Sử dụng kỹ thuật das - Elisa và rt - pcr để phát hiện virus gây bệnh đốm võng trên cây đu đủ (papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ bảo và hỗ trợ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Con cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn dành tình thƣơng cho con; dạy dỗ, động viên con; là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn các Anh, Chị ở Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu cho em hoàn thành tốt khóa luận. Em chân thành cảm ơn anh Cƣờng- Viện Cây Ăn Quả miền Nam, anh Dũng- Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tiền Giang, anh Vinh- Trạm BVTV Tân Phú- Định Quán đã cung cấp tài liệu và tạo điều kiện thuận lợi cho em thu thập mẫu thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt quãng đƣờng sinh viên. Cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. TP. HCM, Tháng 9 năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG, Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra. - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này. - Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây 4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 % 6 - 8 tháng 85,71 % 8 - 11 tháng 12,50 % Trên 1năm 36,11 % Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 % Da bông (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phƣơng (Đp) 34,92 % v Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR - Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn. - Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P. Kết quả giải trình tự một số mẫu - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 619 bp. - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 410 bp. - Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp. So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14- M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P. Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. x DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................... xii PHẦN I ............................................................................................................................ 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 2 PHẦN II ........................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 3 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) ........................................................... 3 2.1.1. Phân loại học .................................................................................................. 3 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố ....................................................................................... 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 4 2.1.4. Nhu cầu sinh thái ............................................................................................ 5 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ ............................................ 6 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng ................................................................................... 6 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn .................................................................................. 7 2.1.6. Tình hình sản xuất .......................................................................................... 8 2.1.7. Sâu bệnh ......................................................................................................... 9 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính ........................................................... 10 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ ................................................................ 10 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ.......................... 11 vii 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật ................................................ 11 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) ........................ 15 2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV ...................................... 20 2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng ........................................................ 20 2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị ........................................................................ 20 2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử ....................................... 21 2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học ............................................................... 21 2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ............................................. 22 2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác .......................................................................... 22 2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay . 22 2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................................ 24 PHẦN III ....................................................................................................................... 