Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định gen kiểm soát mùi thơm (FGR) trong tập đoàn các giống lúa địa phương

TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 83 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN KIỂM SOÁT MÙI THƠM (FGR) TRONG TẬP ĐOÀN CÁC GIỐNG LÚA ĐỊA PHƢƠNG Nghiêm Thị Hƣơng1, Nguyễn Thị Vân2 TÓM TẮT Nghiên cứu này sử dụng chỉ thị phân tử DNA để phát hiện gen mùi thơm trong tập đoàn các giống lúa địa phương. Thí nghiệm thực hiện trên 81 giống lúa đã được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau. Sử dụng hai cặp mồi ESP và IFAP nhằm xác định gen quy định mùi thơm - là gen lặn, ký hiệu FGR, định vị trên NST số 8 liên kết chặt chẽ với marker RG28. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phát hiện thấy 5 giống lúa chứa gen mùi thơm fgr là: 10102, 10059, 10089, 10096 và 10063-1. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu cho quá trình chọn tạo giống lúa có chất lượng cao. Từ khóa: Cây lúa, gen FGR, mùi thơm. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một trong những cái nôi của cây lúa nƣớc, do đ nguồn gen lúa rất phong phú, đ ng vai trò quan trọng trong việc chọn tạo ra những giống lúa c chất lƣợng cao. Tuy nhiên hiện nay rất nhiều giống lúa địa phƣơng đang bị thoái hoá c nguy cơ mất hẳn (do việc sản xuất các giống lúa này yêu cầu chi phí sản xuất cao, năng suất thấp và kh tiêu thụ). Trƣớc thực trạng đ các nhà khoa học cho rằng đ đến lúc phải chú trọng công tác thu thập, bảo tồn và đánh giá nguồn gen để c hƣớng sử dụng hợp lí. Mặc dù là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới nhƣng giá gạo xuất khẩu của Việt Nam trên thị trƣờng thế giới thƣờng thấp hơn so với gạo xuất khẩu từ các nƣớc nhƣ Mỹ, Thái Lan, Ấn Độ... Một trong những nguyên nhân cơ bản là chất lƣợng gạo của nƣớc ta chƣa tốt. Đặc tính mùi thơm ở lúa đƣợc ngƣời tiêu dùng đánh giá rất cao. Chính vì thế việc chọn tạo ra những giống lúa mới, c mùi thơm và kết hợp đƣợc một số tính trạng tốt nhƣ chất lƣợng gạo, khả năng chống chịu sâu bệnh... là một chiến lƣợc trong nông nghiệp. Hiện nay, trên thế giới đ c nhiều nghiên cứu về gen mùi thơm trên lúa. Tại Đại học Cornell, Ahn et al đ sử dụng marker để nghiên cứu gen điều khiển tính trạng mùi thơm, theo đ thì gen quy định mùi thơm là gen lặn, ký hiệu fgr, định vị trên NST số 8 liên kết chặt chẽ với marker RG28. Theo nghiên cứu của Brabury et al, 2005 đ phát hiện ở các giống lúa thơm có gen mã hóa cho Betaine aldehyde dehydrrogenase 2 (BAD2) nằm trên NST số 8. Dựa trên những kết quả trên, Braury et al đ sử dụng phƣơng pháp ASA (Allele Specific Amplification) với 4 cặp mồi ESP, EAP, IFAP và INSP. Giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 257bp), dị hợp tử (cho băng dài 355bp và 257bp) và không thơm (cho băng dài 355bp). Để tạo nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống lúa có chất lƣợng cao mang gen mùi thơm, ở nghiên cứu này đ sử dụng hai cặp mồi ESP và IFAP nhằm xác định gen quy định mùi thơm (fgr) trong tập đoàn các giống lúa địa phƣơng. 1,2 Khoa Nông - Lâm - Ngư nghiệp, Trường Đại học Hồng Đức TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 84 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Thí nghiệm thực hiện trên 81 giống lúa thu thập ở nhiều địa phƣơng khác nhau. Sử dụng đối chứng là giống lúa Bắc Thơm. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. hương pháp chiết tách DNA Chuẩn bị dịch chiết tách DNA:TrisHCl 50Mm PH=8, EDTA 0,25mM PH=8, Nacl 300 mM và H2O. Chuẩn bị dung dịch TE dùng để bảo quản DNA: Tris HCl 10Mm, EDTA 1mM, PH=8 và H2O. Quy trình tách chiết Lá lúa non, khoẻ thu từ sáng sớm (khi đ cây chƣa quang hợp, chiết tách DNA sẽ không bị lẫn tinh bột), cho vào các ống nghiệm và ghi tên giống trên ống nghiệm. Cối, chày sứ đƣợc khử trùng, đặt trên đá lạnh. Cắt 2 cm mẫu lá lúa thành các mẫu nhỏ bằng kéo vô trùng vào cối. Cho 400µl dung dịch chiết xuất DNA, nghiền nhỏ cho tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh, chứng tỏ tế bào lá đ vỡ và diệp lục đƣợc giải phóng ra. Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào rồi trộn lẫn và chuyển 400µl dung dịch vào ống eppendort đ đánh dấu tên từng giống sau đ lại đặt vào đá lạnh. Thêm 700µl dung dịch Phenol: Chloroform:Isoamylancohol (25:24:1) vào ống eppendort này rồi ly tâm khoảng 5 phút, 13000 vòng ở nhiệt độ 15 - 210C. Chuyển phần dung dịch phía trên vào ống eppendort mới đ ghi tên giống, rồi thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamylancohol (24:1) ly tâm 5 phút, 13000 vòng ở nhiệt độ 15 - 210C. Chuyển phần dung dịch phía trên sang ống eppendort mới đ đánh dấu tên giống, rồi sau đ cho 800µl ethanol vào ly tâm 5 phút, 13000 vòng ở nhiệt độ 15 - 210C, để kết tủa DNA. Bỏ phần dung dịch phía trên, chỉ giữ lại phần kết tủa ở dƣới, để khô tự nhiên bằng cách úp ngƣợc ống nghiệm trên giấy thấm. Hoà tan kết tủa DNA trong 50µl TE, bảo quản ở nhiệt độ -200C. 2.2.2. Nhân CR phát hiện gen mùi thơm Vị tr nhân gen mùi thơm IFAP ESP 577 EAP 257 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 85 Trình tự mồi dùng trong CR (Louis MT Bradbury el al 2005 Tên mồi Trình tự External Sense Primer (ESP) TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG Internal Fragrant Antisense Primer (IFAP) CAT AGG AGC AGCTGA AAT ATA TACC Thành phần phản ứng PCR với thể tích mẫu 25 µl gồm: 0,2 µl Taq DNA Polymerase; 2,5 µl Taq Buffer 10 X; 2 µl MgCl2 25Mm; 0,5 µl dNTP 10mM; 2,5 µl ESP primer ; 2,5 µl IFAP primer; 13,8 µl nuclerase free water và 1 µl DNA tổng số. Thiết lập chu kì hoạt động: 940C trong 2 phút và 32 chu kỳ 940C trong 30 giây; 560C trong 30 giây; và 720C trong 30 giây và 720C trong 5 phút. 2.2.3. Điện di sản phẩm nhuộm màu phát hiện gen Sản phẩm sau khi chạy PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1%, 65V trong 45 phút. Nhuộm Ethymium bromide 10mg/ml trong 10 phút rồi chụp ảnh bằng máy chụp UV. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, sau khi tách chiết ch ng tôi tiến hành điện di DNA tách chiết được 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số Điện di sản phẩm chiết tách của các giống lúa thí nghiệm cho thấy các vệt băng DNA của tất cả các giống đều rõ, tập trung nhƣng chƣa gọn, điều này chứng tỏ DNA khá nguyên v n nhƣng chƣa tinh sạch. Nhƣng do thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu nên DNA tách chiết của các giống đều có thể thực hiện cho phản ứng PCR. 3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định gen quy định mùi thơm 3.2.1. Kết quả kiểm tra độ ch nh xác của mồi Trong nghiên cứu này đ sử dụng 2 mồi đơn ESP và IFAP để nhân lên đoạn DNA nhận biết cho tính trạng mùi thơm. Khi chạy PCR với giống thơm c chứa đột biến mất Giếng 1. Bắc thơm Giếng 2. IR64 Giếng 3. Jasmine Giếng 4. 10136 Giếng 5. 10143 Giếng 6. 10261 Giếng 7. 10062 Giếng 8. 10707 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 86 8bp và 3SNPs trong trình tự gen quy định sẽ cho vạch băng dài 257bp, còn với các giống không mang gen thơm sẽ không c băng DNA dài 257bp đƣợc nhân lên. Tiến hành kiểm tra độ chính xác của 2 mồi này. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên các giống đối chứng thơm và không thơm, kết quả thu đƣợc sau khi điện di sản phẩm PCR cho thấy chỉ với các giống đối chứng c hƣơng thơm: Bắc thơm và Jasmine thì xuất hiện vạch băng 257bp, với giống đối chứng không thơm IR64 thì không c vạch băng nào đƣợc nhân lên. Nhƣ vậy, khi sử dụng 2 mồi ESP và IFAP cho kết quả phát hiện gen chính xác 100%. 3.2.2. Kết quả xác định gen mùi thơm của tập đoàn giống l a địa phương Sử dụng hai mồi ESP và IFAP để xác định sự có mặt của gen mùi thơm trong tập đoàn giống lúa địa phƣơng. Kết quả điện di thể hiện ở hình 2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 2. Kết quả điện di xác định gen mùi thơm Giếng 1. Ladder Giếng 2. Bắc thơm Giếng 3. IR64 Giếng 4. 