So sánh chất lượng Vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu chế tạo phòng bệnh viêm phổi cho lợn

40 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 SO SAÙNH CHAÁT LÖÔÏNG VACXIN ÑA GIAÙ VOÂ HOAÏT BOÅ TRÔÏ KEO PHEØN VAØ BOÅ TRÔÏ NHUÕ DAÀU CHEÁ TAÏO PHOØNG BEÄNH VIEÂM PHOÅI CHO LÔÏN Cù Hữu Phú, Đỗ Tất Đạt, Lương Thị Hương Giang Công ty Marphavet TÓM TẮT Bộ giống vi khuẩn (master seed) bao gồm: 3 chủng A. pleuropneumoniae, 2 chủng P. multocida và 1 chủng S. suis được Cục Thú y cho phép sử dụng để sản xuất và lưu hành vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn tại công ty Marphavet cũng đã được sử dụng để chế tạo vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn. Cả 2 loại vacxin đã chế tạo (có chất bổ trợ keo phèn và nhũ dầu) đều đạt chất lượng: vô trùng 100%, an toàn 100% khi kiểm tra trên chuột và trên lợn. Hiệu lực phòng bệnh của cả 2 loại vacxin trên chuột bằng phương pháp miễn dịch thụ động đạt trên 80,0% khi công cường độc. Bằng phương pháp ELISA, đã xác định được cả 2 loại vacxin trên đều kích thích lợn sản sinh kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 với hiệu giá cao sau 21 ngày tiêm vacxin ở lợn từ 4 tuần tuổi, hiệu giá kháng thể của vacxin nhũ dầu cao hơn hiệu giá kháng thể của vacxin keo phèn. Từ khóa: chủng giống, chất bổ trợ nhũ dầu, chất bổ trợ keo phèn, vacxin vô hoạt, đa giá. Comparing the quality of the aluminium hydroxide and oil emulsion adjuvant, inactivated multivalent vaccines against pneumoniae in swine Cu Huu Phu, Do Tat Dat, Luong Thi Huong Giang SUMMARY In this research, the master seed bacteria strains, including three strains of A. pleuropneumoniae, two strains of P.multocida and one strain of S. suis were approved by Department of Animal Health to produce the aluminum hydroxide adjuvant, inactivated multivalent vaccine, they were also used to develop an inactivated multivalent vaccine with oil emulsion adjuvant to prevent pneumoniae in swine. Both vaccines (with aluminium hydroxide and oil emulsion adjuvant) were found to be good quality with 100% sterility and 100% safety, which was proved through the experimental tests on mice and pigs. Both vaccines passed the potency test with a protection rate of 80% on mice, using challenge method. Using ELISA technique, it was detected that both vaccines stimulated the pigs in producing antibodies to A. pleuropneumoniae serotypes 2 and 5 with high titers after 21 days of vaccination in pigs from four weeks of age. The antibody titer of oil emulsion adjuvant vaccine was higher than that of the aluminium hydroxide adjuvant vaccine. Keywords: master seed, oil emulsion adjuvant, aluminium hydroxide adjuvant, inactivated multivalent vaccine. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, Streptococcus suis và P. multocida gây ra, đã gây chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi tại các cơ sở chăn nuôi. Trong các vụ dịch tai xanh (PRRS) ở lợn xuất hiện tại các địa phương, các nghiên cứu đã công bố cho thấy, lợn mắc bệnh tai xanh bị chết chủ yếu là do các vi khuẩn, virus khác gây nên, trong số đó nhóm vi khuẩn A. pleuropneumoniae, Streptococcus suis và P. multocida, đặc biệt là vi khuẩn 41 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 A. pleuropneumoniae là nguyên nhân quan trọng gây chết lợn trong các ổ dịch tai xanh trên phạm vi cả nước. Chính vì vậy, việc nghiên cứu, chế tạo vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn do 3 vi khuẩn A. pleuropneumoniae, Streptococcus suis và P. multocida gây ra là rất cấp thiết, nhằm giảm tổn thất cho người chăn nuôi lợn tại nước ta, không chỉ đối với bệnh viêm phổi, mà với cả các đàn lợn bị mắc bệnh tai xanh. Ở nước ta, hiện chỉ có công ty Marphavet đã được phép chế tạo vacxin viêm