27 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 27 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 27 3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu ......................................................................................... 27 3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) .................................................................................................................................... 28 3.3.1. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 28 3.3.2. Hóa chất ....................................................................................................... 29 3.3.3. Quy trình thực hiện ...................................................................................... 31 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ............................................................................. 31 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................... 35 PHẦN IV ....................................................................................................................... 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................... 39 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu ..................................................... 39 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA ................................... 40 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra ........................................................ 40 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây ................................................................. 42 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR ..................................................................................... 44 4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu ........................................................................ 53 viii PHẦN V ........................................................................................................................ 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 56 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 61 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CP gene: Coating protein gene DAS ELISA: Direct double antibody sandwich DMSO: Dimethylsulforxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EIA: Enzyme immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide FDA: Food and Drug Administration MMLV: Moloney murine leukemia virus mRNA: Messenger RNA OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate PRSV: Papaya ringspot virus PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ ........................................................................................................ 3 Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus ........................................................................ 12 Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây ............................................ 16 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá ................................................................................. 17 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) ................................. 18 Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả ................................................................... 18 Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) ............................................... 19 Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA .................................................................................. 24 Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn ........................................... 44 b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 ................................ 44 Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 .................................................................. 45 Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 .............................................................. 46 Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 ........................................................... 47 Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên ................................................. 50 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 ...................................................... 51 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 ........................................................ 52 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ ...... 6 Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) ..................... 9 Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm ........................................ 28 Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra .......................................... 40 Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây .................................................. 42 Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ....................................................................... 