Sự lưu hành type huyết thanh vi khuẩn vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

43 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 SÖÏ LÖU HAØNH TYPE HUYEÁT THANH VI KHUAÅN VIBRIO CHOLERAE PHAÂN LAÄP TAÏI TÆNH TRAØ VINH Nguyễn Thị Đấu1, Nguyễn Thùy Linh1, Hồ Thị Việt Thu2 TÓM TẮT Từ 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio cholerae phân lập trong nghiên cứu trước đây đã được sử dụng để định danh loài bằng kỹ thuật PCR và các xét nghiệm sinh hóa (theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872- 1:2007). Kết quả định type huyết thanh học cho thấy có 6 chủng V. cholerae đều thuộc type O1, với 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính với Ogawa. Không có chủng nào thuộc type O139. Chỉ số bám dính vi khuẩn V. cholerae vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả là 55,7±13,9 và 59,3±4,2; cao hơn so với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả (12,4±0,6 và 7,41±1,9). Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có kháng nguyên ngưng kết với type huyết thanh của vi khuẩn đã sử dụng để sản xuất vaccine phòng bệnh tả (moORCVAX) hiện có ở Việt Nam. Từ khoá: Vibrio, V. cholerae, type huyết thanh. Circulation of the serotype of Vibrio cholerae isolated in Tra Vinh Nguyen Thi Dau, Nguyen Thuy Linh, Ho Thi Viet Thu SUMMARY From 25 Vibrio cholerae strains obtained in last study was conducted for serotyping by PCR and biochemical (ISO/TS 21872-1:2007). The serotyping results showed that there were six Vibrio cholerae strains belonged to biotype O1, with 50% (3/6) strains were positive with Inaba, and 50% (3/6) strains were positive with Ogawa. There was not strain belonged to biotype O139. The adhesion indexes of V. cholerae strains were 55.7±13.9 and 59.3±4.2 in the intestinal mucosa of the rabbits were not orally administered with cholerae vaccine. These indexes were 12.4±0.6 and 7.41±1.9, higher than those of rabbits administered with cholerae vaccine. The studied result also showed that the isolated strain shared the same serum type with the bacteria strain that was used to produce cholerae vaccine (moORCVAX) which was available in Viet Nam. Keywords: Vibrio, V. cholerae, serotype. 1. Đại học Trà Vinh 2. Đại học Cần Thơ I. GIỚI THIỆU Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrio, lớp Gammaproteobacteria, có hai type sinh học chính, là type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết thanh khác. V. cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở phần thân và các nhóm huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200 nhóm huyết thanh (Kaper et al., 1995). Trước năm 1992, nhóm O1 là nhóm huyết thanh duy 44 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 nhất gây ra dịch, từ năm 1992 về sau, một nhóm huyết thanh khác là O139 gây ra các đại dịch bùng phát tại Ấn Độ và Bangladesh. Hiện nay, 2 nhóm huyết thanh này là nguyên nhân gây bệnh tả lưu hành và phát thành dịch; những nhóm huyết thanh V. cholerae khác không gây thành dịch được gom chung lại thành nhóm V. cholerae non-O1 và non-O139. Ngoài ra, V. cholerae O1 còn được phân ra thành 3 type huyết thanh, Ogawa, Inaba và Hikojima; type thứ 3 này ít gặp và cũng chưa được mô tả đầy đủ. Các type huyết thanh này được chia thành 3 loại kháng nguyên (KN): A, B và C. KN A cấu tạo từ 3-deoxy-L-glycerotetronic acid, còn KN B và C chưa rõ. Tại Việt Nam, từ 1979 đến 1981, các ca bệnh tả chủ yếu là do type sinh học El Tor, type huyết thanh Ogawa; từ 1982 đến 1990, tất cả các ca bệnh tả đều nhiễm type huyết thanh Inaba; nhưng trong những năm sau 1990, tất cả các ca đều do type huyết