So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ huỳnh quang đánh giá Her2 trong ung thu vú

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 174 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH VÀ LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ Đoàn Thị Phương Thảo*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Phan Đặng Anh Thư, Nguyễn Thị Hồng Nguyệt*, Lý Thanh Thiện*, Đặng Hoàng Minh* TÓM TẮT Giới thiệu: Ứng dụng các phương pháp HMMD và FISH xác định tình trạng HER2/ ung thư vú nhằm đưa ra kết quả chính xác nhất để bệnh nhân nhận được phác đồ điều trị thích hợp nhất. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Phương pháp HMMD: thực hiện trên máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) là một kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên c-2erbB trong các mẫu ung thư. Đã được FDA chấp thuận. Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang (FISH): dùng bộ kit Path Vysion, cũng đã được FDA chấp thuận và ASCO and CAP khuyến cáo là “tiêu chuẩnvàng” cho đánh giá sự khuếch đại gen HER2. Kết quả: Khảo sát 264 trường hợp thực hiện đồng thời HMMD và FISH -Kết quả HMMD: tỉ lệ dương tính 3(+) 26,9%, nếu xem cả những trường hợp 2(+) là dương tính thì tỉ lệ HER2 (+) trên HMMD là 39,8%. Kết quả âm tính 60,2%. -Kết quả FISH: không khuếch đại là 67% và khuếch đại là 33%. Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0 là ngưỡng để đánh giá có khuếch đại. Khuếch đại giáp biên 6,1%, khuếch đại thấp 9,5%, khuếch đại cao 17,4%. Trong nghiên cứu này, thống kê Cramer’s V = 0,94 với p=0,001, cho thấy mối quan hệ giữa hai phương pháp này tương quan mạnh và giữa hai phương pháp có sự khác biệt nhỏ, đặc biệt là nhóm HMMD 2(+). Từ khóa: Hóa mô miễn dịch, Lai tại chỗ huỳnh quang, HER2 ABSTRACT COMPARISON METHODS IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION ASSESSMENT HER2 GENE IN BREAST CANCER Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Thi Hong Nguyet, Ly Thanh Thien, Dang Hoang Minh, * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 174 - 181 Introduction: Application of IHC and FISH methods to determine HER2 status in breast cancer in order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate Methods: IHC: Immunohistochemical analysis was performed as specified by the autoimmunostainer using the Pathway kit. The slides then were placed on an autoimmunostainer using the primary monoclonal antibody and polymer detection system supplied by Ventana. FISH: FISH was performed as specified by the manufacturer, with a guideline to improve the accuracy of HER2 testing in invasive breast cancer of ASCO and CAP. The PathVysion kit includes a Spectrum Orange-labeled DNA probe specific for the HER2 gene locus and a Spectrum Green-labeled probe specific for the alpha satellite DNA sequence at the centromeric region of chromosome 17 (CEP17). FISH and IHC results were compared with each other by means of Cramer's V statistics. Result: 264 cases performed simultaneously IHC and FISH. IHC: HER2 3(+) 26.9%, HER2 2(+) 12.9%, HER(-): 60.2% FISH: Non Amplified: 67.0%; Border Amplified: 6.1%; Low-Copy Amplified: 9.5%; High-Copy amplified: 17.4%; Correlation between IHC and FISH assays: IHC (-) cases : Non Amplified: 153/159 (96.2%); ∗Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS. Đoàn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418 Email: thaodoanthiphuong@ymail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 175 Border Amplified: 4/159 (2.5%); Low-Copy Amplified: 2/159 (1.3%); High-Copy amplified: Non. IHC2+ cases: Non Amplified: 22/34 (64.7%); Border Amplified: 8/34 (23.5%); Low-Copy Amplified: 2/34 (5.9%); High-Copy amplified: 2/34 (5.9%). IHC 3+ cases: Non Amplified: 2/71 (2.8%); Border Amplified: 