43 xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra ................................................... 41 Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây .................................................................. 42 Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 1 PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tính cấp thiết của đề tài Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị kinh tế hiện nay. Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hoặc để diệt khuẩn. Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986). Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác. Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn 2 đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ. Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp”. 1.2. Mục đích - Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp. - Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA. - Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ. - Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới. 1.3. Yêu cầu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc. - Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng. 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp. - Phạm vi nghiên cứu Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA. Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR 3 Hình 2.1 Cây đu đủ (Semillas del Caribe, 2003) PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) 2.1.1. Phân loại học - Tên khoa học: Carica papaya L. - Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ) Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn hoặc làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc, thuộc da. Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi nhƣ kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya. Ở Pháp, trái đu đủ đƣợc gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi đƣợc gọi theo tên nội địa là figuier des Iles. Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ đƣợc gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nƣớc. Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao. Ở Châu Âu, khi đƣợc phát hiện lần đầu tiên nó đƣợc đặt cho tên địa phƣơng là “tree melon” (James A. Duke, 1983). 4 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố Mặc dù hiện nay vẫn chƣa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhƣng cây đu đủ đƣợc đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998). Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và thƣờng nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng. Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trƣớc năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu thập đƣợc là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic. Từ đó việc trồng trọt đã lan rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616. Vào khoảng 1550, ngƣời Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ. Sau đó hạt đu đủ lại đƣợc lan truyền từ Ấn Độ sang Naples vào năm 1626. Ở Mỹ, hạt đu đủ đƣợc đem đến Florida từ Bahamas. Đến 1959, đu đủ đƣợc trồng phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhƣng chủ yếu là trong các vƣờn nhà và các trang trại với quy mô nhỏ. Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng nhƣ quần đảo thuộc Thái Bình Dƣơng và ngày càng trở nên thích hợp đƣợc với nhiều khu vực và nhiều vùng đất khác nhau. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo những nghiên cứu, khảo sát của James A. Duke trong Handbook of Enery Crop (1983) Thân, rễ Đu đủ là loại thực vật thân thảo, kích thƣớc lớn, sau khoảng một năm cây có thể cao từ 1,8 - 3 m, sau đó có thể đạt đến độ cao 6 m thậm chí là 9 m. Thân già có màu xám xanh, nâu xám hay nâu đỏ. Thân cây xù xì, lồi lõm do những vết sẹo của lá rụng, sẹo phát hoa để lại. Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi, phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng. Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thƣơng do cơ giới cũng nhƣ do ngập úng hay khô hạn. Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy 5 rất cần oxy, vì vậy chúng rất mẫn cảm khi đất chặt, bí hay ngập nƣớc, đất có độ ẩm cao cũng gây bất lợi cho sự phát triển của rễ. Lá Lá đơn, mọc thành chùm ở ngọn thân và xoắn theo hình trôn ốc với khoảng cách giữa các cuống lá là 30 - 105 cm. Lá lớn, cuống lá dài, phiến lá rộng, mỏng, mềm, xẻ thùy (khoảng 5 - 9 thùy). Gân lá màu hơi vàng, nổi rõ ở mặt dƣới phiến lá. Lá đu đủ rất dễ bị gãy, rách. Cần chú ý bảo vệ bộ lá vì số lá tỉ lệ thuận với số phát hoa mọc ra ở nách lá, khả năng đậu trái, độ lớn trái và năng suất thu hoạch. Hoa Hoa mọc ở nách lá, có năm cánh, cánh hoa dày, thƣờng nở vào ban đêm, có mùi hƣơng nhẹ. Thời gian từ khi nở đến khi tàn của một hoa kéo dài từ 3 - 5 ngày. Trái, hạt Đa số trái có hình dạng tƣơng tự trái dƣa (melon-like), ngoài ra còn có hình bầu dục hơi tròn, đôi khi có hình quả lê hoặc kéo dài ra thành hình dùi cui. Trọng lƣợng trái có thể lên đến 9 kg. Đối với những cây hoang dại trái có thể nhỏ hơn. Nằm sát thành phía trong của thịt quả là bó sợi màu trắng, mang các hạt hình trứng, màu đen nhƣ hạt tiêu. Chiều dài