Tác dụng chống oxy hóa, hạ Acid Uric máu và lợi tiểu của cao chiết diệp hạ châu – râu mèo trên thực nghiệm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 227 TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, HẠ ACID URIC MÁU VÀ LỢI TIỂU CỦA CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU – RÂU MÈO TRÊN THỰC NGHIỆM Đỗ Thị Quỳnh Nga*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Cho tới nay, đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ acid uric máu (do ức chế xanthine oxidase) và lợi tiểu của Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn), cũng như tác dụng tăng thải acid uric qua nước tiểu và chống oxy hóa của Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.). Xanthin oxydase là một chất oxy hóa xúc tác trong quá trình tạo ra acid uric máu. Đề tài này được thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxy hóa, ức chế xanthine oxydase của cao chiết từ Diệp hạ châu và Râu mèo trên chuột nhắt trắng. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao đặc Diệp hạ châu đắng do Trung tâm dược liệu Miền trung sản xuất. Cao khô Râu mèo do công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp. Nghiên cứu in vitro: Khảo sát hoạt tính ức chế xanthin oxidase (XO) của cao Diệp hạ châu, cao Râu mèo và cao phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo với các tỷ lệ phối hợp khác nhau. Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl diadehyd (MDA). Nghiên cứu in vivo: Tác dụng hạ acid uric máu: Các cao thử được cho uống dự phòng 5 ngày trước khi gây mô hình gây tăng acid uric cấp trên chuột nhắt trắng bằng kali oxonat (tiêm phúc mô 300 mg/kg). Ở mô hình gây tăng acid uric mạn bằng cách tiêm cách nhật liều kali oxonat giảm dần (từ 300 mg/kg xuống 150 mg/kg), các cao thử được cho uống liên tục trong 14 ngày. Dùng Allopurinol 300mg làm đối chiếu dương. Tác dụng lợi tiểu: Cho chuột uống 1 liều duy nhất các cao thử sau khi nhịn đói và không được uống nước trong vòng 18 giờ trước đó. Dùng Furosemide 40mg làm đối chiếu dương. Kết quả: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo ở tỷ lệ phối hợp 4:1 có hoạt tính ức chế XO với IC50 là 43,83µg/ml. Tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần cao khô Râu mèo cho hiệu quả chống oxy hóa tối ưu nhất, ở nồng độ 50µg/ml là 66,79% tương đương với hoạt tính của Trolox ở nồng độ 5mM (63,49%). Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo liều [100mg DHC + 25mg RM]/kg vừa có tác dụng lợi tiểu vừa thể hiện khả năng hạ acid uric máu cả khi sử dụng với mục đích dự phòng và khi điều trị tăng acid uric kéo dài tương tự như Allopurinol. Kết luận: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo có hoạt tính ức chế XO, hạ acid uric máu, có tác dụng chống oxy hóa và lợi tiểu trên thực nghiệm. Kết quả này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng cao chiết phối hợp này trong điều trị tăng acid uric máu và các rối loạn khác do chất oxy hóa gây ra. Từ khóa: Diệp hạ châu đắng, Râu mèo, ức chế xanthine oxidase, chất oxy hóa, tác dụng chống oxy hóa. ABSTRACT THE ANTIOXIDATIVE EFFECT OF PHYLLANTHUS AMARUS – ORTHOSIPHON STAMINEUS EXTRACT IN VITRO Do Thi Quynh Nga, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 227 - 234 Objectives: There have been researches proven the hypouricemic and diuretic effect of Phyllanthus amarus, the diuretic effect and uric excretion of Orthosiphon stamineus. Xanthine oxidase is an oxidant that catalyses in * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Đỗ Thị Quỳnh Nga ĐT: 0984128211 Email: dtquynhngath@hotmail.com.