4/71 (5.6%); Low-Copy Amplified : 21/71 (29.6%); High-Copy amplified: 44/71 (62.0%). Cramer's V statistics = 0.94 with p=0.001 Conclusions: Correlation between IHC and FISH assays is intermediate. FISH should be done for all patients in need of treatment with Trastuzumab. Key words: IHC, FISH, HER2 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú có 18% đến 30%(25,29), biểu hiện quá mức của HER2. Sự khuếch đại gen và/hoặc biểu hiện quá mức của thụ thể HER2 là yếu tố tiên lượng cho cả các trường hợp đã di căn hoặc chưa, tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu và không đáp ứng nội tiết và là chỉ định cho điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab(6,15). Tầm quan trọng của tình trạng HER2 trong việc đưa ra quyết định điều trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả sẽ không hưởng lợi từ các liệu pháp điều trị .nguy cơ gây độc cho cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(26) đã khiến các nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng để xác định tình trạng HER2. Các xét nghiệm đánh giá HER2 phải là định lượng hoặc bán định lượng, có khả năng lặp lại và phải là xét nghiệm phân biệt rõ ràng giữa các tế bào u có hoặc không khuếch đại/biểu hiện quá mức HER2(12,16). Để xác định tình trạng HER2, những phương pháp dựa vào hình ảnh mô học như Hóa mô miễn dịch (IHC), lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) đã thay thế được các phương pháp khác như Southern blot, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết men (enzyme-linked immunosorbent assay), và PCR, những xét nghiệm này đòi hỏi phải sử dụng mô tươi, ly giải toàn bộ mẫu mô nên kết quả có thể không chính xác do sự trộn lẫn giữa mô ung thư và mô lành(18,13). Mục tiêu nghiên cứu Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm - Xác định tỉ lệ khuếch đại HER2 trong ung thư vú. - Đánh giá mức độ tương hợp giữa hai phương pháp Hóa Mô Miễn Dịch và Lai Tại Chỗ Huỳnh Quang. ĐỐI TƯỢNG -- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vú tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong năm 2009. Được thực hiện đồng thời hóa mô miễn dịch và FISH. Hóa Mô Miễn Dịch Thực hiện trên máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) là một kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên c- 2erbB trong các mẫu ung thư. Đã được FDA (Food and Drug Administration) chấp thuận(4). Người khảo sát HMMD độc lập với người khảo sát FISH Chúng tôi cho điểm theo thang điểm khuyến cáo của nhà sản xuất 0: màng tế bào ung thư xâm lấn hoàn toàn không bắt màu 1(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu rãi rác, nhạt. 2(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥30%. 3(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, dày, đậm, ≥30%. Tất cả những trường hợp nhuộm bào tương đều được nhuộm lại. Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)(30) FISH được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. Bộ kit bao gồm đoạn dò PathVysion DNA Spectrum Orange-đặc hiệu cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc hiệu cho các trình tự DNA tại tâm động của nhiễm sắc thể 17 (CEP17). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 176 Luôn luôn cắt hai tiêu bản song song, nhuộm H&E và làm FISH. Trên tiêu bản H&E xác định chính xác vùng tế bào ung thư xâm lấn, đối chiếu với tiêu bản thực hiện FISH. Mẫu được cắt mỏng 4-μm, gắn lên tiêu bản đã được tráng organosilane. Khử sáp. Pretreate trong axit Clohydric 0.2N và natri thiocyanate theo quy định. Khử protein màng nhân trong dung dịch protease ở 37°C trong 6-7’, tùy mẫu (thay vì 10’, theo quy định trong bao bì). Sau khi rửa, các tiêu bản được cố định trong formalin đệm trung tính 10’. Rửa sạch, sấy khô. Lai với hỗn hợp đoạn dò kép HER2/CEP17 