thanh Ogawa (Nguyen et al., 2009). Để tìm hiểu các type huyết thanh phổ biến gây bệnh tả tại đồng bằng sông Cửu Long, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu: "Sự lưu hành type huyết thanh vi khuẩn Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh". II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Kháng huyết thanh định type V. cholerae: Kháng huyết thanh Inaba, Ogawa và O139 (Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh). - Vi khuẩn: 25 chủng vi khuẩn thuộc V. cholerae đã phân lập được dùng thử nghiệm trên thỏ sau khi hoạt hoá trong 2 giờ và tăng sinh trong môi trường APW ở 350C từ 18-24 giờ để có nồng độ vi khuẩn trong 1 ml tương đương 1x105 đến 5x107 CFU (Richardson, K, 1991). - Vacxin tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả toàn tế bào chết, gồm type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139, có chứa những phần bằng nhau của các chủng Ogawa và Inaba của vi khuẩn tả V. cholerae (Công ty TNHH MTV Vacxin và Sinh phẩm số 1, Hà Nội). - Động vật thí nghiệm: 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5 kg/con. 2.2. Phương pháp thí nghiệm 2.2.1. Thử nghiệm trên thỏ 12 thỏ thí nghiệm được cho uống vacxin tả với liều 1,5 ml/con, lặp lại lần 2 vào ngày thứ 14. Sau 28 ngày uống vacxin, thực hiện mổ khám. 12 thỏ không uống vacxin cũng có chế độ nuôi dưỡng như trên. Tiêm các chủng vi khuẩn đã phân lập (N8, O3.2, O1.2, Ng3, 85V1 và 81V1) vào ruột thỏ không uống vacxin và thỏ đã uống vacxin như nhau, sau đó mổ khám xác định tính đáp ứng miễn dịch của 2 lô thỏ trên. Thỏ được gây mê để phẫu thuật, ruột non được cột thành 4 đoạn, mỗi đoạn 10 cm, cách nhau 2 cm. Dùng kim tiêm 1 ml vi khuẩn (có chứa 1 x 105 - 5 x 107 CFU) vào trong lòng từng đoạn ruột, đóng xoang phúc mạc, kiểm tra chất lỏng các thời điểm 3, 6, 9, và 16 giờ sau khi tiêm. 2.2.2. Các chỉ tiêu theo dõi (i) Xác định type huyết thanh của V. cholerae: được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh: Chủng Ogawa, chủng Inaba, chủng O139 và chủng đa giá. (ii) Xác định tỷ lệ dịch lỏng (FA: Fluid accumulation): Tỷ lệ dịch lỏng tích tụ trong các đoạn ruột được xác định bằng số lượng dịch lỏng (ml)/chiều dài đoạn ruột của thỏ (cm). (iii) Sự bám dính vi khuẩn vào bề mặt đường ruột: Cắt từng đoạn ruột, cạo niêm mạc ruột hoặc dịch lỏng trong lòng ruột, sau đó pha loãng chất lỏng theo dãy thập phân (log 10). Kết quả được tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai x D1/v (Mi: số lượng vi khuẩn trong dung dịch ban đầu; Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa; D1: độ pha loãng; v: dung tích huyễn dịch /đĩa). Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: Phần trăm (%) bám dính = 100 x số vi khuẩn bề mặt ruột/ số vi khuẩn bề mặt ruột + CFU dịch lỏng (Richardson, K, 1991). 45 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 2.2.3. Xử lý số liệu Phần mềm Minitab version 16.0: phân tích các giá trị FA và CFU (bảng 3, 4 và 5). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả định type huyết thanh Kết quả định type huyết thanh học được thực hiện sau khi có kết quả định danh các loài thuộc Vibrio spp. Bảng 1. Kết quả định type huyết thanh (n = 25) Type huyết thanh Dương tính Tỷ lệ (%) Inaba + Ogawa + O139 (đa giá) 6 24,0 Ogawa 3 12,0 Inaba 3 12,0 Chủng chưa xác định 19 76,0 Trong 25 chủng phân lập được có 6 chủng (24%) dương tính với kháng huyết thanh đa giá (O139, Ogawa, Inaba), 3 chủng (12%) dương tính với kháng huyết thanh đơn giá Ogawa và 3 chủng (12%) dương tính với kháng huyết thanh đơn giá Inaba. Ngoài ra, có 19 chủng (76%) chưa xác định được type huyết thanh học. Những chủng vi