Sự thích nghi của vi rút sởi chủng aik-C trên tế bào nuôi cấy phôi thai gà- quan sát trên kính hiển vi điện tử

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 234 SỰ THÍCH NGHI CỦA VI RÚT SỞI CHỦNG AIK-C TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY PHÔI THAI GÀ- QUAN SÁT TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ Nguyễn Thanh Thủy1, Trần Quang Huy*, Trần Minh Hiền*, Nguyễn Xuân Hoà** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Tế bào phôi thai gà ñược lựa chọn cho sự nhân lên của chủng vi rút sởi AIK-C, chủng vi rút do Viện Kitasato (Nhật Bản) cung cấp cho Trung tâm nghiên cứu sản xuất văc xin và sinh phẩm Y tế (POLYVAC) ñể sản xuất văc xin sởi tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: Kiểm tra sự thích nghi của chủng vi rút sởi AIK-C trên tế bào phôi gà. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp hiển vi ñiện tử và hóa miễn dịch. Kết quả nghiên cứu: Quan sát thấy sự nhân lên của vi rút trên tế bào bắt ñầu từ ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm, ñến ngày thứ 9, xuất hiện rất nhiều các virion vi rút tập trung ở bên ngoài tế bào. Kết luận: Cũng giống như các vi rút trong họ Paramyxoviridae, vi rút sởi chủng AIK-C ñược tổng hợp ở trong bào tương tế bào, vi rút chín và nẩy chồi qua màng tế bào nuôi cấy phôi thai gà. Vi rút sởi chủng AIK-C rất thích nghi với dòng tế bào này. Từ khóa: Vi rút Sởi chủng AIK-C, Polyvac. ABSTRACT ADAPTATION OF MEASLES VIRUS AIK-C STRAIN TO EMBRYO CHICKEN CELL CULTURE- ELECTRON MICROSCOPIC OBSERVATION Nguyen Thanh Thuy, Tran Quang Huy, Tran Minh Hien, Nguyen Xuan Hoa * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 234 - 238 Background: Embryo chicken cell culture was chosen for the inoculation of measles virus AIK-C strain (provided by Kitasato Institute-Japan), this strain was kindly recommended for measles vaccine product in Vietnam by POLYVAC. Objectives: Studying on the adaptation of measles virus AIK-C strain to embryo chicken cells. Method: Transmission electron microscopic and immuno-cytochemical studies. Results: The multiplication of the measles virus AIK-C strain in this cell was firstly observed on the third day after inoculation and many virions of measles were found outside the cell on the ninth day. Conclusion: Similar to other viruses of the Paramyxoviridae family, measles virus AIK-C strain also revealed some interesting characterizations such as replication in the cytoplasm of the cell and the releasing mature virions through plasma membrane as well. This strain of measles virus is being able to adapt well in embryo chicken cells. Keywords: Measles virus AIK-C, Polyvac. ĐẶT VẤN ĐỀ Sởi ñược biết từ rất lâu như là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và rất dễ lây lan. Tác nhân gây bệnh sởi là vi rút sởi giống Morbillivirus thuộc họ Paramyxoviridae(6). Biểu hiện khởi phát của bệnh sau khi vi rút sởi xâm nhập vào cơ thể dẫn ñến sốt, viêm kết mạc, chảy nước mũi, ho có nốt kiplik ở niêm mạc miệng(2,6). Sự nguy hiểm của bệnh sởi chính là những biến chứng của bệnh, do sự nhân lên của vi rút sởi tấn công vào các tế bào lympho T gây nên tình trạng suy giảm miễn