10252 Giếng 5. 10290 Giếng 6. 10081 Giếng 7. 10102 Giếng 8. 10059 Giếng 9. 10063-1 Giếng 10. 10130 Giếng 11. 10740 Giếng 12. 10266 Giếng 13. 10089 Giếng 14. 10703 Giếng 15. 10096 Giếng 16. 10120 Giếng 17. 10700 Giếng 18. 10160 Giếng 19. 10294 Nhận xét: Phát hiện thấy 5 giống chứa gen fgr là : 10102, 10059, 10089, 10096, 10063-1 Bảng 1. Kết quả chạy PCR phát hiện gen mùi thơm Các giống lúa địa phƣơng Gen fgr Các giống lúa địa phƣơng Gen fgr Các giống lúa địa phƣơng Gen fgr 1 10102 + 28 10250 - 55 10703 - 2 10109 - 29 10251 - 56 10706 - 3 10111 - 30 10252 - 57 10707 - 4 10113 - 31 10254 - 58 10708 - 5 10117 - 32 10255 - 59 10709 - 6 10120 - 33 10256 - 60 10710 - 7 10121 - 34 10259 - 61 10711 - 8 10122 - 35 10260 - 62 10715 - 9 10123 - 36 10261 - 63 10718 - 257bp 200bp 300bp TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 87 10 10125 - 37 10266 - 64 10721 - 11 10130 - 38 10269 - 65 10722 - 12 10135 - 39 10272 - 66 10724 - 13 10136 - 40 10290 - 67 10729 - 14 10143 - 41 10294 - 68 10733 - 15 10154 - 42 10059 + 69 10737 - 16 10160 - 43 10062 - 70 10740 - 17 10162 - 44 10066 - 71 10741 - 18 10164 - 45 10067 - 72 10745 - 19 10166 - 46 10081 - 73 10746 - 20 10177 - 47 10085 - 74 10748 - 21 10180 - 48 10087 - 75 10126-1 - 22 10235 - 49 10088 - 76 10126-2 - 23 10240 - 50 10089 + 77 10138-2 - 24 10241 - 51 10091 - 78 10182-1 - 25 10243 - 52 10096 + 79 10185-1 - 26 10247 - 53 10097 - 80 10185-2 - 27 10249 - 54 10700 - 81 10063-1 + 4. KẾT LUẬN Khi sử dụng 2 mồi ESP và IFAP để xác định sự có mặt của gen mùi thơm trong tập đoàn giống lúa địa phƣơng đ phát hiện 5 giống chứa gen mùi thơm fgr là: 10102, 10059, 10089, 10096 và 10063-1. Cần khảo sát đánh giá lại những giống đ phát hiện có gen mùi thơm và c hƣớng sử dụng các giống đ phát hiện ra gen thơm trong công tác chọn tạo giống nhằm tạo ra giống lúa thơm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2008), Một số vấn đề cần biết về gạo xuất khẩu, Nxb. Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. [2] Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2004), Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm trên l a, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, số 2. [3] Phạm Văn Phƣợng (2006), Ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS - AGE để nghiên ứu đặc điểm di truyền và chọn giống lúa, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ. [4] Juliano B.O. (1990), Rice grain quality: problems and challenges, Cereal food world 35, page 245-253. [5] Louis M.T Bradburry, Robert J Henry, Qing Sheng Jin, Russell F. Reink, Daniel L. E, (2005), Waters - A perfect marker for fragrange genotyping in rice - Molecular Breeding 16: pape 279 - 283. [6] Khush G.S. and N.Dela Cruz (2014), Developing Basmati srizes with high yiel potential, Chaper 2 Speciallity rice of the world. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 88 USING MOLECULAR MARKER TO DETECT AROMATIC CONTROLLING GENES (FGR) OF LOCAL RICE VARIETIES Nghiem Thi Huong, Nguyen Thi Van ABSTRACT This study focused on the application of DNA molecular marker to detect genes for fragrance in local rice varieties. 81 rice varieties, which were collected in different locations were studied. Two pairs of primers, ESP and IFAP were used to identify genes for fragrance which were recessive genes, FGR symbol, located on chromosome 8 closely linked to the RG28 marker. The results indicated that genes for fragrance (FGR gene) presented in 5 rice varieties including 10102, 10059, 10089, 10096 and 10063-1. This information plays an important role in creating the initial material for high quality rice breeding. Keywords: Rice, FGR genes, fragrance. * Ngày nộp bài: 30/3/2018; Ngày gửi phản biện: 26/4/2018; Ngày duyệt đăng: 4/3/2020