc bằng lọc có đường kính lỗ là 1,2µm, sau đó qua lỗ 0,8µm và cuối cùng qua lỗ 0,45µm 2 lần, bởi vì chúng có lớp polysaccharide.3. Phân đoạn màng có chức năng tương tự oxyrase3.1 Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn3.2 Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi khuẩn (non- bacterial source)Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi khuẩnTi thể của các loại nấm, tảo, thực vật, có khả năng khử O2 thành H2O nếu có sự hiện của chất cho điện tử.Quá trình tạo phân đoạn màng theo các bước:Phân lập tế bàoTăng sinhThu sinh khối tế bàoPhá vỡ tế bàoLoại mảnh vỡ tế bàoPhá vỡ ty thểLọc ép ở áp suất caoThu các mảnh vỡ ty thể thôLọc vô trùng và bảo quản ở 0oCSiêu ly tâm siêu lọc4. Một số sản phẩm oxyrase hiện nayOxyrase for BrothHỗn hợp chứa Oxyrase và các chất cơ bản có tác dụng cực đại hoá hoạt động của Oxyrase ở phạm vi rộng các điều kiện trong môi trường broth Cách sử dụng: nhỏ Oxyrase for Broth vào môi trường với tỉ lệ 0,1ml:5,0ml (1 giọt/1 ml). 4. Một số sản phẩm oxyrase hiện nayOxyrase for Agar cần sử dụng kết hợp Oxyrase for Agar với OxyDishtối ưu hoá hoạt động của oxyraseHệ thống này thường đựơc sử dụng để đếm vi khuẩn kỵ khí. Sử dụng: sử dụng ở tỉ lệ Oxyrase: môi trường = 1:30 chỉ thêm vào môi trường lúc ở trạng thái tan chảy và chỉ thêm vào môi trường đã hấp khử trùng. 4. Một số sản phẩm oxyrase hiện nayOxyDish™OxyDish là lồng chứa các đĩa môi trường nuôi cấy sau khi thêm Oxyrase for Agar nhằm tạo điều kiện thuận lợi để ủ vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí. 4) Một số sản phẩm oxyrase hiện nayOxyplates Oxyplate thích hợp cho các phòng thí nghiệm nghiên cứu VSV gây bệnh 5) Một số sản phẩm oxyrase hiện nay OxyPRAS™ Plates Là loại môi trường làm sẵn, sử dụng tốt nhất so với buồng ủ, bình yếm khí hoặc túi ủ yếm khí để tạo môi trường yếm khí hoàn toàn, cũng là môi trường tốt nhất để phân lập và tăng sinh hầu hết các vi khuẩn kỵ khí. Pre-Reduced Anaerobically Sterilized5. Các triển vọng trong tương laiTạo môi trường kị khí cho các nghiên cứu liên quan Loại bỏ oxy khỏi môi trường lỏng dung môi nước thường ổn định mùi vị, màu sắc thực phẩm, giải khátLoại bỏ oxy khỏi môi trường dầu ngăn ôi thiu sản phẩm dầu, thay đổi màu sắc bơ, kem...OxyPRAS™ plates differ from standard plates in important ways:They are made for Anaerobes.They come reduced - ready to use.They are specially packaged in oxygen barrier bags.They stay reduced in air for hours.They can be stored refrigerated, for very long shelf life. They can be stored at room temperature. They meet Best Practice criteria for working with clinical Anaerobes.