trong vòng 18 giờ. Rửa sau lai, sấy khô, nhuộm tương phản nền với DAPI. Bảo quản tiêu bản ở -20°C và được khảo sát trong vòng 24 giờ. Cách đánh giá tiêu bản FISH Chúng tôi khảo sát FISH theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tín hiệu Spectrum Orange và Spectrum Green được đếm trong 20 nhân tế bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường hợp tỉ lệ chưa phân định được khuếch đại hay không hoặc giáp biên, chúng tôi đếm 40 nhân, 60 nhân ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam (HER2) và tín hiệu màu xanh lá cây (CEP17) được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17. -Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,0: không khuếch đại. -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0: khuếch đại. -2,0 ≤ Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,5: khuếch đại GIÁP BIÊN. -2,5 < Tỉ lệ HER2/CEP17 < 5: khuếch đại THẤP. -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 5: khuếch đại CAO. Số tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội, và đa bội. Phương pháp thông kê Sử dụng phần mềm SPSS 17.0. KẾT QUẢ Sau khi loại bỏ những trường hợp không đạt yêu cầu (tín hiệu huỳnh quang không rõ ràng), chúng tôi khảo sát 264 mẫu ung thư vú được làm đồng thời HMMD và FISH, được kết quả như sau: Các đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu Tuổi: tuổi trung bình 50,8 ± 11,1, trung vị 50 tuổi Nhóm tuổi Số ca Tỉ lệ % 20-29 4 1,5 30-39 32 12,1 40-49 86 32,6 50-59 94 35,6 60-69 26 9,8 70-79 18 6,8 >80 4 1,5 Tổng cộng 264 100,0 Loại Số ca Tỉ lệ NOS 244 92,4 Tiểu thùy 6 2,3 Nhú 4 1,5 Bã khô 4 1,5 Nhầy 6 2,3 Tổng cộng 264 100,0 Phân độ mô học ung thư Phân độ mô học: trong nhóm 244 ca NOS được đánh giá độ mô học theo bảng sau: Độ mô học Số ca Tỉ lệ NOS độ1 2 ,8 NOS độ 2 90 36,9 NOS độ 3 152 62,3 Tổng cộng 244 100,0 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 177 Kết quả hóa mô miễn dịch Bảng 1: Kết quả hóa mô miễn dịch HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Âm tính 159 60,2 2+ 34 12,9 3+ 71 26,9 Tổng cộng 264 100 Tỉ lệ dương tính 3(+) là 71 trường hợp (26,9%), nếu xem cả những trường hợp 2(+) là dương tính thì tỉ lệ HER2 (+) trên HMMD là 39,8%. Kết quả FISH Bảng 2. Kết quả FISH Kết quả FISH Số trường hợp Tỉ lệ % Không khuếch đại 177 67,0 Khuếch đại giáp biên 16 6,1 Khuếch đại thấp 25 9,5 Khuếch đại cao 46 17,4 Tổng cộng 264 100,0 Không khuếch đại gen HER2 là 67% và khuếch đại là 33%. Tỉ lệ HER2/CEP17 = 2,0 là ngưỡng để đánh giá có khuếch đại. Khuếch đại giáp biên 16 trường hợp (6,1%). Khuếch đại thấp 25 trường hợp (9,5%). Khuếch đại cao 46 trường hợp (17,4%). Tương hợp giữa hai kết quả Kết quả FISH Không khuếch đại Khuếch đại giáp biên Khuếch đại thấp Khuếch đại cao Tổng cộng Số ca 153 4 2 0 159 Âm tính % IHC 96,2 2,5 1,3 0 100 Số ca 22 8 2 2 34 2+ % IHC 64,7 23,5 5,9 5,9 100 Số ca 2 4 21 44 71 Kết quả HMMD 3+ % IHC 2,8 5,6 29,6 62,0 100 Số ca 177 16 25 46 264 Tổng cộng % IHC 67,0 6,1 9,5 17,4 100 Cramer’s V = 0,649 với p= 0,001 Đánh giá sự tương quan giữa hai kết quả của hai phương pháp HMMD và FISH, chúng tôi dùng phép thống kê Cramer’s V là phương pháp thông kê đánh giá mức độ quan hệ mật thiết của hai mẫu. Thống kê Cramer’s V có hai giá trị 0 và 1, giá trị 0 cho biết không có mối quan hệ nào và giá trị 1 cho biết mối quan hệ giữa hai phương pháp là hoàn hảo. Trong nghiên cứu này, Cramer’s V = 0,649 với p=0,001, cho thấy mối quan hệ giữa hai phương pháp này tương quan khá và giữa hai phương pháp có sự khác biệt nhỏ về xác định tình trạng HER2, đặc biệt là nhóm HER22(+)/HMMD. Nhóm HMMD âm tính có 6/159 trường hợp khuếch đại gen HER2 chiếm 3,8%, trong đó có 2 trường hợp khuếch đại thấp và 4 trường hợp khuếch đại giáp biên, không có khuếch đại cao. Nhóm HMMD 3(+) có 2/71 trường hợp không khuếch đại gen HER2 chiếm 2,8% và khuếch đại cao 62%. Nhóm HMMD 2(+) đây là nhóm khó tiên đoán có khuếch đại gen hay không, bắt buộc phải làm thêm FISH. Trong nhóm này có 12/34 khuếch đại gen HER2 chiếm 35,3%. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 178 So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Bảng 4 So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Âm tính 7 58,4 3+ 5 41,6 Tổng cộng 12 100 Tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17: 12/264 trường hợp, chiếm 4,5%. So sánh trung bình bản sao HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Bảng 5 So sánh trung bình tín hiệu HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Trung bình bản sao HER2/nhân Tổng cộng ≤4 >4 Số ca 165 12 178 Không khuếch đại % 92,7% 7,3% 100 Số ca 0 87 86 Khuếch đại % 0% 100,0% 100 Số ca 165 99 264 Tổng cộng % 62,4% 37,5% 100 Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng bộ kít Path Vysion, đánh giá đồng thời cả HER2 và CEP 17. Mục đích chính của nghiên cứu không phải là so sánh sự khuếch đại gen giữa các phương pháp, nhưng chúng tôi cung cấp số liệu này để cho thấy sự cần thiết phải chọn những bộ kít có cùng đánh giá CEP 17 và HER2, Nếu như định nghĩa là số bản sao HER2/nhân ≥ 4 được xem là trị số tuyệt đối(30) có khuếch đại gen thì trong nghiên cứu này có đến 99 trường hợp. Sau khi tính tỉ lệ số bản sao HER2/CEP17 thì kết quả có 13/94 trường hợp là không khuếch đại do tỉ lệ HER2/CEP17 <2. Cả 12 trường hợp này đều rơi vào nhóm đa bội nhiễm sắc thể 17. BÀN LUẬN Về kết quả HMMD Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng nhiệu loại kháng thể khác nhau, thực hiện theo nhiều cách khác nhau công bố về tỉ lệ biểu hiện quá mức của thụ thể HER2 trong ung thư vú. Tuy nhiên cho tới hiện nay có hai xét nghiệm đã được FDA chấp thuận dùng để xác định biểu hiện quá mức của thụ thể HER2 trên bệnh nhân ung thư vú: HercepTest (DakoCytomation, Glostrup, Đan Mạch), Pathway (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, Ariz). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ Pathway (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động. Qui trình nhuộm máy đã giảm thiểu được nhuộm nền và các tình trạng nhuộm không đặc hiệu. Trong số 264 trường hợp, các các tiêu bản đều có đủ biểu mô lành tính để đánh giá nhuộm nền theo một số nghiên cứu của các tác giả Jacobs và cộng sự(9,13) và Lehr và cộng sự(11,13). Biểu mô bình thường có thể bắt màu ở màng đáy và màng bên nhưng các bề mặt tế bào biểu mô và các tế bào cơ biểu mô xung quanh ống luôn luôn âm tính. Khi xem lại 2 trường hợp HMMD 3(+), nhưng FISH không khuếch đại. 1 trường hợp có biểu mô ống tuyến vú bình thường bắt màu toàn bộ màng, cho nên trong trường hợp này là dương tính giả, nguyên nhân có thể do mẫu được cố định dài hơn 48giờ. 1 trường hợp khác là đa bội nhiễm sắc thể 17 có số lượng nhiễm sắc thể 17 trung bình là 8,5 và số trung bình bản sao HER2 là 15. Về kết quả FISH Ứng dụng kỹ thuật FISH để đánh giá sự khuếch đại gen HER2 đã được Slamon(21) nghiên cứu thành công và năm 1997. Đặc biệt, đến tháng 9/1998 một loại kháng thể đơn dòng kháng HER2 (Trastuzumab) được FDA chấp thuận cho điều trị ung thư vú giai đoạn trễ. Sau đó rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ trên mô vùi nến. Hiện nay, phương pháp được xem là “tiêu chuẩn vàng” dùng để đánh giá tình trạng HER2 là FISH(30,13). Chúng tôi dùng bộ kit Path Vysion, đã được FDA chấp thuận. Để có kết quả này, chúng tôi đã làm thử nghiệm khoảng 50 ca, hoàn chỉnh quy trình, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 179 những kinh nghiệm được rút ra đã được báo cáo trong lần hội thảo giải phẫu bệnh năm 2009. Phần lớn các trường hợp chúng tôi đều thực hiện thành công, tuy nhiên có một số trường hợp chúng