dịch mắc phải kết hợp với bội nhiễm vi khuẩn gây nên các bệnh viêm tai giữa, viêm phổi, tiêu chảy, viêm thanh quản khí quản, viêm phổi và ñặc biệt gây viêm não cấp, viêm não xơ cứng lan tỏa có thể gây tử vong hoặc ñể lại những biến chứng thần kinh nặng nề(2,5). Trong những năm vừa qua, chương trình tiêm chủng mở rộng ở nước ta ñã góp phần ñáng kể trong việc loại trừ và khống chế một số bệnh dịch nguy hiểm ở trẻ em bao gồm bệnh sởi. Trước ñây, Việt Nam chưa tự sản xuất ñược văc xin sởi nên hoàn toàn phải nhập ngoại. Năm 2004, nhờ sự giúp ñỡ của Chính phủ Nhật Bản thông qua vốn ODA, POLYVAC ñã tiếp nhận sự chuyển giao công nghệ sản xuất văc xin sởi từ Viện Kitasato (Nhật Bản) và ñến nay ñã làm chủ ñược qui trình sản xuất. Do ñó Việt Nam ñã hoàn toàn có thể tự túc sản xuất ñược văc xin sởi cung cấp cho Chương trình tiêm chủng mở rộng, góp phần khống chế và tiến tới thanh toán bệnh sởi ở Việt Nam(4). Với những ñặc tính ưu việt cũng như hiệu quả của chủng vi rút sởi AIK-C, chủng này ñã ñược khuyến cáo và sử dụng cho mục ñích sản xuất vắc xin sởi tại Việt Nam do POLYVAC ñảm nhiệm(1,3,7). Tuy nhiên, ñể có thể góp phần ñánh giá thực tế tính sinh học của vi rút sởi chủng AIK-C bằng những bằng chứng khoa học, khách quan dựa trên hình thái cấu trúc, sự nhân lên của vi rút trên tế bào nuôi cấy phôi thai gà, chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu cụ thể sau: -Đánh giá sự nhân lên của vi rút sởi chủng AIK-C trên tế bào phôi thai gà ngày thứ 3 sau gây nhiễm và ngày thứ 9 trước 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ** POLYVAC Địa chỉ Liên lạc: ThS Trần Quang Huy ĐT: 0978960658 Email: huytq@nihe.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 235 khi gặt vi rút cho sản xuất văc xin bán thành phẩm. -Đánh giá ñặc tính hóa miễn dịch của vi rút sởi chủng AIK-C trên tế bào phôi gà. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng - Mẫu tế bào phôi thai gà gây nhiễm vi rút sởi chủng AIK- C sau 3 và 9 ngày. - Kháng thể thỏ ña dòng kháng vi rút sởi. - Protein A gắn vàng (10nm). Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nhuộm âm bản sử dụng thuốc nhuộm PTA 0,25%. - Phương pháp hóa miễn dịch nhuộm âm bản gắn vàng sử dụng kháng thể thỏ ña dòng kháng vi rút sởi và Protein A- Au 10nm với thuốc nhuộm PTA 0,25%. - Phương pháp lát cắt cực mỏng sử dụng thuốc nhuộm uranyl acetate 5% và lead citrate. - Phương pháp hóa miễn dịch nhuộm âm bản gắn vàng và lát cắt cực mỏng sử dụng kháng thể ña dòng kháng vi rút sởi và Protein A- Au 10nm với thuốc nhuộm uranyl acetate 5% và chì citrate. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả quan sát vi rút sởi trong nước nổi tế bào phôi thai gà sau gây nhiễm vi rút sởi 3 ngày và 9 ngày Hình 1: Cấu trúc ñiển hình sợi nucleocapsid của vi rút sởi chủng AIK-C trong dịch nổi tế bào phôi thai gà sau 3 ngày gây nhiễm: sợi nucleocapsid nguyên vẹn (1A); sợi nucleocapsid bị ñứt ñoạn (1B ). Hình 2: Cấu trúc hoàn chỉnh vi rút sởi chủng AIK-C trong dịch nổi tế bào phôi thai gà sau 9 ngày gây nhiễm. Vi rút sởi hoàn chỉnh với cấu trúc nucleocapsid ở bên trong và các gai bám xung quanh lớp vỏ bao ngoài (2A). Vi rút sởi hình cầu hoàn chỉnh với những gai rất ngắn trên bề mặt (2B). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 236 Kết quả về sự nhân lên của vi rút sởi trên tế bào phôi thai gà sau 3 ngày và 9 ngày gây nhiễm Hình 3: Sau 3 ngày gây nhiễm quan sát thấy các sợi nucleocapsid (NC) tập trung thành ñám trong bào tương tế bào phôi gà. Ở một số vị trí trên màng tế bào bắt màu ñậm ñặc ñiện tử, ñó là nơi mà protein màng ngoài của vi rút ñã tổng hợp và ñược vận chuyển ñến chuẩn bị cho giai ñoạn nảy chồi của hạt vi rút hoàn chỉnh (ñầu mũi tên). Hình 4: Vi rút sởi nảy chồi qua màng tế bào phôi gà sau 3 ngày gây nhiễm (ñầu mũi tên). Hình 5: Sau 9 ngày gây nhiễm, rất nhiều vi rút sởi tập trung ở bên ngoài màng tế bào phôi gà. Kết quả miễn dịch nhuộm âm bản gắn vàng và lát cắt cực mỏng sử dụng kháng thể ña dòng kháng vi rút sởi . Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 237 Hình 6: Kháng nguyên lõi và kháng nguyên vỏ của vi rút sởi chủng AIK-C ñược ñánh dấu bằng các hạt vàng 10nm. Các hạt vàng gắn với các vị trí kháng nguyên trên sợi nucleocapsid của vi rút sởi trong dịch nổi tế bào sau 3 ngày gây nhiễm chủng AIK- C trên tế bào phôi thai gà (6A). Hạt vàng gắn với các vị trí kháng nguyên vỏ bao ngoài của hạt vi rút hoàn chỉnh (6B). Hình 7: Các hạt vàng 10nm ñánh dấu và ñịnh vị ñám nucleocapsid trong bào tương tế bào phôi gà. Hình 8: Các hạt vàng 10nm ñánh dấu các kháng nguyên vỏ của vi rút sởi hoàn chỉnh sau khi nẩy chồi qua màng tế bào phôi gà ( ñầu mũi tên). BÀN LUẬN Với những kết quả kiểm tra dựa vào hình thái và siêu cấu trúc vi rút sởi chủng AIK-C, cho thấy chủng vi rút này rất thích nghi trên dòng tế bào phôi thai gà. Vi rút sởi chủng AIK-C có kích thước thay ñổi từ 100- 300nm, ña hình thái. Trong nước nổi tế bào sau 3 ngày gây nhiễm (hình 1A, 1B) quan sát thấy các sợi nucleocapsid nguyên vẹn và ñứt ñoạn có hình dạng giống như xương cá mòi. Sợi nucleocapsid hoàn chỉnh có chiều dài khoảng 1,2µm, ñường kính sợi khoảng 15nm, có cấu trúc ñối xứng xoắn với hàng ngàn capxome bao bọc bên ngoài, khoảng cách giữa các capxome khoảng 2-3nm. Virion vi rút sởi hoàn chỉnh ñược quan sát thấy trong dịch nổi tế bào sau gây nhiễm ngày thứ 3 và 9 (hình 2A, 2B) với cấu trúc bên ngoài hạt vi rút là lớp vỏ bao ngoài có nguồn gốc từ màng tế bào phôi gà nên thành phần chủ yếu là lipoprotein. Trên bề mặt có các gai ngắn kích thước khoảng 9-15nm bám xung quanh ñó là những kháng nguyên vỏ H và N của vi rút sởi. Quan sát kỹ thấy bên trong hạt vi rút sởi thấy cấu trúc sợi nucleocapsid (hình 2A). Như vậy, vi rút sởi chủng AIK-C trong dịch nổi tế bào sau gây nhiễm có mang các ñặc ñiểm về hình thái cấu trúc giống như với các vi rút thuộc họ Paramyxoviridae và các ñặc trưng riêng của vi rút sởi(1,2,6). Trên tế bào phôi thai gà tại ngày thứ 3 sau gây nhiễm quan sát thấy vi rút sởi chủng AIK-C ñã bắt ñầu nhân lên trên tế bào, tuy với mật ñộ thưa, nhiều tế bào phôi thai gà còn nguyên vẹn. Nucleocapsid của vi rút sởi ñược tổng hợp ở trong bào tương tế bào (hình 3) hình thành những ñám sợi tập trung. Trên bề mặt màng tế bào có những vị trí màng nhô ra ngoài và bắt mầu ñậm ñặc ñiện tử (hình 3), ñó là những vị trí mà các protein kháng nguyên H, N của vi rút ñã