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 228 uric acid producing process. Our study is done with the aim of surveying antioxidative effect of coordinated extract from Phyllanthus amarus and Orthosiphon stemineus in vitro. Methods: Aqueous extract of Phyllanthus amarus was produced by The Central of Research and Manufacture Mien Trung. Dry extract of Orthosiphon stamineuswas provided by BV Pharma Company. In vitro study: Surveying the xanthine oxidase (XO) inhibitory activity of extract from Phyl, extract from Orth and coordinated extract from Phyl and Orth. Surveying the inhibition of lipid peroxidation through measuring malonyl diadehyde (MDA) content. In vivo study: - Hyperuricemic reductive activity: Mice had been administered with coordinated herbal extract for 5 days before making acute model. The acute model of hyperuricemia was created by abdominal injection with potassium oxonate in mice (dose: 300mg/kg). In the chronic model, which was created by abdominal injection every other day with potassium oxonate in cutting down doses (from 300mg/kg to 150mg/kg), mice were administered continuously for 14 days with herbal extracts. Allopurinol was used as a positive reference. - Diuretic effect: Mice had not been served any food or water for 18 hours before administering the only 1 dose of each herbal extracts. Furosemide was used as a positive reference. Results: The in vitro study confirmed that coordinated extract in 4:1 ratio has XO inhibitory activity with IC50at 43.83 µg/ml. In vitro studies showed that coordinated extract at dose of (100mg Phyl + 25mg Orth)/kg has diuretic effect as well as hypouricemic activity in both purpose of prevention and treatment. These effects are as similar as those by furosemide and allopurinol. The in vitro study confirmed that coordinated extract in 4:1 ratio has XO inhibitory activity with IC50 at 43.83 µg/ml. Coordinated extract in 1:1 ratio has optimal inhibitory effect, at 50µg/ml concentrationise quivalent to 66.79% of Troloxactivityat a concentration 5mM (63.49%). Conclusion: The coordinated extract of Phyllanthus amarus and Orthosiphon stamineus has XO inhibitory activity, antioxidative effect invitro. These results will be the basis for researches and applications in the treatment of hyperuricemia and other disorders caused by oxidants. Keywords: Phyllanthus amarus Schum et Thonn, Orthosiphon stamineusBenth., xanthine oxidase inhibitory activity, oxidant, antioxidative effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là sản phẩm của quá trình oxy hóa các chất trong cơ thể. Tuổi càng cao thêm vào đó là thói quen lạm dụng độc chất (thuốc lá, cà phê, dược phẩm...), dinh dưỡng sai lầm làm cho lượng gốc tự do trong cơ thể càng tăng lên nhiều. Khi có sự tăng quá nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thuỷ tinh thể, thoái hóa hoàng điểm ở mắt, tăng nguy cơ các bệnh ung thư và nhất là sớm xuất hiện hiện tượng lão hoá. Một trong những gốc tự do thường gặp là Xanthin oxydase – một gốc tự do chịu trách nhiệm một khâu trong quá trình tạo ra acid uric máu. Mà tăng acid uric máu là một dạng rối loạn chuyển hóa thường gặp, chiếm tỉ lệ từ 2,6 – 47,2% ở các dân số khác nhau và có xu