Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết từ hoàng liên giải độc thang

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 203 SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hoàng liên giải độc thang (HLGĐ) là bài thuốc thanh nhiệt giải độc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường). Bài thuốc được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết lỵ. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư. trên thực nghiệm. Để tiện lợi trong việc sử dụng bài thuốc trong nghiên cứu và điều trị, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết HLGĐ bằng phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc. Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu được khoa Dược- Cơ sở 3 Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM cung cấp. Áp dụng các phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật quang phổ. Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46%. Xác định sự hiện diện alkaloid và flavonoid trong cao HLGĐ. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định được cao HLGĐ có đủ 4 dược liệu cấu thành bài thuốc. Hàm lượng Berberin trong cao là 0,852%. Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin đã góp phần xây dụng tiêu chuẩn cơ sở cao HLGĐ. Từ khóa: Hoàng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hoá, sắc ký lớp mỏng ABSTRACT PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR “HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 203 - 208 Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China, that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao. It is used widely to treat some infectious diseases such as pneumonia, furuncles, dysenteryMany studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes, enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation. In order to make HLJDT more convenient in research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination. As well, berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined. Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical Center HoChiMinh City. Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the chemical components. Berberin was determined by means of the spectral methods. ∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ: Bs. Trần Thu Nga ĐT: 0989231241 Email: thunga149@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 204 Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46%. There are alkaloid and flavonoid in the product. TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs. Berberin concentration in the product is 0.852%. Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method and berberin determination to standardize the HLJDT extract. Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography. ĐẶT VẤN ĐỀ Hoàng liên giải độc thang (gồm 4 vị thuốc: Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử (Fructus Gardeniae)) là bài thuốc cổ phương có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Bài thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường)(1). Công dụng bài thuốc được ghi trên một số tài liệu ứng dụng điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết lỵ(1, 7). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạchtrên thực nghiệm (3,5,8,9). Một nghiên cứu gần đây kết luận tác dụng bài thuốc gây ra sự chết theo chương trình và sự ngừng chu kỳ tế bào ở dòng tế bào ung thư gan in vitro và in vivo (4).. Ngoài ra, trên mô hình gây độc bằng cyclophosphamid, cao chiết Hoàng liên giải độc thang đã cho thấy có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa, giải độc (6). Để thuận lợi cho việc nghiên cứu và sử dụng bài thuốc trong điều trị, chúng tôi áp dụng phương pháp phân tích hóa học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và định lượng hoạt chất berberin chính trong cao HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài thuốc. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử (Fructus Gardeniae) được cung cấp bởi khoa Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM. Mỗi dược liệu được chuẩn hoá theo quy định về kiểm tra chất lượng thuốc của Dược điển Việt Nam 4. Phương pháp Điều chế cao chiết bài thuốc. Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp sắc trong dung môi nước. Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô cách thủy để thu được cao HLGĐ. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài thuốc(2). Độ ẩm Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một chén cân, đem sấy ở 1050C trong tủ sấy dưới áp suất thường đến khối lượng không đổi. Tính độ ẩm: 100% × − = a ba H a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g); b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl) Độ tro toàn phần Cân chính xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói. Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500- 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân. Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân. Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 205 lệch không quá 0,5 mg. Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức: ( ) ( ) % 100 hcc ba A ×− ×− = A%: tro toàn phần (%) của dược liệu; a: khối lượng chén có tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng; h: độ ẩm (%) của dược liệu Định tính Phương pháp hóa học: Hợp chất alkaloid: Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc H2SO4 5% chia vào 3 ống nghiệm để làm phản ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat và quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng. Hợp chất flavonoid: Lấy 1 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml MeOH, lọc. Dịch lọc được cô đến cắn. Hoà cắn với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc. Dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm làm phản ứng với NaOH 10%, FeCl3 3% trong cồn và thuốc thử chì acetat. Quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm và với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu trắng đục. Phương pháp sắc kí lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck). Lấy khoảng 0,1 g mỗi dược liệu, cho vào cốc có mỏ 50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút, lọc. Tập trung lọc cô còn 1ml làm dung dịch chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu làm đối chiếu trên sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi tương thích được tham khảo trong các dược điển. Định lượng Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ được xác định dựa vào đường cong chuẩn độ của berberin chuẩn trong methanol trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS. Xác định đỉnh hấp thu cực đại: Đỉnh hấp thu cực đại của berberin chuẩn trong methanol là λmax = 266 nm. Xây đựng đường chuẩn berberin. Thiết lập giai mẫu Cân chính xác 2 mg berberin chuẩn, hòa tan trong 10 ml methanol và cho vào bình định mức 10 ml (dung dịch chuẩn A). Dùng micro pipette lấy chính xác dung dịch chuẩn A có thể tích lần lượt là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400 µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm. Mẫu thử Cân chính xác khoảng 100 mg cao, cho vào bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm nhiều lần bằng methanol cho đến khi dịch chiết methanol không còn phản ứng của chất berberin. Dịch chiết cô còn khoảng 10 ml và cho vào bình định mức 10 ml, lắc đều. Dùng micro pipet hút chính xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định mức 10 ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm. Bảng 1. Mật độ quang của giai mẫu berberin chuẩn. Bình định mức Hàm lượng berberin (µg/ml) Mật độ quang (OD) 1 2 3 4 5 6 3 µg 4 µg 5 µg 6 µg 7 µg 8 µg 0,262 0,340 0,421 0,491 0,566 0,636 Công thức tính hàm lượng berberin trong mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x + 0,0413. 6 10 5,0 100 0748,0 0413,0 (%) − ××× − = p bA C t Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 206 A t: Độ hấp thu của mẫu thử. b: Khối lượng 100 g cao HLGĐT khô kiệt (g). p: Khối lượng cao HLGĐT đem thử đã trừ ẩm (g). Biểu đồ 1. Đường chuẩn của dung dịch chuẩn berberin. KẾT QUẢ Bào chế cao HLGĐ. Sơ đồ 1. Qui trình bào chế cao HLGĐ Hiệu suất chiết cao: 18,13% Bã dược liệu 80 0C -1000C 10 lít nước 60 phút Dịch chiết 2 1200 ml Dịch chiết 1 2500 ml nước 800C-1000C 5000 ml nước 30 phút Dịch chiết 1+2 Lọc Cô cách thủy Đường chuẩn BERBERIN y = 0,0748x + 0,0413 R2 = 0,9994 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 2 4 6 8 10 HÀM LƯỢNG (µg/ ml) Cao HLGĐ (650g) Dược liệu 2440 g Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 207 Độ ẩm cao HLGĐ Bảng 2. Độ ẩm của cao HLGĐ. Cao Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng Cao HLGĐT(g) 0,5183 0,4998 0,5078 Độ ẩm (%) 32,22 31,63 31,88 Trung bình (%) 31,91 Tro toàn phần cao HLGĐ Bảng 3. Độ tro toàn phần của cao HLGĐ. Cao Lần 1 Lần 2 Lần 3 Khối lượng Cao HLGĐT (g) 0,5254 0,5512 0,5390 Tro toàn phần (%) 8,36 8,31 8,72 Trung bình (%) 8,46 Định tính - Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid và alkaloid: dương tính. - Phương pháp sắc kí lớp mỏng: Bảng 4. Sắc ký đồ của cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu. Nguyên liệu Hệ dung môi khai triển Phát hiện Số vết của nguyên liệu đối chiếu Số vết của cao Số vết trùng giữa nguyên liệu với cao Hoàng liên n-butanol:acid acetic:nước (7 : 1 : 2) Phun TT Dragendorff và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm 3 4 3 Hoàng bá n-butanol:acid acetic:nước (7 : 1 : 2) Phun TT Dragendorff và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm 3 4 3 Hoàng cầm Toluen : ethyl acetat : acid formic (2 : 3 : 2.2) Phun FeCl3 và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm 8 6 6 Chi tử Ethyl acetat : aceton : acid formic : nước (5 : 5 : 1 : 1) Phun H2SO4 quan sát dưới ánh sang thường và đèn UV λ=366nm 6 5 6 Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có sự hiện diện của các dược liệu: Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử. Chứng tỏ phương pháp chiết xuất giữ được các thành phần chủ yếu của công thức cổ truyền. Định lượng Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ. Bảng 5. Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ. STT Khối lượng Mẫu chưa trừ ẩm (g) Khối lượng Mẫu thử đã trừ ẩm (g) Mật độ quang Hàm lượng berberin trong cao HLGĐT khô kiệt (%) 1 0,1178 0,0802 0,282 0,802 2 0,1073 0.0730 0,276 0,858 3 0,1187 0.0808 0,312 0,895 Trung bình 0,852 BÀN LUẬN Kết quả định tính bằng phương pháp hóa học cho thấy cao HLGĐ có hiện diện hợp chất flavonoid, alkaloid và kết quả sắc ký lớp mỏng (Bảng 4) có sự hiện diện của cả 4 dược liệu cấu thành bài thuốc giúp khẳng định phương pháp chiết xuất có hiệu quả. Kết quả nghiên cứu hàm lượng berberin trong cao HLGĐ thu được là 0,852 % chiếm tỷ lệ 62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự đoán. Như vậy, kết quả định lượng cao HLGĐ cho thấy phương pháp chiết xuất thu được gần hết thành phần alkaloid có trong dược liệu. Cao HLGĐ đã được xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần (Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép đánh giá tính ổn định của chế phẩm, bảo đảm tính chính xác của các kết quả mà nghiên cứu thu được. Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1) đơn giản, có hiệu quả, dễ thực hiện và dễ ứng dụng trong sản xuất sau này. KẾT LUẬN Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46%. Định tính bằng phương pháp hóa học cho thấy cao HLGĐ có sự hiện diện của hợp chất flavonoid và alkaloid. Trên sắc kí đồ của cao HLGĐ xác định sự hiện diện của 4 dược liệu: Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 208 Hàm lượng Berberin trong cao HLGĐ trung bình là 0,852%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y Tế (2008). Y lý y học cổ truyền. Nhà xuất bản Y Học, tr. 91, 148, 149. 2. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất bản Y Học, tr. 733, 778, 779, 783. 3. Fang Q, Zhan XP, Mo JL, Sun M (2004). “The effect of Huanglian jiedu tang on Alzheimer's disease and its influence on cytokines”. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol. 29(6), pp. 575-578. 4. Hsu YL, Kuo PL, Tzeng TF, Sung SC, Yen MH, Lin LT, Lin CC (2008). “Huang-lian-jie-du-tang, a traditional Chinese medicine prescription, induces cell-cycle arrest and apoptosis in human liver cancer cells in vitro and in vivo”. J Gastroenterol Hepatol, vol. 23, pp. 290-299. 5. Mizukawa H, Yoshida K, Honmura A, Uchiyama Y, Kaku H, Nakajima S, Haruki E (1993). “The effect of orengedokuto on experimentally-inflamed rats”. Am J Chin Med, vol. 21(1), pp. 71-78. 6. Trần Thu Nga, Nguyễn Phương Dung (2012). Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cao chiết Hoàng liên giải độc trên chuột nhắt tổn thương gan bởi cyclophosphamid. Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 16, phụ bản của số 1, tr. 157-161. 7. Trần Văn Kỳ (2008). 250 bài thuốc đông y cổ truyền chọn lọc. Nhà xuất bản Thanh Niên, tr. 49. 8. Watanabe-Fukuda Y, Yamamoto M, Miura N, Fukutake M, Ishige A, Yamaguchi R, Nagasaki M, Saito A, Imoto S, Miyano S, Takeda J, Watanabe K (2009). “Orengedokuto and berberine improve indomethacin-induced small intestinal injury via adenosine”. J Gastroenterol, vol. 44(5), pp. 380-389. 9. Yu YL, Lu SS, Yu S, Liu YC, Wang P, Xie L, Wang GJ, Liu XD (2009). “Huang-lian-jie-du-decoction modulates glucagon-like peptide-1 secretion in diabetic rats, Ethnopharmacol, vol. 124(3), pp. 444- 449. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2013