phổi đa giá, vô hoạt có bổ trợ keo phèn và vacxin này được phép lưu hành phòng bệnh cho lợn trên phạm vi cả nước. Vacxin đa giá được chế tạo sử dụng phòng bệnh viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi do 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, Streptococcus suis (S. suis) và P. multocida gây ra. Việc nghiên cứu chế tạo vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu sẽ tăng hiệu lực phòng bệnh của vacxin, còn kéo dài hơn thời gian miễn dịch của vacxin ở lợn được tiêm phòng. Trong báo cáo gần đây, chúng tôi đã công bố kết quả nghiên cứu chế tạo vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn từ 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida. Vacxin viêm phổi nhũ dầu thử nghiệm đã được đánh giá về chất lượng là: an toàn 100,0% trên chuột và lợn, có hiệu lực phòng bệnh trên 80,0% khi được công cường độc. Chính vì vậy, sử dụng phương pháp ELISA, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae được hình thành ở lợn sau 21 ngày được tiêm 2 loại vacxin viêm phổi có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu. Kết quả nghiên cứu này bước đầu nhằm đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin viêm phổi nhũ dầu, cũng như bổ sung cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu, sản xuất và lưu hành 2 loại vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt phòng bệnh cho các đối tượng lợn khác nhau (lợn nái, lợn đực giống, lợn thịt) nuôi ở nước ta. II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung - Sử dụng bộ giống vi khuẩn sản xuất vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn đã được phép lưu hành (A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida) để chế tạo thử nghiệm vacxin bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh viêm phổi ở lợn. - So sánh chất lượng vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt keo phèn và nhũ dầu chế tạo bao gồm: vô hoạt, an toàn và hiệu lực của 2 loại vacxin (bằng phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột và ELISA) qua việc xác định hiệu giá kháng thể hình thành ở lợn ≥ 4 tuần tuổi sau 21 ngày tiêm 2 loại vacxin khác nhau. 2.2. Vật liệu * Vi khuẩn sử dụng làm Master seed sản xuất vacxin viêm phổi lợn đa giá được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin. Gồm có: - Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b. - Vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D - Vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2. * Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi ở lợn - Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB ... - Chất bổ trợ NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất. - Bổ trợ keo phèn - Chất bổ trợ nhũ dầu Nano (IMS 1313) của công ty Seppic- CHLB Đức. * Kít ELISA: Hóa chất được cung cấp trong bộ Kit 42 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 - Tên bộ Kit: ID Screen APP 2,5 Indirect - Hãng sản xuất: ID.vet Innovative Diagnostics - Micro pipet, pipet đa kênh, đầu tip, giấy khô, giấy bạc, ống Falcon, túi đựng đồ bẩn. - Thiết bị ELISA: Máy ủ, máy đọc kết quả, máy tính. * Động vật thí nghiệm; - Chuột nhắt trắng: 18- 20 gram/con - Lợn trên 4 tuần tuổi âm tính với kháng thể kháng A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida (không tiêm vacxin hoặc nhiễm bệnh tự nhiên). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi cấy riêng rẽ trên các loại môi trường khác nhau và được lên men sục khí bằng hệ thống lên men 10 lít và 120 lít của hãng Satoryus- CHLB Đức. Sau lên men sục khí 8-10 giờ, tiến hành lấy mẫu kiểm tra thuần khiết bằng phương pháp nhuộm Gram và ria cấy trên các loại môi trường kiểm tra, đồng thời xác định đậm độ kháng nguyên vi khuẩn trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch và đo độ đục. Sau đó tiến hành vô hoạt vi khuẩn nuôi cấy bằng Formol với tỷ lệ 0,3%. 