hướng ngày càng gia tăng. Trong đó, trên 90% là tăng acid uric máu đơn thuần không có triệu chứng lâm sàng. Trước đây, khi nói tới tăng acid uric máu thường người ta chỉ nghĩ tới bệnh Gout, tuy nhiên hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bệnh l ý quan trọng khác như: tăng huyết áp, bệnh mạch máu não, bệnh lý chuyển hóa, bệnh thận, tiền sản giật Diệp hạ châu và Râu mèo là hai cây thuốc nam đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hoá rất cao và có khả năng ức chế Xanthin oxydase độc lập. Đề tài này được thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxy hóa, ức chế xanthine oxydase của cao chiết từ Diệp hạ châu và Râu mèo để làm cơ sở cho những nghiên cứu chế phẩm tiếp theo. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 229 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao đặc Diệp hạ châu được chiết xuất từ lá cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), trồng theo tiêu chuẩn VietGAP. Cao được chiết bằng thiết bị chiết đa năng tại Trung tâm dược liệu Miền trung. Cao khô Râu mèo được chiết xuất từ cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.), họ Hoa môi (Lamiaceae), do công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, 5 – 6 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. HCM và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Thuốc thử nghiệm Thuốc đối chiếu: Allopurinol 300 mg (công ty Domesco, Việt Nam, số đăng ký VNB-4166-05, số lô 010111, hạn sử dụng 170114). Viên nén Furosemide 40mg (công ty Mekophar, Việt Nam, hạn dùng 20/06/14). Hoá chất: xanthine (Sigma, USA); xanthine oxidase (Sigma); oxonat kali (Sigma Aldrich, USA); kit định lượng acid uric (uric acid liquicolor, Human ltd.Co., Đức); nước cất, NaCl 0,9%, EDTA; đệm phosphat 50 mM, pH = 7,5; đệm EDTA phosphat 50 mM, pH = 7,5. Phương pháp nghiên cứu(4) Phương pháp nghiên cứu in vitro xác định hoạt tính ức chế xanthine oxidase. Xanthin oxidase (XO) có tác dụng xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành uric acid, đồng thời hình thành gốc tự do. Ta sử dụng phương pháp trắc quang để khảo sát khả năng ức chế enzym XO của các mẫu thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành. Acid uric có bước sóng hấp thu cực đại tại 290nm. Chất có khả năng ức chế XO càng cao càng ức chế sự hình thành uric acid, do đó mật độ quang đo được sẽ giảm. Quy trình thử hoạt tính ức chế xanthine oxidasetheo bảng sau: Mẫu trắng được tiến hành tương tự nhưng thay enzym và mẫu thử bằng đệm.Mẫu chứng có dịch enzym nhưng không có mẫu thử mà thay bằng đệm. Đo mật độ quang ở bước sóng 290 nm liên tục mỗi 3 phút trong 30 phút tính từ lúc cho xanthine vào cuvet. Khả năng chống oxy hóa được tính dựa trên phần trăm ức chế (%I) xác định theo công thức: I% = (1 – Ac/As) x 100 Với: Ac là giá trịmật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control). As là giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử (sample). Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị phần trăm ức chế (%I). Lấy trung bình 3 giá trị %I từ đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Mỗi mẫu thử được pha thành bốn nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10µM. Nếu hoạt tính của mẫu thử ức chế trên 50% ở 10µM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ nhỏ hơn 5; 2; 1; 0,5; 0,2µM để tìm ra giá trị IC50. Giá trị IC50 µg/ml (nồng độ có khả năng ức chế 50%) của mẫu được tính dựa trên đồ thị hồi quy tương quan giữa nồng độ (Cpư) và khả năng ức chế (I%). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 230 Khả năng ức chế peroxy hóa lipid(1,1). Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng MDA, là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm. 0,1ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và đệm phosphate 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 370C trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 1000C, làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 532 nm. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được dùng làm chất đối chiếu. Công thức tính phần trăm (%) hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = 100 )( × − C TC OD ODOD ODC: Mật độ quang mẫu đối chứng (DMSO). ODT: Mật độ quang mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo khác nhau. Cách tính IC50 : Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 để suy ra IC50. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ acid uric thực nghiệm(3,5). Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric dự phòng trên mô hình tăng acid uric cấp. Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 8 lô, mỗi lô 6 con. Cho chuột uống nước cất hoặc thuốc nghiên cứu với thể tích 0,1 ml/10g chuột. -Lô chứng trắng (lô BT): uống nước cất. -Lô chứng bệnh lý (lô MH): uống nước cất. -Lô đối chiếu (Lô A): uống Allopurinol 10 mg/kg thể trọng. -Lô DHC: uống cao chiết Diệp hạ châu 200 mg/kg thể trọng. -Lô RM: uống cao chiết Râu mèo 200 mg/kg thể trọng. -Lô 4DHC:1RM(1): uống cao chiết phối hợp DHC (100 mg/kg) và Râu mèo (25 mg/kg). -Lô 4DHC:1RM(2): uống cao chiết phối hợp DHC (200 mg/kg) và Râu mèo (50 mg/kg). -Lô 4DHC:1RM(4): uống cao chiết phối hợp DHC (400 mg/kg) và Râu mèo (100 mg/kg). Áp dụng mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat, chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử nghiệm vào một giờ nhất định trong vòng 5 ngày trước khi làm thử nghiệm. Trước khi dùng nước cất hoặc thuốc thử nghiệm 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ 5, chuột ở lô chứng trắng được tiêm màng bụng với nước cất 0,1ml/10g thể trọng, các lô còn lại được tiêm kali oxonat 0,1ml/10g với liều 300 mg/kg thể trọng một giờ trước khi uống thuốc lần cuối. Sau khi uống thuốc 1 giờ, lấy máu đuôi chuột để định lượng nồng độ acid uric huyết thanh. Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric trên mô hình tăng acid uric kéo dài 14 ngày. Chuột được chia thành 6 lô (mỗi lô 6 – 8 con). Cho chuột uống nước cất hoặc thuốc nghiên cứu với thể tích 0,2 ml/10g chuột, tối đa là 0,5 ml cho mỗi chuột. -Lô chứng trắng (lô BT): uống nước cất. -Lô chứng bệnh lý (lô MH): uống nước cất. -Lô A (đối chiếu): uống Allopurinol 10 mg/kg thể trọng. -Lô DHC: uống cao chiết Diệp hạ châu 200 mg/kg thể trọng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 231 -Lô RM: uống cao Râu mèo 200 mg/kg thể trọng. -Lô 4DHC:1RM(1): uống cao chiết phối hợp DHC (100 mg/kg) và Râu mèo (25 mg/kg). -Lô A được cho uống Allopurinol 10 mg/kg vào ngày thứ 7 và liên tục trong những ngày sau đó. Các lô còn lại được uống nước cất hoặc thuốc thử nghiệm vào một giờ nhất định trong ngày liên tục trong 14 ngày. Lô BT được tiêm phúc mô nước cất 0,1ml/10g chuột, còn tất cả các lô còn lại được tiêm phúc mô kali oxonat cách ngày, bắt đầu từ liều 300 mg/kg (ngày 1), giảm dần