ñược tổng hợp và vận chuyển ñến, sẵn sàng cho sự chín và nẩy chồi của vi rút sởi. Đến ngày thứ 9, vi rút sởi nhân lên rất mạnh mẽ, nhiều tế bào phôi thai gà ñã thoái hóa và tan vỡ, quan sát thấy rất nhiều các virion vi rút sởi ở bên ngoài tế bào. Quá trình tổng hợp của vi rút sởi trên tế bào nói chung chỉ ñược quan sát thấy khi chúng ñã ñược ñịnh hình ở dạng nucleocapsid hay vi rút ñã hoàn chỉnh. Dựa trên những thong tin trêm, chúng tôi ñánh giá vi rút sởi chủng AIK-C nhân lên rất tốt trên tế bào phôi gà và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 238 tại thời ñiểm ngày thứ 9 sau khi gây nhiễm, và ñây chính là thời ñiểm thích hợp ñể gặt vi rút cho mục ñích sản xuất văc xin sởi bán thành phẩm(1,3,7). Kết quả phản ứng hóa miễn dịch hiển vi ñiện tử gắn vàng trên nhuộm âm bản và lát cắt cực mỏng, sử dụng kháng thể thỏ ña dòng kháng vi rút sởi cho thấy các ñặc tính kháng nguyên của vi rút này ngay cả trong quá trình nhân lên và thoát ra khỏi tế bào. Cụ thể rằng, các hạt vàng 10nm ñánh dấu và ñịnh vị kháng nguyên vi rút ở các giai ñoạn tổng hợp (nucleocapsid, protein màng) và hình thành hạt vi rút nguyên vẹn (hình 6, 7). Ngày thứ 9 sau gây nhiễm các hạt vàng ñã ñánh dấu các kháng nguyên vỏ của vi rút sởi. Quan sát thấy không có sự ñánh dấu không ñặc hiệu của các hạt vàng trong nước nổi tế bào và trên tế bào sau gây nhiễm. KẾT LUẬN Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chủng vi rút sởi AIK-C rất thích nghi trên tế bào nuôi cấy phôi thai gà. Sau 9 ngày gây nhiễm là thời gian vi rút nhân lên mạnh mẽ nhất, lúc này vi rút sởi ñạt hiệu giá cao nhất. Vi rút sởi chủng AIK-C có các ñặc trưng về mặt hình thái siêu cấu trúc giống các vi rút trong họ Paramyxoviridae. Phản ứng hóa miễn dịch gắn vàng sử dụng kháng thể thỏ ña dòng kháng vi rút sởi cho thấy các hạt vàng có kích thước 10nm ñã ñánh dấu và ñịnh vị các kháng nguyên vi rút sởi (kháng nguyên vỏ, lõi) minh chứng cho tính toàn vẹn của kháng nguyên vi rút sởi trong quá trình nhân lên trên tế bào phôi thai gà. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bettina B et al (2008). Adaptation to cell culture induces functional differences in measles virus proteins. Virology Journal, 5:129 2. Gershon A, Krupman S (1979). Measles virus. In: Lennette H, Schmidt J, eds. Diagnostic procedures for Viral, Rickettsia and Chlamydial Infection. 5th ed. Washington DC: American Public Health Association, 665-693. 3. Hajime U et al (2006). Passage in Vero cells alters the characteristics of measles AIK-C vaccine strain. Vaccine, volume 24, Issue 7, 931-936 4. Bộ Y tế (2005), Quyết ñịnh số 3357/QĐ-BYT, ngày 14/9/2005 của Bộ trưởng Bộ Y tế. 5. Kingsbury DW (1990). Paramyxoviridae and their replication. In: Field BN, Knipe DM, Chanock RM, et al., eds. Virology. 2nd ed, vol.1. New York: Raven Press, 945- 962. 6. Norrby E, Oxman M (1990). Measles virus. In: Field BN, Knipe DM, Chanock RM, et al., Virology 2nd ed. Vol.1. New York: Raven Press, 1013-1044. 7. Tetsuo N et al (2001). Leucine at position 278 of the AIK-C measles virus vaccine strain fusion protein is responsible for reduced syncytium formation. Journal of General Virology, 82, 2143–2150.