khuẩn còn lại (19 chủng) không ngưng kết với kháng huyết thanh trên có thể thuộc nhóm non-O1 hoặc non-O139. Theo Garg et al. (2003), V. cholerae nằm trong nhóm các vi sinh vật thuộc hệ sinh thái là môi trường nước, các chủng thuộc O1 và O139 được phân lập ít so với các chủng non-O1 và non-O139 là những nhóm kháng huyết thanh không ngưng kết (NAG: nonagglutinable). Những chủng V. cholerae không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng vẫn gây bệnh và có triệu chứng tiêu chảy trên người (Nicholas et al., 2000). Ở miền Bắc Việt Nam, trong ba đợt bùng phát dịch tả giữa tháng 11 năm 2007 và tháng 2 năm 2008, tất cả 70 mẫu phân lập từ mẫu phân bệnh nhân và nước sông được xác định thuộc V. cholerae O1 type huyết thanh Ogawa với các phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hoá và phản ứng ngưng kết huyết thanh học (Binh Minh Nguyen et al., 2009). Binh Minh Nguyen et al. (2009) cũng chứng minh rằng các type huyết thanh Ogawa và Inaba từ những chủng phân lập tại Việt Nam cũng bắt nguồn từ các nước lân cận có đại dịch xảy ra như Lào (2007 - 2008) và Campuchia (2010). Những chủng phân lập ngoài môi trường cũng như từ triệu chứng lâm sàng chỉ dương tính với kháng huyết thanh O1, chưa phát hiện chủng O139. Tất cả những chủng phân lập ngoài môi trường và phân bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng từ năm 2003 đến 2004 đều thuộc type huyết thanh Inaba, nhưng từ năm 2007 đến 2011, những chủng phân lập từ triệu chứng lâm sàng đều thuộc type huyết thanh Ogawa, và ngược lại, những chủng phân lập từ môi trường nước năm 2010 đều thuộc type huyết thanh Inaba. Như vậy, các type huyết thanh trong nghiên cứu này là Ogawa và Inaba đều là những type đang phổ biến và hiện diện cả trong môi trường nước và trong thức ăn có nguồn gốc thủy hải sản. 3.2. Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên thỏ 3.2.1. Đối với thỏ không uống vacxin phòng bệnh tả Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa 1ml huyễn dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ có chứa 107 vi khuẩn V. cholerae, lượng dịch lỏng thu hồi được được thể hiện qua bảng sau: 46 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 Bảng 2. Lượng dịch lỏng (ml/cm) thu hồi trong ruột non của thỏ sau khi tiêm vi khuẩn theo thời gian TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ Số thỏ 1 N8 0,88 0,9 0,3 0,2 2 2 O3.2 0,7 0,8 0,4 0,2 2 3 O1.2 0,5 0,7 1,2 1,5 2 4 Ng3 0,5 0,6 0,8 1,7 2 5 85V1 0,7 0,8 1 1,6 2 6 81V1 0,7 0,9 1,2 1,8 2 Kết quả trên cho thấy khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ chưa uống vacxin sẽ kích thích niêm mạc ruột non thỏ tiết một lượng lớn dịch lỏng từ 0,7 - 0,9 ml/cm tại thời điểm 3 và 6 giờ, sau đó giảm dần chỉ còn 0,2 - 1,8 ml/cm ở thời điểm 16 giờ, do niêm mạc ruột không tiết kháng thể nên không gắn với thụ thể trên bề mặt vi khuẩn (Taylor et al., 1987). Số lượng vi khuẩn V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột Số lượng vi khuẩn đếm được tại các thời điểm 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ sau nuôi cấy được tổng hợp qua bảng 3. Bảng 3. Số lượng vi khuẩn V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ không uống vacxin TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ % bám dính Số thỏ9 giờ 16 giờ 1 N8 0 6,5 x 105 4 x 105 0 55,7±13,9 0 2 2 O3.2 0 5 x 105 35 x 104 0 59,3±4,2 0 2 3 O1.2 0 12 x 105 15,5 x 104 10 x 105 81,2±6,5 52,6±5,3 2 4 Ng3 0 13 x 105 16,5 x 105 9,8 x 105 89,9±3,8 76,2±4,8 2 5 85V1 0 15,6 x 105 16 x 105 12 x 105 77,5±2,4 79,9±8,9 2 6 81V1 0 16,5 x 105 18,2 x 105 2 x 106 75,4±1,7 79,1±7,2 2 Theo bảng 3, số vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột non tăng dần tại thời điểm 6 giờ và cao nhất tại thời điểm 9 giờ ở 4 chủng, sau đó có 2 chủng giảm dần và 2 chủng có ít vi khuẩn bám dính nhất tại thời điểm 16 giờ. Riêng 2 chủng N8 và O3.2, số lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 5x105 đến 6,5x105, sau đó giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 4x105 đến 35x104 và đến thời điểm 16 giờ, không còn V. cholerae bám dính. 3.2.2. Đối với thỏ có uống vacxin phòng bệnh tả Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa 1ml huyễn dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ có chứa 107 vi khuẩn V. cholerae, lượng dịch lỏng được thu hồi thể hiện qua bảng 4. Qua kết quả trên, nhận thấy tất cả các chủng V. cholerae N8, O3.2, O1.2, Ng3, 85V1, và 81V1 khi tiêm vào ruột non đối với thỏ đã uống vacxin (mORCVAX) có tích luỹ dịch lỏng tại thời điểm 3 giờ, 6 giờ, nhưng sau đó giảm dần, đến thời điểm 9 giờ và 16 giờ, số lượng dịch 47 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 lỏng còn không đáng kể, do niêm mạc ruột có tiết kháng thể gắn với thụ thể trên bề mặt vi khuẩn, cản trở vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột của vật chủ, từ đó vi khuẩn không thể tiết ra độc tố và tế bào biểu mô ruột non không thể tiết ra chất lỏng (Taylor et al., 1987). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy, tất cả thỏ có uống vacxin phòng bệnh tả đã có kháng thể nên dịch lỏng không tiết ra ở ruột non. Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non Số lượng khuẩn lạc thu được qua các giai đoạn 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ sau khi tiêm vi khuẩn được tổng hợp qua bảng sau: Bảng 4. Lượng dịch lỏng (ml/cm) thu hồi trong ruột non của thỏ sau khi tiêm vi khuẩn theo thời gian TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ Số thỏ 1 N8 0,30 0,35 0,25 0,00 2 2 O3.2 0,40 0,25 0,20 0,00 2 3 O1.2 0,50 0,60 0,30 0,20 2 4 Ng3 0,50 0,60 0,40 0,25 2 5 85V1 0,40 0,50 0,30 0,15 2 6 81V1 0,40 0,40 0,30 0,20 2 Bảng 5. Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ đã uống vacxin TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ % bám dính Số thỏ 9 giờ 16 giờ 1 N8 0 105 12 x 103 0 12,4±0,6 0 2 2 O3.2 0 8 x 104 20 x 103 0 7,41±1,9 0 2 3 O1.2 0 13,8 x 104 4,3 x 104 0 15,19±6,54 0 2 4 Ng3 0 14,1 x 104 8,2 x 104 0 14,77±3,12 0 2 5 85V1 0 15,6 x 104 6,5 x 104 0 14,64±4,18 0 2 6 81V1 0 14 x 104 4,6 x 104 0 19±2,9 0 2 Kết quả bảng 5 cho thấy, số lượng vi khuẩn bám dính trong niêm mạc ruột non cao nhất tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm 9 giờ và 16 giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn, đến thời điểm 16 giờ, hầu như tất cả các chủng đều không còn bám dính vào niêm mạc ruột non, chứng tỏ V. cholerae bị ức chế bởi các kháng thể được tiết ra từ niêm mạc ruột non. Việc hình thành đáp ứng miễn dịch trên thỏ có thể giải thích theo 2 cơ chế: Thứ nhất, khi kháng thể tiết ra sẽ ngăn chặn vi khuẩn bám vào niêm mạc bằng cách gắn vào bề mặt kháng nguyên (Finkelstein et al., 1982) làm bất động vi khuẩn hoặc kết dính với vi khuẩn, làm chúng không thể di chuyển trên bề mặt biểu mô ruột (Schrank et al., 1976). Trong trường hợp này, tác nhân gây bệnh sẽ bám dính kém và dễ dàng bị cuốn trôi khi nhu động ruột trở lại bình thường; Thứ hai, đáp ứng miễn dịch dịch thể trong bệnh tả làm xuất hiện IgG trong máu và IgA được tiết ra ở niêm mạc ruột, các kháng thể này tiết ra 48 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 6 - 2019 có tác dụng diệt khuẩn, ngăn cản vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột, hoặc vi khuẩn bị ức chế và không nhân