2.3.2. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm * Kiểm tra vô trùng và đậm độ: Từ mỗi lô vacxin, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp như môi trường thạch thường, thạch máu, thạch TSA (có bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm. Các ống môi trường, sau khi cấy được bồi dưỡng ở tủ ấm 370C có bổ sung 5 % CO 2 , riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phòng. Mỗi ngày đọc kết quả 1 lần. Nếu sau 7 ngày không có bất cứ một loại vi khuẩn nào mọc trên các môi trường thì vacxin được coi là đạt tiêu chuẩn vô trùng. Sau khi vô hoạt vi khuẩn trong canh trùng thu được bằng formol với tỷ lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nước thịt, thạch máu và nước thịt yếm khí. Sau khi chế tạo, vacxin được kiểm nghiệm chất lượng theo tiêu chuẩn 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 (2003) theo Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong Thú y của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2003). 2.3.3. Phương pháp xác định kháng thể bằng ELISA Để các hóa chất và mẫu huyết thanh ở nhiệt độ phòng (21oC ± 5oC) trong 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm. Các ống chứa mẫu huyết thanh và các ống đối chứng cần được trộn đều bằng máy vortex và spin nhanh trước khi tiến hành các phản ứng. Pha loãng Wash solution từ 20X xuống 1X. Bước 1: Nhỏ 100 µl đối chứng âm, 100 µl đối chứng dương vào các giếng đối chứng. Nhỏ 250 µl dilution buffer 2 và 5 µl mỗi mẫu huyết thanh vào các giếng còn lại. Bước 2: Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC. Bước 3: Chuẩn bị 1X Conjugate bằng cách pha loãng Conjugate 10X với tỉ lệ 1/10 trong Dilution buffer 19. STT Tên hóa chất 1 Đĩa đã gắn kháng nguyên APP 2/5 2 Conjugate (10X) 3 Đối chứng dương 4 Đối chứng âm 5 Dilution Buffer 2 6 Dilution Buffer 19 7 Đệm rửa (20X) 8 Cơ chất 9 Stop solution (0.5M) 43 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Bước 4: Đổ bỏ dịch. Rửa mỗi giếng 3 lần bằng 1X Wash solution (300 µl/ giếng) sử dụng pipet đa kênh. Tránh để giếng khô giữa các lần rửa. Ở lần rửa cuối, đảo ngược giếng rồi vỗ mạnh vào giấy khô. Bước 5: Bổ sung 100 µl 1X conjugate vào mỗi giếng. Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC. Bước 6: Lặp lại bước 4. Bước 7: Bổ sung 100 µl cơ chất vào mỗi giếng. Ủ 15 phút ± 2 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC trong tối (phủ giấy bạc kín các giếng). Bước 8: Thêm 100 µl Stop solution vào mỗi giếng. Đọc kết quả OD ở bước sóng 450nm. Kết quả : Kết quả có ý nghĩa khi: - Giá trị OD của đối chứng dương lớn hơn 0.35: OD(PC) > 0.350 - Tỷ số giá trị OD của chứng dương và chứng âm nhỏ hơn 0.3: OD (NC)/OD (PC) < 0.3 - S/P % = [(OD mẫu – OD chứng âm)/ (OD chứng dương – OD chứng âm)] *100 Lưu ý: - Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác. - Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC. 2.3.4. Phương pháp kiểm tra hiệu lực của 2 loại vacxin trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để miễn dịch thụ động cho 35 chuột khỏe mạnh bằng đường tiêm dưới da, với liều 0,2ml huyết thanh lợn/con và 30 chuột đối chứng tiêm 0,2ml nước thịt TYE vào dưới da. Sau 24 giờ tiêm huyết thanh lợn được miễn dịch, tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin gồm 3 chủng A. pleuropneumoniae type 2, 5a, 5b; 2 chủng P. multocida type A và D và 1 chủng S. suis type 2. Mỗi chủng vi khuẩn công cường độc cho 5 chuột đã tiêm vacxin chứa 10 LD 50 có trong 0,2ml. Theo dõi trong 7 ngày, lô vacxin được đánh giá đạt hiệu lực trong phương pháp miễn dịch thụ động khi chuột ở lô đối chứng (30 con) không tiêm vacxin chết hết sau khi công cường độc, còn chuột trong lô thí nghiệm (30 con tiêm huyết thanh) sau khi công cường độc, số chuột sống còn phải là 3/5 con, là đạt yêu cầu. 5 chuột tiêm huyết thanh lợn miễn dịch không công cường độc phải đảm bảo 5/5 khỏe mạnh (tổng số 65 chuột). - Lô thí nghiệm: 30 chuột, tiêm huyết thanh lợn sau tiêm vacxin 21 ngày, mỗi mẫu huyết thanh tiêm cho 5 chuột; 0,2 ml/con, tiêm dưới da. - Lô đối chứng 1: 30 chuột, tiêm nước sinh lý, liều tiêm và đường tiêm tương tự. - Lô đối chứng 2: 5 chuột, tiêm huyết thanh lợn sau tiêm vacxin 21 ngày; 0,2 ml/con, tiêm dưới da. - 24 giờ sau khi tiêm huyết thanh, tiêm canh trùng cường độc của các chủng vi khuẩn cho cả 2 lô chuột (lô thí nghiệm và lô đối chứng 1), mỗi chủng vi khuẩn tiêm cho 5 chuột ở mỗi lô; 0,5 ml/con, tiêm phúc xoang. Theo dõi thời gian gây chết chuột. 2.3.5. Phương pháp xác định liều LD 50 Trong đó: A: Là nồng độ pha loãng gây chết sát 50% chuột. a: Là tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%) (cộng dồn) b: Là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột d: Lg của nồng độ pha loãng. S/P Kết quả S/P % < 30 % Âm tính 30% ≤ S/P % < 40 % Nghi ngờ S/P % ≥ 40 % Dương tính Lg LD 50 = Lg A + x d a - 50 a - b 44 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả theo dõi các lô lên men sục khí Sau khi kháng nguyên chế tạo vacxin được sản xuất, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp nhuộm tiêu bản và kiểm tra dưới kính hiển vi. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên các loại môi trường. Kết quả tổng hợp được trình bày ở bảng 1 và 2. Bảng 1. Kết quả kiểm tra vô trùng của canh trùng sử dụng chế tạo vacxin TT Lô vacxin Kết quả kiểm tra Đánh giá Nước thịt BHI Thạch máu Nước thịt yếm khí 1 A. pleuropneumoniae Không mọc Không mọc Không mọc Đạt 2 P. multocida Không mọc Không mọc Không mọc Đạt 3 S. suis Không mọc Không mọc Không mọc Đạt Bảng 2. Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu của canh trùng sử dụng chế tạo vacxin TT Lô vacxin Chỉ tiêu kiểm tra Đậm độ (x 109 vk/ml) Thuần khiết 1 A. pleuropneumoniae 11 Đạt 2 P. multocida 12 Đạt 3 S. suis 15 Đạt Từ kết quả kiểm tra này cho thấy, cả 3 lô canh trùng đều đạt các chỉ tiêu cần thiết để có thể sử dụng làm vacxin. Sau khi đã kiểm tra 3 lô canh trùng chế tạo được đều đạt các tiêu chuẩn chế vacxin, tiến hành phối trộn 3 loại canh trùng với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt được một hỗn hợp canh trùng đồng nhất, rồi bổ sung chất bổ trợ vacxin tùy từng loại khác nhau; Vacxin có bổ trợ keo phèn với tỷ lệ 20% (4 phần canh trùng + 1 phần keo phèn), vacxin nhũ dầu với tỷ lệ 25% (3 phần canh trùng + 1 phần nhũ dầu IMS 1313) để đảm bảo trong 2 ml vacxin có chứa ≥ 4 tỷ kháng nguyên vi khuẩn A. pleuropneumoniae, ≥ 4 tỷ kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida và ≥ 4 tỷ kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus suis. * Kiểm tra vô trùng vacxin bán thành phẩm: Kết quả kiểm tra vô trùng 2 lô vacxin bán thành phẩm có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin bán thành phẩm chế tạo TT Lô vacxin Kết quả kiểm tra Đánh giá Nước thịt BHI Thạnh máu Nước thịt yếm khí 1 Lô I: Vacxin keo phèn Không mọc Không mọc Không mọc Đạt 2 Lô II: Vacxin nhũ dầu Không mọc Không mọc Không mọc Đạt Từ mỗi lô vacxin, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp, sau 7 ngày không có bất cứ một loại vi khuẩn, nấm nào mọc trên các môi trường, như vậy vacxin được coi là đạt tiêu chuẩn vô trùng. 45 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Vacxin được ra chai, đóng nút, dán nhãn, sau đó tiến hành lấy mẫu để kiểm tra an toàn trên động vật thí nghiệm dựa vào quy trình kiểm nghiệm vacxin dùng trong Thú y của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 3.