hạt khoảng 5 mm, đƣợc phủ bởi bao hạt bằng chất gelatin trong suốt. Trái đu đủ mang trung bình khoảng 300 - 500 hạt. Khi trái có đủ độ già thƣờng có khoảng 60 - 70 % hạt có thể mọc thành cây. 2.1.4. Nhu cầu sinh thái Khí hậu Đu đủ rất nhạy cảm với sự lạnh giá, giới hạn phân bố trong khoảng 32o Nam đến 32 o Bắc với nhiệt độ ấm áp khoảng 25oC và lƣợng mƣa 1200 mm/năm. Do đó cần lƣợng mƣa phải nhiều hoặc phải đƣợc tƣới nƣớc đầy đủ nhƣng cũng cần phải có sự thoát nƣớc tốt. Nếu ngập úng, cây sẽ chết trong vòng 48 giờ. Trong điều kiện nhiệt độ thấp khoảng 32oF (-0,56oC) sẽ gây hại cho cây, nếu cái lạnh cứ kéo dài cây sẽ chết. Đu đủ là một cây ƣa sáng, thiếu ánh sáng dẫn đến các đốt của thân vƣơn dài, cuống lá nhỏ, phiến lá mỏng và dễ bị sâu bệnh phá hoại nhƣ rệp, virus. 6 Đất đai Mặc dù ánh sáng là yếu tố cần nhất nhƣng bên cạnh đó đất trồng cũng cần giàu hữu cơ và tơi xốp. Tuy nhiên nhìn chung đu đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau song đất đó phải giữ nƣớc cũng nhƣ thoát nƣớc tốt và có độ thoáng nhất định, có tầng canh tác dày 70 cm, hàm lƣợng khí trong đất là 4 %. pH tối ƣu cho cây phát triển là 5,5 - 6,5. 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng Hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong các thành phần của cây đu đủ đƣợc công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James A. Duke, 1983) Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ Bộ phận Thành phần Trái Lá ( * ) Calories 23,11 - 25,8 Lƣợng nƣớc 85,9 - 92,6 g 83,3 % Protein 0,081 - 0,34 g 5,6 % Chất béo 0,05 - 0,96 g 0,4 % Carbohydrates 6,17 - 6,75 g 8,3 % Chất xơ 0,5 - 1,3 g 1,0 % Chất tro (Ash) 0,31 - 0,66 g 1,4 % Calcium 12,9 - 40,8 mg 0,406 % (CO) Phosphorus 5,3 - 22,0 mg Sắt 0,25 - 0,78 mg 0,00636 % Carotene ( ** ) 0,0045 - 0,676 mg 28,900 I.U. Thiamine 0,021 - 0,036 mg Riboflavin 0,024 - 0,058 mg Niacin 0,227 - 0,555 mg Ascorbic Acid 35,5 - 71,3 mg 38.6 % Tryptophan 4 - 5 mg Methionine 1 mg Lysine 15 - 16 mg Magnesium 0,035 % Phosphoric Acid 0,225 % ( * ): Phân tích đƣợc thực hiện tại Malaya ( ** ) : Lƣợng carotenoid trong đu đủ chủ yếu ở dạng cryptoxanthin. 7 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn Giá trị thực phẩm Đu đủ phổ biến nhất là đƣợc sử dụng dƣới dạng tƣơi sống. Ngoài ra còn có thể sử dụng làm món trái cây trộn, nƣớc sốt trái cây, coctail, thêm vào kem, bánh… Đu đủ chƣa chín không bao giờ đƣợc ăn do nó chứa rất nhiều nhựa. Thậm chí khi đƣợc sử dụng làm salad nó cũng cần đƣợc bỏ vỏ, hạt, đun sôi đến khi mềm. Trái chín có thể loại bỏ vỏ, hạt, phần thịt cho vào các chai hoặc can chứa để lên men làm rƣợu trái cây. Ở miền Đông Ấn Độ, lá đu đủ non có thể sử dụng nấu và ăn tƣơng tự nhƣ rau bina (rau Spinach). Các chùm hoa đực đƣợc bán sang các nƣớc Indonesia, New Guinea để nấu (có thay nƣớc nấu để loại bỏ vị đắng) và ăn nhƣ rau sống. Ở Indonesia, hoa đôi khi đƣợc sử dụng để làm kẹo. Ở Châu Phi, thân cây còn non có thể đƣợc sử dụng để nấu ăn. Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Italy và Somalia đã tìm thấy trong hạt đu đủ có chứa đến 18 acid amine gồm: glutamic acid, arginine, proline, aspatic acid, proline, tyrosine, lysine, aspatic acid, glutamic acid. Ngoài ra còn ly trích đƣợc tinh dầu có mùi hƣơng nhẹ từ hạt và tinh dầu này có thể đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hay trong kĩ nghệ công nghiệp. Giá trị thƣơng mại Nhựa thu đƣợc từ thân và trái đu đủ còn xanh chứa 2 loại enzyme phân giải protein là papain và chymopapain. Trong đó, chymopapain có số lƣợng nhiều nhất song papain lại có hoạt lực mạnh gấp đôi. Một công dụng đƣợc biết đến nhiều nhất của sản phẩm papain thƣơng mại là xử lý làm mềm thịt, đặc biệt là ở các hộ gia đình. Tại các lò mổ, ngƣời ta nhận thấy rằng nếu tiêm papain vào gia súc khoảng nửa giờ trƣớc khi mổ sẽ có tác dụng làm thịt mềm hơn bình thƣờng. Ngoài ra, papain còn đƣợc sử dụng để làm tinh khiết bia, xử lý len và sợi vải trƣớc khi nhuộm, xử lý da thú trong công nghiệp thuộc da, sử dụng nhƣ một chất bổ trợ trong sản xuất cao su, sử dụng xử lý gan cá ngừ trƣớc khi ly trích dầu để thu đƣợc lƣợng vitamin A và D nhiều hơn. Mặt khác, nó còn đƣợc bổ sung vào kem đánh răng, chất tẩy rửa, mỹ phẩm cũng nhƣ là các dƣợc phẩm trị về tiêu hóa. Papain 8 còn có khả năng điều trị những vết loét, hạn chế sự sƣng tấy, khả năng phát sốt và hàn dính vết thƣơng sau phẫu thuật. Gần đây, FDA (Cơ quan quản lý lƣơng thực và dƣợc phẩm Hoa Kỳ) đã khẳng định tác dụng của việc tiêm chemopapain vào đĩa sụn xƣơng sống của bệnh nhân để điều trị hoạt động thoái hoá các đĩa sống lƣng. (FDA Drug Bull. 12(3):17-18) Sử dụng trong dân gian Trong các bài thuốc dân gian ở miền nhiệt đới, nhựa tƣơi đƣợc bôi lên những vết sƣng tấy, trị mụn cóc, đốm tàn nhang và đƣợc sử dụng nhƣ một bài thuốc trị giun sán. Trái còn xanh, hạt khi tiêu hoá rất có hại, có khả năng gây sẩy thai. Tuy nhiên một vài nơi sử dụng chúng nhƣ một bài thuốc điều kinh và tẩy giun. Lá, rễ cũng có thể sử dụng làm thuốc tẩy giun. Lá khô đƣợc sử dụng dƣới dạng thuốc hút với công dụng làm dịu đi cơn hen suyễn hoặc sử dụng thay thế cho thuốc lá. Nhựa cây có thể