lên để bám vào niêm mạc ruột (William et al., 1983). Ngoài ra, một yếu tố liên quan cần thiết để gắn vào niêm mạc ruột là khả năng di động của vi khuẩn, nếu vi khuẩn di động ít, yếu ớt hoặc có đột biến gen ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein của roi (Jones và Freter, 1976). Như vậy, tất cả thỏ có uống vacxin phòng bệnh tả với chủng huyết thanh đơn giá Inaba và Ogawa đã có kháng thể, nên hàm lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ, sau đó không còn bám dính vào niêm mạc ruột non ở thời điểm 16 giờ sau khi tiêm vi khuẩn. IV. KẾT LUẬN - Kết quả định type huyết thanh học: có 6 chủng V. cholerae đều thuộc type O1, với 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa. Không có chủng nào thuộc type O139. - Kết quả chỉ số bám dính vi khuẩn V. cholerae vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vacxin phòng bệnh tả là 55,7±13,9 và 59,3±4,2, cao hơn đối với thỏ có uống vacxin phòng bệnh tả (12,4±0,6 và 7,41±1,9). Thỏ có đáp ứng miễn dịch đối với vacxin có thành phần kháng nguyên tương đồng với các chủng vi khuẩn phân lập ở Trà Vinh nhóm huyết thanh O1. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Binh Minh Nguyen, Je Hee Lee, Ngo Tuan Cuong, Seon Young Choi, Nguyen Tran Hien, Dang Duc Anh, Hye Ri Lee, M. Ansaruzzaman, Hubert P. Endtz, Jongsik Chun, Anna Lena Lopez, Cecil Czerkinsky, John D. Clemens, and Dong Wook Kim2, 2009. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain producing Classical Cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol, 47(5): 1568–1571. 2. Finkelstein, R. A., and L. F. Hanne, 1982. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae. Infect. Immun, 36:1199-1208. 3. Garg P, Nandy RK, Chaudhry P, Chaudhry NR, De K, Ramamurthy T, 2003. Emergence of V. cholerae O1 biotype EI Tor serotype Inaba from prevailing O1 ogawa serotype strains in India. J. Clin. Microbiol, 38(11): 4249-4253. 4. Jones, G. W., and R. Freter, 1976. Adhesive properties of Vibrio cholerae: nature of the interaction with isolated rabbit brush border membranes and human erythrocytes. Infect. Immun, 14:240-245. 5. Kaper, J.B., Morris, J. G., Jr and Levine, M. M, 1995. Cholera. Clin. Microbiol Rev, 8: 48-86. 6. Nguyen, B. M., Lee, J. H., Cuong, N. T., Choi, S. Y., Hien, N. T., Anh, D. D., Lee, H. R., Ansaruzzaman, M., Endtz, H. P. and other authors, 2009. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol, 47 1568-1571. 7. Nicholas A. Daniels, MD, MPH, Alireza Shafaie, MD, 2000. A Review of Pathogenic Vibrio Infections for Clinicians. Infect. Med, 17(10): 665-685 8. Richardson, K, 1991. Roles of Motility and Flagellar Structure in Pathogenicity of Vibrio cholerae: Analysis of Motility Mutants in Three Animal Models. Infect. Immun, 59(8): 2727-2736. 9. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B. and Mekalanos, J. J, 1987. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proc Natl Acad Sci U S A, 84: 2833–2837. 10. Schrank, G. D., and W. F. Verwey, 1976. Distribution of cholera organisms in experimental Vibrio cholerae infections: proposed mechanisms of pathogenesis and antibacterial immunity. Infect. Immun. 13:195-203. 11. William C. Cray, Jr., Eiji Tokunaga, and Nathaniel F. Pierce, 1983. Successful Colonization and Immunization of Adult Rabbits by Oral Inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun, 41(2):735- 741. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2010). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing . 13. Iso/TS-1:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Ngày nhận 17-6-2019 Ngày phản biện 3-7-2019 Ngày đăng 1-9-2019