tôi phải lặp lại nhiều lần mới đạt kết quả. Quan trọng nhất là thời gian khử protein màng nhân phải phù hợp, nếu quá ngắn protein màng nhân chưa tiêu hết đưa đến đoạn dò không bắt cặp được nhưng nếu quá dài màng nhân tan hết sẽ mất hết tín hiệu di truyền(30). Về mối tương quan giữa hai phương pháp Phương pháp HMMD đã phát triển hơn 10 năm và FISH từ năm 2009 đến nay, chúng tôi thực hiện song song HMMD và FISH trên tất cả bệnh nhân được chỉ định làm HER2/FISH. Với phép kiểm thông kê Cramer’s V = 0,94, cho thấy mối tương quan giữa hai phương pháp là rất mạnh. Nhóm HMMD (-) và 3(+) tương hợp cao với các kết quả FISH. Tuy nhiên, trong nhóm HMMD (-) vẫn có 3,8% có khuếch đại, nhưng nẳm trong nhóm khuếch đại giáp biên và khuếch đại thấp. Rà soát lại các mẫu này chúng tôi thấy tất cả các mẫu đều được gửi từ các phòng GPB có dung dịch cố định mẫu là formalin 10% nhưng không đệm trung tính. Có thể các thụ thể HER2 đã hư, mặc dù đã tối ưu hóa quy trình HMMD chúng tôi cũng không bộc lộ được thụ thể. Khi thực hiện FISH trên những trường hợp này chúng tôi cũng gặp khó khăn, thường là phải lặp lại lần hai để tối ưu hóa thời gian khử protein màng nhân. Nhóm HMMD 3(+) có 2/44 trường hợp không khuếch đại, chiếm 2,8%. Nguyên nhân có thể đã được giải thích ở trên là ảnh hưởng của dung dịch cố định và thời gian cố định. Trong nghiên cứu của Pauletti G(16) cho thấy tỉ lệ phát hiện biểu hiện quá mức của thụ thể HER2 nhưng không khuếch đại gen là 3%. Nhóm HMMD 2(+) đây là nhóm có kết quả FISH thay đổi, 64,7% không khuếch đại. 12/34 chiếm 35,3% có khuếch đại gen, phân bố từ khuếch đại giáp biên cho đến cao. Trong nhóm này có một trường hợp chúng tôi phải thực hiện phương pháp FISH đến 3 lần, đến lần thứ 3 thì chúng tôi mới xác định được kết quả là tỉ lệ HER2/CEP17 = 1,9/40 nhân tế bào, có đa bội nhiễm sắc thể 17. Sau đó bệnh nhân tự gửi mẫu sang Singapore và kết quả là HER2/CEP17 = 1,5/60 nhân tế bào. Kiểm tra lại trường hợp này, các tuyến bình thường có HMMD (+), và tìm hiểu thêm chúng tôi biết trường hợp này cố định bằng dung dịch formalin đệm trung tính nhưng thời gian cố định <6 giờ. Thời gian cố định rất quan trọng, tốt nhất là từ 6-48g, nếu quá ngắn hoặc quá dài đều ảnh hưởng đến kết quả(30). Diễn tiến lâm sàng của những trường hợp có HMMD(+) nhưng FISH(-) đã được Pauletti G(16,13) nghiên cứu với cỡ mẫu 900 bệnh nhân ung thư vú, không cho thấy có sự khác biệt giữa hai nhóm HMMD(+) và FISH(-) và HMMD(-)/ FISH(-). Chứng tỏ rằng giá trị của FISH phù hợp với diễn tiến lâm sàng của bệnh nhân. Ngoài ra, nghiên cứu của Tubbs RR(13,27) trên khối u vú HMMD 2(+)/FISH(-) không tăng số lượng mRNA HER2. Điều này khẳng định HMMD2(+) không phải là kết quả của tăng quá trình sao mã gen HER2. FISH và HMMD Pathway có mức độ tương hợp cao trong nhóm HMMD3(+) và HMMD(-), nhóm HMMD2(+) bao gồm cả khuếch đại và không khuếch đại HER2(13). Các cơ chế vì sao không khuếch đại gen HER2 nhưng biểu hiện HMMD 2(+) hiện nay chưa rõ ràng, nhưng có thể phản ánh con đường từ gen HER2 đến biểu hiện tại màng tế bào còn nguyên vẹn hoặc có thể có liên quan đến đa bội nhiễm sắc thể 17. Về ảnh hưởng của sự đa bội nhiễm sắc thể 17 Mặc dù chúng tôi không so sánh các phương pháp thực hiện FISH khác nhau, nhưng chúng tôi thử chia hai nhóm có khuếch đại hay không dựa vào ngưỡng tuyệt đối của số bản sao HER2 ≥4 là có khuếch đại. Chúng tôi tìm ra 12 trường hợp đa bội nhiễm sắc thể 17 có HER2 khuếch đại theo tiêu chí tuyệt đối, nhưng không khuếch đại Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 180 gen HER2 khi tính tỉ lệ trên nhiễm sắc thể 17. Nghiên cứu của Vanden Bempt(28) đã nhấn mạnh tầm quan trọng của đa bội nhiễm sắc thể 17, những trường hợp tăng số lượng bản sao HER2 do tăng số lượng nhiễm sắc thể 17 thì không khuếch đại gen HER2. Đa bội nhiễm sắc thể 17 không làm tăng số lượng mRNA. Tuy nhiên, chúng không thể phân biệt với các u có HER2(+) bằng các tiêu chuẩn bệnh học thông thường, chính vì vậy nó có khả năng ảnh hưởng đến sự giải thích kết quả cũng như chọn lựa bệnh nhân cho điều trị. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 264 trường hợp ung thư vú được thực hiện cả hai phương pháp HMMD và FISH chúng tôi có kết luận như sau: Mức độ tương hợp kết quả giữa hai phương pháp là trung bình theo thống kê Cramer’s V=0,94 với p=0,001. Mặc dù có sự tương hợp cao trong nhóm HMMD (-) và HMMD 3 (+), nhưng vẫn còn khoảng 3,8% có HMMD (-) nhưng FISH có khuếch đại (thuộc nhóm khuếch đại giáp biên và thấp) và nguyên nhân được cho là do dung dịch cố định và thời gian cố định không đúng. Nhóm HMMD 3 (+) nhưng FISH không khuếch đại có hai trường hợp, do dương tính giả và do ảnh hưởng của đa bội nhiễm sắc thể 17. Nhóm HMMD 2 (+) luôn luôn là nhóm thách thức, và với tình hình hiện tại chúng ta nên thực hiện FISH để xác định có khuếch đại hay không giúp cho bệnh nhân hưởng lợi ích từ các liệu pháp điều trị. HER2 là một yếu tố tiên lượng xấu(1,20,24) Tăng nguy cơ ung thư vú tương đối , thời gian sống còn toàn bộ bị rút ngắn. HER2 là mục tiêu điều trị nhắm trúng đích phân tử trong ung thư vú và một mục tiêu tiềm năng điều trị trong bệnh ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày(19) chính vì vậy chọn lựa phương pháp đánh giá HER2 chính xác đáp ứng được yêu cầu điều trị là một đòi hỏi cấp thiết cho các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh. Bộ môn giải phẫu bệnh được hân hạnh nhận mẫu từ nhiều nguồn khác nhau, tuy nhiên đó cũng là một thách thức lớn vì chúng tôi không thể kiểm soát được dung dịch cố định cũng như thời gian cố định mẫu. Tùy từng trường hợp, chúng tôi tối ưu hóa quy trình để có kết quả tốt nhất cho cả hai phương pháp. Nghiên cứu lâm sàng bổ sung là cần thiết để làm rõ thêm mối quan hệ giữa HER2 và ung thư. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andrulis IL, Bull SB, Blackstein ME, et al. neu/erbB-2 amplification identifies a poor-prognosis group of women with node-negative breast cancer. Toronto Breast Cancer Study Group. J Clin Oncol. 1998;16:1340-1349. 2. Burden S, Yarden Y (1997). Neuregulins and their receptors: a versatile signaling module in organogenesis and oncogenesis. Neuron;18:847-855. 3. Chazin V, Kaleko M, Miller A, et al. (1992). Transformation mediated by the human HER-2 gene independent of the epidermal growth factor receptor. Oncogene 7:1859-1866. 4. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research. Oncologic Drugs Advisory Committee, 58th meeting (transcript). Bethesda, MD; September 2, 1998. Available at: Accessed June 2001. 5. DiFiore P, Pierce J, Kraus M, et al. (1987). Erb B-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science 237:178-182. 6. Fornier M, Esteva FJ, Seidman AD (2000). Trastuzumab in combination with chemotherapy for the treatment of metastatic breast cancer. Semin Oncol;27:38-45. 7. Graus-Porta D, Beerli R, Daly JM, et al. (1997). ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all erbB receptors, is a mediator of lateral signaling. EMBO J;16:1647-1655. 8. Gullick W, Love S, Wright C, et al. (1991). C-erb B-2 protein overexpression in breast cancer is a risk factor in patients with involved and uninvolved lymph nodes. Br J Cancer 63:434- 438. 9. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, et al. (1999). Specificity of HercepTest in determining HER-2/neu status of breast cancers using the United States Food and Drug Administration– approved scoring system. J Clin Oncol;17:1983-1987. 