sử dụng trị bệnh vảy nến, trị chứng khó tiêu, sát trùng tại chỗ, sử dụng đắp lên các vết bỏng, vết cháy… Hoa đƣợc dùng trị bệnh vàng da. Công dụng nhƣ một liều thuốc kháng sinh: những nghiên cứu tại trƣờng Đại học Nigeria đã phát hiện thấy dịch trích từ quả đu đủ chín, chƣa chín và từ hạt đều có hoạt tính chống lại vi khuẩn G+; sử dụng với liều mạnh có thể chống lại cả vi khuẩn G - . Dịch thu từ hạt đƣợc ly trích, sản xuất ra aglycone của glucotropaeolin benzyl isothiocyanate (BITC) có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn, nấm. Ở một bệnh viện tại London vào năm 1977, trong một ca bị nhiễm khuẩn sau phẫu thuật trên một bệnh nhân đƣợc thay thận, bệnh nhân này đã đƣợc cứu chữa chỉ bằng một mảnh đu đủ đắp lên vết thƣơng và để trong 48 giờ, trong khi đó tất cả các phƣơng thuốc hiện đại lúc bấy giờ đều không hiệu quả. 2.1.6. Tình hình sản xuất Trên thế giới Đối với một vƣờn cây đu đủ bình thƣờng, một cây có thể cho 2 - 4 trái chín/ tuần trong suốt mùa thu hoạch. 9 Cây khỏe mạnh, nếu đƣợc chăm sóc tốt, năng suất trung bình là 34 kg/cây/năm; một số cây cá biệt có thể cho đến 136 kg/cây/năm. Ở Nam Phi, năng suất trung bình vào năm thứ 4 là 100 kg/cây. Với mật độ 1000 cây/ha cho năng suất trung bình là 30 tấn. Ở khu vực Hilo của đảo Hawaii, năng suất trung bình là 37 tấn/ha. Với một diện tích là 100 ha, Princess Orchards ở Maui cho 68 kg/tuần trong suốt mùa thu hoạch. Ở khu vực Kapoho của Hawaii, năng suất trung bình là 38000 kg/ha trong năm đầu tiên, 25000 kg/ha vào năm thứ 2. Cây đu đủ cho khoảng 50 % sản lƣợng papain vào năm đầu tiên, 30 % và năm thứ hai và 20 % vào năm thứ ba. Năng suất thu hoạch trung bình 70 - 130 kg/ha. Theo thống kê, năng suất papain thô/ha vào năm đầu tiên là 20 - 25 kg; năm thứ hai là 90 - 100 kg; năm thứ ba là 60 - 90 kg/ha; 30 - 40 kg/ha vào năm thứ tƣ; 20 hoặc ít hơn vào năm thứ năm. Ngƣời ta cũng ƣớc lƣợng rằng 1 kg papain thô tƣơng ứng với khoảng 5 kg nhựa tƣơi (James A. Duke, 1983). Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (*) (Trần Thế Tục, 1998) Năm 1979 - 1981 1991 1992 1993 Sản lƣợng 3,016 5,024 5,421 5,563 (đơn vị tính là 1000 tấn) ( * ): Nguồn FAO Yearbook- Production. Vol. 47. 1993. Rome 1994. Ở Việt Nam Ở nƣớc ta hiện nay, do sâu bệnh, úng nƣớc và điều kiện thời tiết không thuận lợi cho việc ra hoa, kết trái nên năng suất đu đủ trung bình chỉ khoảng 20 tấn/ha (Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Tiền Giang, 2003). Đồng thời ở Việt Nam, đu đủ chỉ đƣợc trồng với mục đích thu hoạch trái phục vụ cho mục tiêu thực phẩm (ăn tƣơi, sản xuất nƣớc ép hoa quả, bánh kẹo,…) và cũng chỉ sản xuất với quy mô nhỏ và vừa, phục vụ cho nhu cầu trong nƣớc mà thôi. 2.1.7. Sâu bệnh Theo Nguyễn Thành Hối (1996), các loại sâu bệnh trên đu đủ bao gồm: 10 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính a) Rệp sáp (gồm 5 họ Asterolecanniidae Coccidae Diaspididae Margarodiae Pseudococcidae) (Nguyễn Mạnh Chinh, 2002) Thƣờng là loại rệp có màu trắng xám, phát triển nhiều trong mùa nắng. Rệp có kích thƣớc 2 - 3 mm, bám sát vào ngọn thân, lá, trái, bông… chích hút nhựa cây, lá làm trái kém phát triển và dễ bị nấm bồ hóng tấn công gây bệnh. b) Rệp dính (rầy mềm- Aphididae) Đeo bám, chích hút ở trái, đọt non hoặc ở mặt dƣới lá. c) Nhện đỏ (rầy lửa- Tetranychus seximaculatus) Nhện có màu hồng nhạt đến đỏ đậm, rất nhỏ (dƣới 1 mm) nên phải quan sát kĩ mới phát hiện đƣợc, thƣờng bám ở phía mặt dƣới lá và trên trái. Nơi bị chích hút nặng lá bị vàng loang lổ từng đốm nhỏ, sau đó bị cháy đi. Khi bị nặng lá có thể bị cháy hoàn toàn. d) Ruồi đục trái (Toxotrypana curvicauda) Thƣờng chỉ gây hại nặng khi trái để chín cây. Ruồi đục vào trái để đẻ trứng, giòi nở ra sẽ gây thối trái. 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ (Nguyễn Thành Hối (1996), Nguyễn Văn Thành (1997)) a) Bệnh thối gốc ( do nấm Pythium spp) Bệnh chủ yếu do loài Pythium aphanidermatum gây ra. Nấm bệnh tồn lƣu trong xác bã cây bệnh có trong đất và sinh sản rất nhiều noãn bào tử để lây lan. Bệnh phát triển mạnh nhất khi trời nóng ẩm. Ẩm độ quanh gốc cây càng cao, bệnh phát triển càng mạnh. b) Bệnh đốm lá (do nấm Phyllosticta sulata) Trên lá, đốm bệnh có hình tròn, hình trứng, thon dài hay có hình dạng bất kì. Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng, viền có màu vàng hay nâu. Vùng bệnh khô và mỏng dần rồi rách đi. 11 Mầm bệnh tồn lƣu rất lâu trong xác lá cây bệnh và phát tán theo gió để lây lan. Do đó nên tiêu hủy xác lá bệnh để tránh lây lan. c) Bệnh cháy lá (do nấm Helminthosporium rostratum) Phần chóp của các lá bên dƣới có các đốm úng nƣớc, lan dần vào bên trong lá làm lá bị nâu và khô đi. Nếu nhiễm nặng, cuống lá bị héo, mềm và lá bị rụng. d) Bệnh phấn trắng (do nấm Oidium caricae) Mặt dƣới lá bị đóng phấn màu trắng, nếu nhiễm nặng lá sẽ phát triển kém, có thể bị biến dạng chút ít. Trái cũng bị các đốm phấn trắng tròn hay bầu dục và phát triển kém. e) Bệnh khảm (do Papaya mosaic virus) Bệnh phổ biến và quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng ở Đồng bằng sông Cửu Long. Cây con mới trồng cũng có thể nhiễm bệnh song thƣờng thấy ở cây đã đƣợc 1 - 2 năm tuổi. e) Bệnh đốm vòng (do Papaya ringspot virus) Cùng với bệnh khảm, bệnh đốm vòng cũng khá phổ biến và nghiêm trọng cho đu đủ ở Đồng bằng sông Cửu Long. f) Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis) Cả hai loại tuyến trùng đều phá hoại rễ và gây thiệt hại cho đu đủ. Cây con nhiễm nặng có thể chết, còn cây trƣởng thành có thể giảm sức sinh trƣởng. 