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng Mỗi một loại vacxin chế tạo (keo phèn và nhũ dầu): Chọn 10 chuột khỏe mạnh, tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con. Vacxin keo phèn tiêm phúc xoang, còn vacxin nhũ dầu tiêm vào bắp đùi. Theo dõi chuột trong vòng 10 ngày. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4. Bảng 4. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng Lô TN Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số chuột sống (con) Số chuột chết (con) Thời gian theo dõi 1 10 0,5 Phúc xoang 10 0 10 ngày 2 10 0,5 Bắp đùi 10 0 10 ngày Kết quả cho thấy: tất cả chuột được tiêm 2 loại vacxin đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua 10 ngày theo dõi. Điều này khẳng định rằng vacxin được chế tạo đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn 100% trên chuột nhắt trắng. 3.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của vacxin Sau khi tiến hành lấy máu để xác định âm tính với kháng thể trong máu lợn kháng với A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của đàn lợn thí nghiệm 13 con, từ 30 – 35 ngày tuổi, chúng tôi đã tiến hành chia lô và tiêm vacxin cho lợn như sau: - Lô thí nghiệm 1: 5 lợn, đánh số tai từ TN1 đến TN5, tiêm vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn, 2 ml/con, tiêm dưới da sau hốc tai. - Lô thí nghiệm 2: 5 lợn, đánh số tai từ TN6 đến TN10, tiêm vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu, 2 ml/con, tiêm bắp thịt sau hốc tai. - Lô thí nghiệm đối chứng: 3 lợn, đánh số tai TN11 đến TN13, tiêm nước sinh lý, liều tiêm và đường tiêm tương tự. Lợn thí nghiệm ở lô 1 và lô 2 được tiêm vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ keo phèn và nhũ dầu đều đạt tiêu chuẩn an toàn 100%. Lợn tiêm vacxin đều khoẻ mạnh, không bị phản ứng phụ sau khi tiêm vacxin. Sau 21 ngày tiêm vacxin, tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh tất cả 13 con, tiếp tục xác định hiệu giá kháng thể 2 loại vacxin. 3.3.1. Kết quả kiểm tra hiệu lực của 2 loại vacxin trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế * Vacxin có bổ trợ keo phèn: Kết quả thu được trình bày ở bảng 5. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin bổ trợ keo phèn 21 ngày, sử dụng để miễn dịch thụ động cho chuột khỏe mạnh bằng đường tiêm dưới da. Sau 24 giờ tiêm huyết thanh, lợn được miễn dịch, tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin như mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả ở bảng 5 cho thấy ở lô thí nghiệm, chuột sau khi được tiêm huyết thanh miễn dịch của lợn được công cường độc với liều 10 LD 50 , chỉ có 1/5 chuột ở lô công cường độc với chủng A. pleuropneumoniae type 5a và 1/5 chuột ở lô công cường độc bằng chủng P. multocida type A là bị chết sau 48 giờ, đạt tỷ lệ bảo hộ từ 80%. Trong khi đó, chuột ở lô đối chứng 1 sau khi công bằng các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bị chết 100% trong vòng 24 46 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Bảng 5. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin bổ trợ keo phèn trên chuột bằng phương pháp thay thế Lô chuột Loại canh trùng tiêm Số lượng chuột chết (con) Thời gian chết chuột (giờ) Thí nghiệm A.pp type 2 0/5 A.pp type 5a 1/5 48 A.pp type 5b 0/5 P. multocida type A 1/5 48 P. multocida type D 0/5 S. suis type 2 0/5 Đối chứng 1 A.pp type 2 5/5 24 A.pp type 5a 5/5 24 - 48 A.pp type 5b 5/5 24 - 72 P. multocida type A 5/5 24 P. multocida type D 5/5 24 S. suis type 2 5/5 24 Đối chứng 2 Không 0/5 - 48 giờ. Với 5 chuột ở lô đối chứng 2 chỉ tiêm huyết thanh lợn miễn dịch, không công cường độc thì đều khỏe mạnh sau 7 ngày theo dõi. * Vacxin có bổ trợ nhũ dầu: Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin bổ trợ nhũ dầu 21 ngày, sử dụng để miễn dịch thụ động cho chuột khỏe mạnh bằng đường tiêm dưới da. Sau 24 giờ tiêm huyết thanh, lợn được miễn dịch, tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin như mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 6. Bảng 6. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin bổ trợ nhũ dầu trên chuột bằng phương pháp thay thế Lô chuột Loại canh trùng tiêm Số lượng chuột chết (con) Thời gian chết chuột (giờ) Thí nghiệm A.pp type 2 0/5 A.pp type 5a 1/5 48 A.pp type 5b 0/5 P. multocida type A 0/5 P. multocida type D 0/5 S. suis type 2 0/5 Đối chứng 1 A.pp type 2 5/5 24 A.pp type 5a 5/5 48 A.pp type 5b 5/5 48- 72 P. multocida type A 5/5 48 P. multocida type D 5/5 24 S. suis type 2 5/5 72 Đôi chứng 2 Không 0/5 47 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Kết quả ở bảng 6 cho thấy ở lô thí nghiệm, chuột sau khi được tiêm huyết thanh miễn dịch của lợn tiêm vacxin bổ trợ nhũ dầu được công cường độc với liều 10 LD 50 , chỉ có 1/5 chuột ở lô công cường độc với chủng A. pleuropneumoniae type 5a là bị chết sau 48 giờ, đạt tỷ lệ bảo hộ từ 80%. Trong khi đó, chuột ở lô đối chứng 1 sau khi công bằng các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bị chết 100% trong vòng 24 - 72 giờ. Với 5 chuột ở lô đối chứng 2 chỉ tiêm huyết thanh lợn miễn dịch, không công cường độc thì đều khỏe mạnh sau 7 ngày theo dõi. So sánh khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu bằng phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột cho thấy khả năng bảo hộ của vacxin bổ trợ nhũ dầu tốt hơn vacxin bổ trợ keo phèn. 3.3.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của vacxin trên lợn bằng phương pháp ELISA Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày. Kết quả được thể hiện ở bảng 7. Bảng 7. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin bổ trợ keo phèn và nhũ dầu bằng phương pháp ELISA TT Số tai Loại vacxin Đường tiêm Liều tiêm Serotype 2 Đánh giá Serotype 5 Đánh giáOD450 S/P OD450 S/P 1 TN1 Keo phèn Dưới da 2ml 0.712 40.39287907 + 0.591 40.14481094 + 2 TN2 Keo phèn Dưới da 2ml 0.47 42.91539246 + 1.421 106.918745 + 3 TN3 Keo phèn Dưới da 2ml 1.215 118.8583078 + 0.54 36.0418343 + 4 TN4 Keo phèn Dưới da 2ml 0.633 59.53109072 + 0.59 40.0643604 + 5 TN5 Keo phèn Dưới da 2ml 0.441 39.95923 + 0.112 5.720339 + 6 TN6 Nhũ dầu Bắp 2ml 1.795 184.0042373 + 2.365 244.3855932 + 7 TN7 Nhũ dầu Bắp 2ml 1.361 138.029661 + 1.53 155.9322034 + 8 TN8 Nhũ dầu Bắp 2ml 1.53 155.9322034 + 1.265 127.8601695 + 9 TN9 Nhũ dầu Bắp 2ml 1.265 127.8601695 + 1.361 138.029661 + 10 TN10 Nhũ dầu Bắp 2ml 2.365 244.3855932 + 1.795 184.0042373 + 11 TN11 Nước thịt Dưới da 2ml 0.043 Âm tính - 0.045 -0.84856 - 12 TN12 Nước thịt Dưới da 2ml 0.047 Âm tính - 0.049 -0.58747 - 13 TN13 Nước thịt Dưới da 2ml 0.048 Âm tính - 0.052 -0.39164 - 14 Đối chứng dương 1.03 1.002 15 Đối chứng âm 0.054 0.058 Kết quả ở bảng 7 cho thấy: tất cả 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá đều dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5. Trong khi đó lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này. Kết quả cũng cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu cao hơn nhiều so với 5 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ keo phèn. Kết quả này bước đầu cho thấy sự khác biệt khả năng hình thành kháng thể ở lợn được tiêm hai loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn và thời gian miễn dịch kéo dài hơn để đánh giá về khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu đối với lợn được tiêm vacxin phòng bệnh. 48 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 IV. KẾT LUẬN Từ kết quả bước đầu thu được về vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu, chúng tôi có các kết luận sau: Đã chế tạo được vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu - IMS 1313 từ bộ giống vi