10. Klapper LN, Glathe S, Vaisman N, et al. (1999). The erbB- 2/HER2 oncoprotein of human carcinomas may function solely as a shared coreceptor for multiple stroma-derived growth factors. Proc Natl Acad Sci U S A.;96:4995-5000. 11. Lehr H-A, Jacobs TW, Yaziji H, et al. (2001). Quantitative evaluation of HER-2/neu status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization and by immunohistochemistry with image analysis. Am J Clin Pathol;115:814-822. 12. Mass R (2000). The role of HER-2 expression in predicting response to therapy in breast cancer. Semin Oncol;27:46-52. 13. McCormick SR, Lillemoe TJ, Beneke J, Schrauth J, Reinartz J (2002). HER2 Assessment by Immunohistochemical Analysis and Fluorescence In Situ Hybridization Am J Clin Pathol; Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 181 117:935-943. 14. Muller W, Sinn E, Pattengale P, et al. (1988). Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell 54:105-115. 15. Nicholson BP (2000). Ongoing and planned trials of hormonal therapy and trastuzumab. Semin Oncol;27:33-37. 16. Pauletti G, Dandekar S, Rong H, et al. (2000). Assessment of methods for tissue-based detection of the HER-2/neu alteration in human breast cancer: a direct comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry.J Clin Oncol ;18:3651-3664 17. Rilke F, Colnaghi M, Cascinelli N, et al. (1991). Prognostic significance of HER-2/neu expression in breast cancer and its relationship to other prognostic factors. Int J Cancer 49:44-49. 18. Ross JS, Fletcher JA (1999). HER-2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast cancer. Am J Clin Pathol;112 (suppl 1):S53- S67. 19. Serrano-Olvera A, Dueñas-González A, Gallardo-Rincón D, et al. Prognostic, predictive and therapeutic implications of HER2 in invasive epithelial ovarian cancer. Cancer Treat Rev. 2006;32:180-190. 20. Seshadri R, Firgaira FA, Horsfall DJ, et al. Clinical significance of HER-2/neu oncogene amplification in primary breast cancer. The South Australian Breast Cancer Study Group.J Clin Oncol. 1993;11:1936-1942. 21. Slamon D, Clark G, Wong S, et al. (1987). Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/ neu oncogene. Science 235:177-182. 22. Slamon D, Godolphin W, Jones L, et al.(1989). Studies of the HER-2/ neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 244:707-712. 23. Slamon D, Press M, Godolphin W, et al. (1989). Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast cancer. Cancer Cells; 7:371-380. 24. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene Science. 1987;235:177-182. 25. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. (2001). Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med.;344:783-792. 26. Sparano JA. (2001). Cardiac toxicity of trastuzumab (Herceptin): Implications for the design of adjuvant trials. Semin Oncol;28:20-27. 27. Tubbs RR, Pettay JD, Roche PC, et al. (2001). Discrepancies in clinical laboratory testing of eligibility for trastuzumab therapy: apparent immunohistochemical false-positives do not get the message. J Clin Oncol;19:2714-2721. 28. Vanden Bempt I, Van Loo P, Drijkoningen M, et al. (2007). Polysomy 17 in breast cancer: Clinicopathologic significance and impact on HER-2 testing. J Clin Oncol 10.1200/JCO.13.4296. 29. Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al. (2002). Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol;20:719-726. 30. Wolff AC, Hammond MH, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, Dowsett M, Fitzgibbons PL, Hanna WM, Langer A, McShane LM, Paik S, Pegram MD, Perez EA, Press MF, Rhodes A, Sturgeon C, Taube SE, Tubbs R, Vance GH, Van de Vijver M, Wheeler TM, and Hayes DF (2008). American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer J Clin Oncol 25:118-145. 31. Yarden Y, Sliwkowski MX (2001). Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol;2:127-137.