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật Sự phát hiện ra virus hại thực vật Từ hàng ngàn năm về trƣớc, khi xã hội loài ngƣời phát triển còn rất thấp, thiên nhiên và môi trƣờng đang đƣợc bảo tồn hầu nhƣ giữ nguyên trạng thái hoang sơ ban đầu, con ngƣời đã nhận ra sự phá hoại của virus hại thực vật, điều này đƣợc thể hiện trong kinh thánh và những văn bia còn lƣu lại cho đến ngày nay. Tuy nhiên phải đến những năm 1600 - 1660, lịch sử mới ghi chép lại nhóm bệnh này qua những bức họa mô tả triệu chứng bệnh virus trên hoa tulip của các danh họa Tây Âu (mà nay hiện còn đƣợc lƣu giữ trong các bảo tàng). Sau đó mãi đến cuối thế kỉ XIX, virus hại thực vật mới chính thức đƣợc phát hiện với công lao của nhiều nhà khoa học nhƣ: Mayer A. (1886), Ivanopski D. (1892), Baijerinck M. (1898), Loeffler và Frosh (1898). Đến đầu 12 thế kỉ XX, các virus gây bệnh cho thực vật lần lƣợt đƣợc phát hiện nhƣ: virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây… Nhƣng mãi tới năm 1939 khi Kaushe Pflankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus TMV (virus khảm thuốc lá) thì việc nghiên cứu và phát hiện nhóm nguyên nhân gây bệnh này mới phát triển nhanh chóng và thu nhiều thành tựu to lớn. Ngày nay, virus học (Virology) là môn khoa học hiện đại, ứng dụng rất nhiều thành tựu của sinh học phân tử. Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus (Potyvirus, Spring, 2001) Thiệt hại của bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) - Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần dần tàn lụi. Tuy nhiên, virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong các vụ trồng cây hằng năm nhƣ virus gây bệnh vàng lụi lúa, xoăn lá cà chua, thoái hóa khoai tây, khảm sọc lá hành tây,… - Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Chẳng hạn, hạt lúa bị bệnh vàng lụi thƣờng bị lép không thu hoạch đƣợc, hoặc sẽ rất nhỏ, hạt gạo bị đen, ăn có vị đắng. - Bệnh virus còn nguy hiểm ở chỗ: virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây chủ vì vậy virus chỉ bị chết hay mất hoạt tính khi nào tế bào cây bị chết, hủy hoại. Đối với những cây trồng nhân giống vô tính nhƣ cam, quýt, khoai tây, khoai lang… virus là nguy cơ hủy diệt rất lớn. Chúng rất khó phát hiện và loại trừ. 13 Đặc tính chung của virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Virus thực vật là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Virus có cấu tạo rất đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và acid nucleic. Lõi nucleic ở bên trong và đƣợc bao bọc bằng một lớp vỏ protein (vỏ capsid). Thƣờng acid nucleic của virus thực vật là RNA và chỉ khoảng hơn 25 loài virus có lõi là DNA. Virus gây bệnh cây thƣờng chỉ có một loại protein. Virus kí sinh ở mức độ tế bào. Một virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus khác nhau. Trong tế bào chủ, nó sẽ điều khiển tế bào chủ dùng vật chất từ chính tế bào chủ để tạo thành nhiều virus mới. Cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết. Triệu chứng bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Việc phân loại triệu chứng bệnh virus hại thực vật có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán, phòng trừ và nghiên cứu bệnh hại. Tuy nhiên, sự phân loại triệu chứng bệnh chỉ có tính chất tƣơng đối vì diễn biến bệnh rất phức tạp. Virus sau khi xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta có thể quan sát bằng mắt thƣờng, song cũng có nhiều trƣờng hợp không thấy biểu hiện gì khác thƣờng mà ngƣời ta gọi là “bệnh ẩn”. Qua nghiên cứu, nhiều nhóm tác giả đã chia triệu chứng bệnh thành các nhóm sau: Khảm lá Đây là triệu chứng phổ biến nhất với hầu hết các bệnh virus hại cây. Virus xâm nhiễm vào lá gây ra hiện tƣợng lá bị loang lổ, chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng. Ví dụ nhƣ virus khảm thuốc lá, khảm lá ớt, khảm dƣa chuột. Khảm đốm có hình nhẫn Thƣờng gặp là khảm và tạo ra đốm chết hoại hình nhẫn (đốm vòng) nhƣ bệnh đốm hình nhẫn trên đu đủ, cây mận, thuốc lá, hoa cẩm chƣớng. Triệu chứng hại gân lá Là hiện tƣợng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân lá sáng, gân chết, biến dạng,… nhƣ virus Y hại thuốc lá, khoai tây. Khảm lá, lùn cây Đây là hiện tƣợng khá phổ biến của bệnh virus nhƣ khảm lùn cây ngô, vàng lùn cây lúa. 14 Biến dạng Nhƣ xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá hồ tiêu, ớt. Biến vàng Nhƣ vàng ở lúa, vàng lá cam, lá đậu. Hiện tƣợng tàn lụi Cây còi cọc, lùn, mọc từng búi nhƣ bệnh lùn bụi ở lạc, bệnh triteza ở cam, chanh. Gây vết chết ở thân cây Bệnh vàng lá ở cam gây ra vết lõm ở thân các cây cam, chanh; virus sƣng cành táo. Biến dạng củ, quả Nhƣ bệnh đốm héo cà chua, bệnh vàng lùn khoai tây, bệnh virus ở táo, mận. Sự truyền bệnh ở virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Virus có cơ chế truyền bệnh rất thụ động do virus là vật kí sinh tuyệt đối ở mức độ tế bào. Vì vậy, sự lan truyền của bệnh có những đặc điểm riêng, khác các nhóm vi sinh vật khác. Sự truyền bệnh không nhờ môi giới - Truyền bệnh qua nhân giống vô tính thực vật: Chẳng hạn truyền qua nuôi cấy mô tế bào; qua hom giống chiết từ cây bị bệnh, qua mắt ghép, cành ghép, chồi ghép, gốc ghép bị nhiễm bệnh. Các cây trồng nhân giống vô tính bằng củ nhƣ khoai tây, cây cảnh, cũng có nguy cơ truyền nhiễm virus rất lớn. - Truyền bệnh qua hạt giống và phấn hoa: Virus thƣờng truyền qua hạt giống song cũng có khoảng 100 virus lan truyền đƣợc qua hạt giống. Phần lớn nhóm này là các virus ở những cây họ bầu bí, họ đậu. - Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Thƣờng xảy ra với các bệnh virus có tính chống chịu cao với điều kiện môi trƣờng. Lá cây trồng ở mật độ dày và giao tán có thể lây lan lẫn nhau khi lá cây bệnh cọ sát vào lá cây khỏe. Các vết thƣơng gây nên do côn trùng, các động vật khác, máy móc, dụng cụ canh tác, thu hái cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền cơ học, tiếp xúc nhờ giọt dịch. Một số virus có sức chống chịu kém hơn trong điều kiện môi trƣờng thiên nhiên thƣờng vừa lây bằng cơ học tiếp xúc lại vừa lây bằng côn trùng. Sự truyền bệnh nhờ môi giới 15 - Côn trùng là nhóm môi giới truyền bệnh virus quan trọng nhất. Có thể chia các kiểu truyền bệnh qua côn trùng và các động vật thành 3 nhóm virus + Nhóm truyền theo kiểu bền vững: Là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian dài từ một vài tiếng đến một tuần lễ mới có khả năng lây bệnh cho cây. Ví dụ gây bệnh xoăn lá cà chua (Tomato leafcurl virus), virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (Potato leafrool virus) + Nhóm truyền bệnh theo kiểu không bền vững: Gồm những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ một vài phút đến một giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây đến 30 phút chích hút ở cây bệnh sau đó có thể lây lan ngay. Điển hình là các virus thuộc nhóm potyvirus nhƣ: virus đốm vòng đu đủ (Papaya ringspot virus), khảm lùn ngô (Maize dwarf mosaic virus). + Nhóm truyền bệnh nửa bền vững: Gồm các virus có đặc tính truyền trung gian giữa hai nhóm trên. Điển hình là virus Tungro hại lúa, virus Triteza hại cam chanh,… - Nhện thuộc họ tám chân, chúng có mật độ khá cao trên các cây kí chủ nhƣng phạm vi kí chủ của nhện hẹp hơn các loài côn trùng khác, có thể truyền đƣợc khoảng hơn 9 loài virus gây hại ở thực vật. - Tuyến trùng có thể truyền đƣợc khoảng 20 loài virus gây hại cây. Các loài tuyến trùng thƣờng truyền những virus không bền vững (non-persistant), một số tuyến trùng có thể giữ virus trong cơ thể chúng trong một thời gian khá dài, một vài tháng thậm chí cả năm (chẳng hạn tuyến trùng Xiphinema truyền bệnh virus hại nho). - Nấm trong quá trình gây bệnh và xâm nhập vào cây khỏe có khả năng mang theo virus gây hại cho cây. Đặc biệt là các loài nấm sống dƣới đất. - Cây tơ hồng (Cuscuta sp.)- là loài thực vật dại rất phổ biến ở nƣớc ta. Đây là một loài thực vật thƣợng đẳng kí sinh tạo rễ ăn sâu vào thân các cây sống để hút nhựa. Chính vì vậy có khá nhiều loài virus thực vật có thể di chuyển theo thân cây tơ hồng và lây lan từ cây này sang cây khác. 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) Tác nhân gây bệnh 16 Phân loại: Họ: Potyviridae Giống: Potyvirus Loài: Papaya ringspot virus Tên viết tắt: PRSV Dòng: type P Nguồn gốc: PRSV-p đƣợc phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1949 trên cây đu đủ ở Hawaii (Jensen, 1949), sau đó bắt đầu xuất hiện nhiều báo cáo về loài virus này từ khắp các khu vực trồng đu đủ trên thế giới. Còn về vùng địa lý đầu tiên xuất hiện loài virus này vẫn chƣa đƣợc xác định chính xác. Đặc điểm: Papaya ringspot virus (PRSV)- thuộc nhóm potyvirus. Là một virus với acid nhân là RNA, sợi đơn (ssRNA, positive-strand viruses), xoắn ngoằn ngoèo, kích thƣớc sợi 760 - 800 nm, đƣờng kính 12 nm với bộ gen có kích thƣớc tổng cộng là 12 kb. Ở cây bị nhiễm, virus đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của cây, chúng tạo nên các thể vùi hình trụ (cylindrical incusions- CI) hoặc vô định hình (amorphous inclusion- AI) trong tế bào chất, không bào của mô cây bị nhiễm. Song những tế bào này không chứa các virion, trong khi đó nhựa cây thƣờng chứa rất nhiều virion. Mỗi một virion gồm khoảng 5,5 % nucleic acid và 94,5 % protein (Marc Fuchs, 1997). Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây (Mark A. Ross, 2002) PRSV đƣợc chia làm hai dạng PRSV-w và PRSV-p. Trong đó, PRSV-p xâm nhiễm và gây hại trên hầu hết các loài đu đủ và cây thuộc họ bầu bí trên thế giới, còn 17 PRSV-w chỉ xâm nhiễm trên những cây thuộc họ bầu bí, không xâm nhiễm trên cây đu đủ (Gonsalves, 1998 và Tennant et al., 1994). Tuy nhiên, trên thực tế rất ít khi phát hiện thấy PRSV-p trên các cây họ bầu bí trên đồng ruộng mà chỉ có thể thấy trên các cây họ bầu bí trong điều kiện thí nghiệm mà thôi. Một vài nghiên cứu đƣa ra giả thuyết rằng PRSV-p là một dạng đột biến từ dạng PRSV-w; song những nghiên cứu cụ thể về sự tiến hoá này vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng. Do theo những khảo sát về trình tự DNA mã hoá protein vỏ (coat protein- CP) của virus ở Australia, trình tự này rất giống nhau giữa hai loài P và W; song loài PRSV-w đã đƣợc tìm thấy ít nhất là 20 năm trƣớc khi phát hiện thấy loài PRSV-p. PRSV-p bao gồm một số loài, loài tìm thấy ở Hawaii khác với loài tìm thấy ở Thái Lan hay Florida. Do đó, phƣơng pháp khống chế mầm bệnh ở mỗi vùng cũng không giống nhau (Marison F, 2002). Phân bố địa lý Phân bố rộng khắp vùng Trung Đông, Nam và Trung Mỹ; Trung Quốc, Pháp, Đức, Ấn Độ, Ý, Mexico, Đài Loan, và đặc biệt là ở Mỹ. Triệu trứng (Vũ Triệu Mân (1999) và Duke J. (1983)) Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản lƣợng trái bị giảm, lá bị khảm và biến dạng. Ở lá, bệnh thƣờng tạo ra các đốm sáng màu vàng nhạt lúc đầu, lá hơi co và khảm nhẹ. Sau dần, vết đốm phát triển thành những đốm hình nhẫn, xuất hiện rất nhiều trên bề mặt lá. Ở mặt trên của các lá đọt, vùng mô lá ở giữa gân phụ và gân nhánh bị nhăn phồng. Bìa lá non bị uốn cong vào theo mặt dƣới lá. Bìa lá già thì cuốn lên. Khi cây bị bệnh nặng, lá non thƣờng bị mất thùy, chỉ còn cuống, đôi khi cả cuống cũng bị biến dạng, co quắp. Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá 18 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) (Mark A. Ross, 2002) Ở quả, lúc đầu vết bệnh là những đốm thâm xanh thẫm, sau đó lớn dần thành các đốm hình nhẫn màu xanh thẫm. Vết bệnh thƣờng tập trung ở nửa trên của quả, gần về phía cuống. Khi quả già, chính các vết thâm này sẽ thối sâu vào bên trong quả gây hỏng quả. Bệnh còn tạo các sọc dầu, màu xanh trên ngọn thân và cuống lá. Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả (Denis Persley, 2004) Trái bệnh bị nhạt do virus làm giảm lƣợng đƣờng trong trái. Cây đu đủ ở bất kì độ tuổi nào cũng đều rất nhạy cảm với virus này, song đối với các cây còn non, khi bị nhiễm sẽ không chết, vẫn sống nhƣng còi cọc và không có khả năng cho trái. Đƣờng lây nhiễm (Vũ Triệu Mân, 1999) PRSV là một loài vi sinh vật sống kí sinh. Chúng lây truyền từ cây chủ này sang cây chủ khác thông qua một vector. Đó là hai loài aphids (rầy mềm hay rệp muội), Aphis gossypii (rệp bông) và Myzus persicae (rệp đào), chúng mang theo virus trên cơ thể và truyền sang cây khi chúng chích hút cây, và truyền theo phƣơng thức không bền vững 19 (non-persistant). Trong sự lây truyền bệnh, virus cần sự hiện diện của một protein là AI (amorphous inclusion protein) đóng vai trò nhƣ một nhân tố hỗ trợ cho sự lây truyền thông qua côn trùng. Ngoài ra, bệnh còn có thể bị lây truyền từ cây bệnh sang cây lành nếu con ngƣời chạm vào cây bệnh rồi sau đó chạm vào cây lành hoặc lây truyền trực tiếp qua các vết thƣơng cơ học. Bệnh lây lan nhanh nhất là ở các cây từ 5 - 6 tháng tuổi. Virus không truyền qua hạt của trái bệnh. Đồng thời virus không có khả năng tồn tại trong môi trƣờng đất và trong các mô cây đã bị chết. Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) (Introduction to plant virus, Featured creatures) Mức độ nguy hại Ở Hawaii, ngành thƣơng mại đu đủ bắt đầu vào những năm 1940 với diện tích trồng ban đầu là 500 mẫu Anh (acres) ở hòn đảo Oahu thuộc quần đảo Hawaii. Đến năm 1945, PRSV đƣợc phát hiện lần đầu tiên tại Hawaii, sau đó vào những năm 1950 nó đã trở thành nguyên nhân chính gây nên thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất đu đủ ở Oahu (Golsalves, 1998). Điều này đã khiến cho nền sản xuất đu đủ ở Oahu ngƣng trệ hẳn. Tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ đu đủ, ngƣời dân ở đảo Hawaii bắt đầu chuyển sang chuyên canh đu đủ ở quận Puna, cũng thuộc đảo Hawaii. Nguyên nhân là do Puna là một vùng đất đƣợc xem nhƣ là miễn nhiễm với PRSV trong suốt hơn 30 năm, mặc dù các khu vực lân cận hầu nhƣ phá sản trƣớc thiệt hại từ PRSV. Tuy nhiên, vào 1992, PRSV đã bắt đầu lan truyền đến Puna và nhanh chóng lan rộng khắp nơi. Chỉ trong vòng 1 năm sau khi xuất hiện PRSV, ngƣời nông dân nơi đây đã chứng kiến sự hủy diệt khủng khiếp của nó: vào năm 1992 sản lƣợng đu đủ ở Puna là 53 triệu pounds, đến 1993, sản lƣợng suy giảm đến 15 triệu pounds, đến 1998, sản lƣợng chỉ còn 23 triệu pounds. 20 Ở Philippines, đu đủ là loại trái cây xếp thứ 6 trong tổng sản lƣợng trái cây (Philippines Recommends for Papaya, 1977). Vào 1984, khi PRSV bắt đầu xâm nhiễm vào 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite, đã làm thiệt hại năng suất lên đến 300000 USD. Sau đó bệnh lan truyền rất nhanh sang những vùng trồng đu đủ khác ở Cavite và một số tỉnh thuộc phía Nam Tagalog, đặc biệt là ở Laguna và Batangas. Tƣơng tự, nền sản xuất đu đủ ở phía nam Luzon, Philippines đã từng là một nền sản xuất mang lại nhiều lợi nhuận cho đến khi có sự bùng nổ của dịch bệnh do PRSV. Nó đã làm thiệt hại đến 80 % sản lƣợng đu đủ nơi này, và hiện nay nó đã lan rộng khắp Luzon, Visayas và một số nơi thuộc Mindanao (Swain, 2001) Biện pháp phòng trừ tổng hợp - Cần tìm kiếm, khảo nghiệm cũng nhƣ nhập nội các giống đu đủ kháng bệnh. - Tạo nguồn cây con sạch bệnh trong vƣờn ƣơm, cách ly chống r