khuẩn chế tạo vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn tại nhà máy vacxin thuộc Công ty Marphavet (3 chủng A. pleuropneumoniae, 2 chủng P. multocida và 1 chủng S. suis). Vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu chế tạo thử nghiệm đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng: vô trùng 100%; an toàn 100% trên chuột và trên lợn. Hiệu lực phòng bệnh của cả 2 loại vacxin trên chuột bằng phương pháp miễn dịch thụ động đạt trên 80,0% khi công cường độc bằng phương pháp miễn dịch thụ động trên chuột. Vacxin chế tạo có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu chế tạo thử nghiệm đều kích thích lợn sản sinh kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 với hiệu giá cao sau 21 ngày tiêm vacxin cho lợn từ 4 tuần tuổi. Hiệu giá kháng thể của vacxin nhũ dầu cao hơn hiệu giá kháng thể của vacxin keo phèn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp Nhà nước: Hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn do Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus và Pasteurella multocida gây ra- 2013. 2. Cục Thú y (2017). Quy trình kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y, truy cập tại vn/ViewFullText/Id/cc6eec04-c083-4e05-abae- e14dea7bb99a 3. Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC (vacxin viêm phổi lợn đa giá)- 2015. 4. Cù Hữu Phú và cs. (2011). “Nghiên cứu mối liên quan giữa hội chứng rối loạn hô hấp, sinh sản ở lợn (PRRS) với vi khuẩn gây bệnh kế phát và xác định biện pháp phòng, trị bệnh”, Báo cáo kết quả đề tài độc lập cấp Nhà nước. 5. Ahn, D.C. and Kim, B.H. (1994). Toxigenicity and capsular serotypes of Pasteurella multocida isolated from pneumonic lungs of slaughter pigs, Proc.Int. Pig.Vet, Soc Congr, p. 165. 6. Chang, Y.F., Shi, J.R., Ma, D.P., Shin, S.J. and Lein, D.H. (1993). Molecular analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX Toxin-III gene cluster, DNA Cell Biol. 12: 351-362. 7. Chang, C.F., Yeh, T.M., Chou, C.C., Chang, Y.F. and Chiang, T.S. (2002). Antimicrobial susceptibility and plasmid analysis of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated in Taiwan, Vet Microbiol 3, 84(1-2): 169-177. 8. Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D. and Gottschalk, M. (2012). Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis, Future Microbiol. 7(2): 259-279. 9. Frey, J. (1995). Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins, Trends Microbiol. Jul, 3(7): 257-261. 10. Gram, T., Ahrens, P., Andreasen, M. and Nielsen, J.P. (2000). An Actinobacillus pleuropneumoniae PCR typeing system based on the apx and omlA genes- evaluation of isolates from lungs and tonsils of pigs, Vet. Microbiol. 75: 43-57. 11. Hill, J.E., Gottschalk, M., Brousseau, R., Harel, J., Hemmingsen, S.M. et al. (2005). Biochemical analysis, cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32 and 34, isolated from pigs, are Streptococcus orisratti. Vet Microbiol 107: 63-69. doi:10.1016/ j.vetmic.2005.01.003. PubMed: 15795078. 12. Iwanmatsu, S. and Sawada, T. (1988). Relationship between serotypes, dermonecrotic toxin production of Pasteurella multocida isolation and pneumonic lesions of porcine lungs, Jpn J Vet Sci, 50: 1200-1206. 13. Liu, J., Chen, X., Tan, C., Guo, Y., Chen, Y., Fu, S., Bei, W. and Chen, H. (2009). In vivo induced RTX toxin ApxIVA is essential for the full virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae, Vet Microbiol, 137(3-4): 282-289. 14. Quinn, P.J., Carter, M.E., Markey, B., Carter, G.R. (1994). The Streptococci and related cocci. In: Quinn PJ, et al, editors. Clinical veterinary microbiology. London: Wolfe Publishing, Mosby- Year Book Europe Limited, p. 127-35. Ngày nhận 24-10-2018 Ngày phản biện 26-12-2018 Ngày đăng 1-3-2019