Sử dụng kỹ thuật rflp khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau

LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. Các thầy cô Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật thuộc khoa Nông Học đã tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện tốt đề tài. Bạn Lê Tuấn Kiệt cùng toàn thể lớp CNSH 27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài và 4 năm qua. Thành kính ghi ơn bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con được như ngày hôm nay, cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường. Chân thành cảm ơn. Tp. HCM, tháng 09 năm 2005 Sinh viên Nguyễn Thị Tiến Sỹ TÓM TẮT NGUYỄN THỊ TIẾN SỸ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani PHÂN LẬP TỪ NHIỀU CÂY KÝ CHỦ KHÁC NHAU”. Giáo viên hướng dẫn: ThS. TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài được thực hiện trên đối tượng là nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật RFLP nhằm mục tiêu khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng nấm này, để dễ dàng cho việc đưa ra các biện pháp phòng trừ bệnh do nấm này gây ra. Đề tài được thực hiện tại phòng thực tập Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 01/03/05 đến 30/08/05. Nội dung nghiên cứu: Nhân sinh khối các dòng nấm R. solani. Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng phương pháp PCR. Thực hiện phản ứng cắt vùng rDNA-ITS đã được khuếch đại bằng các enzyme cắt hạn chế. Phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng nấm R. solani dựa trên kết quả cắt của các enzyme. Kết quả đạt được: Thu sinh khối và ly trích DNA của 45 dòng nấm R. solani. Cải tiến quy trình PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani với cặp primer ITS 4 và ITS 5. Khuếch đại được vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani. Với 9 dòng nấm RM-61, BV-61-02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73 và ĐHL-63, khi cắt với các enzyme hạn chế Alu I, Hae III, và Taq I cho ra các đoạn cắt giới hạn có kích thước khác nhau. Phân tích ITS-RFLP cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và ĐHL-63) thuộc 6 nhóm khác nhau. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các hình viii Danh sách các bảng ix Danh sách chữ viết tắt x Phần I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu 1 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Giới hạn của đề tài 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani 3 2.1.1. Đặc điểm hình thái 3 2.1.2. Đặc điểm sinh lý 4 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy 4 2.2. Điều kiện phát sinh bệnh 4 2.3. Phạm vi ký chủ của nấm R. solani 5 2.4. Sự phân nhóm của nấm R. solani 6 2.5. Các phương pháp phân tử thường dùng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm R. solani 8 2.5.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 8 2.5.1.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 8 2.5.1.2. Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng PCR 8 2.5.1.3. Tiến hành phản ứng PCR 9 2.5.1.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 10 2.5.1.5. Lợi ích của phản ứng PCR 10 2.5.2. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 11 2.5.2.1. Restriction endonuclease 11 2.5.2.2. Nguyên tắc của phương pháp 11 2.5.2.2. Quy trình của phương pháp 11 2.6. Cơ sở khoa học của việc sử dụng đoạn rDNA-ITS trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm R. solani 12 2.6.1. Giới thiệu về vùng rDNA 12 2.6.2. Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền 14 2.7. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về sự đa dạng của nấm R. solani 15 2.7.1. Nghiên cứu ngoài nước 15 2.7.2. Nghiên cứu trong nước 17 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18 3.1. Thời gian và địa điểm 18 3.2. Nội dung nghiên cứu 18 3.3. Nguồn nấm Rhizoctonia solani 18 3.4. Phương pháp tiến hành 18 3.4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani 18 3.4.2. Ly trích DNA tổng số (isolation of DNA) của nấm R. solani 19 3.4.3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 21 3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose 22 3.4.5. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 23 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani 24 4.2. Khuếch đại vùng rDNA-ITS thông qua phản ứng PCR 25 4.2.1. Lượng DNA khuôn 25 4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt 26 4.2.3. Khảo sát nồng độ primer 27 4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani 28 4.3. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 29 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2. Đề nghị 33 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Phần VII. PHỤ LỤC 37 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Chu kỳ gây bệnh của nấm Rhizoctonia solani 5 Hình 2.2. Sơ đồ của các vùng trên rDNA và các primer được sử dụng để nghiên cứu rDNA của nấm 12 Hình 2.3. Sơ đồ của vùng rDNA-ITS của nấm 14 Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng nấm R. solani chưa xử lý RNase 24 Hình 4.2. Ảnh điện di DNA của một số dòng R. solani sau khi pha loãng 25 Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chu trình nhiệt khác nhau 26 Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các nồng độ primer khác nhau 27 Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 29 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I 30 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Hae III 31 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Taq I 31 Hình 7.1. Ảnh của sợi nấm R. solani sau khi nuôi lắc 4 ngày 42 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1. Hỗn hợp để thực hiện phản ứng PCR 21 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 21 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng enzyme cắt 22 Bảng 4.1. Các chu trình nhiệt được khảo sát 26 Bảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR 28 Bảng 4.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 28 Bảng 4.4. Chiều dài các đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS được ước lượng (tính bằng bp) của 9 dòng nấm R. solani khi cắt với 3 enzyme Hae III, Alu I và Taq I 32 Bảng 7.1. Danh sách các dòng nấm R. solani được sử dụng trong đề tài 37 Bảng 7.2. Những trình tự primer trên tiểu đơn vị nhỏ của rDNA 38 Bảng 7.3. Những trình tự primer trên tiểu đơn vị lớn của rDNA 40 Bảng 7.4. Những trình tự primer trên vùng IGS và 5S của rDNA 41 Bảng 7.5. Những trình tự primer trên vùng ITS và 5.8S của rDNA 41 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AG : Anastomosis Group – nhóm tiếp hợp ITS : Internal Transcribed Spacer – vùng dịch mã trong nhân R. solani : Rhizotonia solani Kuhn DNA : Deoxyribonucleotide Acid rDNA : ribosome DNA PCR : Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi Polymerase AFLP : Amplified Fragments Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại RAPD-PCR: Random amplified polymorphic DNA -polymerase chain reaction RFLP : Restriction Fragments Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn PGA : Potato Glucose Agar PGB : Potato Glucose Broth PDYA : Potato Dextrose Yeast Agar PDA : Potato Dextrose Agar ctv. : Cộng tác viên STT : Số thứ tự ng : nano gram µM : micro mol TE : Tris EDTA µg : micro gram µl : micro lit TAE : Tris Acetic EDTA bp : base pair dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate ATP : Adenine triphosphate TTP : Thymine triphosphate CTP : Cytosine triphosphate GTP : Guanine triphosphate ddNTP : dideoxyribonucleotide – 5-triphosphate ISGs : intraspecific groups SDS : sodium dodecyl sulfate EDTA : ethylenediamine – tetraacetic acid SSU : small subunit LSU : large subunit ETS : external transcribed spacer IGS : intergenic spacer