xuống 250 mg/kg (ngày 3), 200 mg/kg (ngày 5) và duy trì ở liều 150 mg/kg (ngày 7, 9, 11, 13). Lấy máu đuôi chuột ở các thời điểm ngày 7 và 14 để định lượng acid uric trong huyết thanh. Nghiên cứu tác dụng lợi tiểu(6). Trước khi làm thử ngiệm, không cho chuột ăn và uống nước trong vòng 18 giờ. Sau đó, chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 6 con. Cho chuột uống nước cất hoặc thuốc nghiên cứu với thể tích 0,2 ml/10g chuột. -Lô BT: uống nước cất -Lô DHC: uống cao đặc Diệp hạ châu 200mg/kg thể trọng -Lô RM: uống cao khô Râu mèo liều 200mg/kg thể trọng -Lô 4DHC:1RM: uống cao chiết phối hợp DHC (100 mg/kg) và Râu mèo (25 mg/kg) -Lô F: uống Furosemid 40mg/kg liều 10mg/kg thể trọng Sau khi uống nước cất hoặc thuốc nghiên cứu, chuột không được ăn uống gì thêm. Hứng và đo lượng nước tiểu chuột sau 1 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Phương pháp xử lý số liệu thống kê thực nghiệm Dùng phần mềm Stata 10.0 để tính các giá trị thống kê mô tả: số trung bình, độ lệch chuẩn Ứng dụng phép kiểm t – Student độc lập để so sánh 2 số trung bình của 2 lô khác nhau trong cùng một thời điểm. Ứng dụng phép kiểm Anova 1 yếu tố để đánh giá sự khác biệt về trị số acid uric của các lô thử nghiệm trong cùng một thời điểm. KẾT QUẢ Tác dụng ức chế Xanthin oxidase của các tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo khác nhau Thuốc đối chiếu Allopurinol có khả năng ức chế XO ở nồng độ rất thấp và cho kết quả IC50 = 0,063 µg/ml. Cả 9 công thức phối hợp đều thể hiện tác dụng ức chế XO, thứ tự khả năng ức chế giảm dần là: 4DHC:1RM > 3DHC:1RM > 2DHC:1RM > 1DHC:2RM > 1DHC:3RM > 2DHC:5RM > 1DHC:4RM > 1DHC:1RM. Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính ức chế xanthin oxidase. STT Tên mẫu Phần trăm ức chế IC50 (µg/mL) 100 (µg/mL) 50 (µg/mL) 25 (µg/mL) 10 (µg/mL) 1 4DHC:1RM 71,0 ± 1,5 52,2 ± 3,5 43,23 ± 0,45 16,7 ± 2,7 43,83 2 3DHC:1RM 61,2 ± 2,9 41,6 ± 1,4 21,84 ± 0,78 8,76 ± 0,59 71,36 3 2DHC:1RM 63,3 ± 1,8 34,61 ± 0,99 24,1 ± 1,4 9,6 ± 4,3 76,81 4 DHC 69,05 ± 0,80 48,6 ± 1,9 33,9 ± 2,6 19,7 ± 1,9 84,46 5 RM 57,2 ± 2,2 30,7 ± 1,3 5,9 ± 2,2 2,31 ± 0,81 87,65 6 1DHC:2RM 43,80 ± 0,97 35,04 ± 0,81 19,0 ± 3,0 9,4 ± 1,9 > 100 7 1DHC:3RM 40,97 ± 1,8 20,95 ± 0,82 6,6 ± 1,6 - > 100 8 3DHC:2RM 32,8 ± 1,5 15,3 ± 2,0 2,9 ± 2,3 - > 100 9 2DHC:5RM 32,0 ± 2,2 24,2 ± 2,5 18,9 ± 1,6 5,2 ± 2,3 > 100 10 1DHC:4RM 30,38 ± 0,39 18,7 ± 2,1 9,8 ± 1,9 3,6 ± 2,9 > 100 11 1DHC:1RM 30,09 ± 0,61 17,1 ± 2,7 6,1 ± 3,5 - > 100 Allopurinol 0,063 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 232 Khả năng ức chế peroxy hóa lipid Bảng 2. Kết quả thử trên test MDA của các tỷ lệ phối hợp cao chiết Diệp hạ châu và Râu mèo. Nồng độ (µg/ml) HTCO (%) 1DHC:1 RM 2DHC:1 RM 3DHC:1 RM 4DHC:1 RM 5DHC:1 RM 2000 91,30 86,72 86,26 84,96 75,88 1000 91,30 80,38 79,01 76,64 76,18 500 90,46 73,82 67,63 65,80 62,82 250 89,16 53,59 57,71 63,36 54,96 100 82,37 30,76 53,82 56,34 45,50 50 66,79 20,38 48,24 46,49 40,23 10 32,52 5,73 24,35 27,02 16,56 Cả 5 tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo trong nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tăng theo nồng độ khảo sát. Trong đó, nhìn sơ bộ cho thấy tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần cao khô Râu mèo cho hiệu quả ức chế tối ưu nhất. Tỷ lệ phối hợp này đạt hoạt tính chống oxy hoá ở nồng độ 50µg/ml là 66,79% tương đương với hoạt tính của Trolox ở nồng độ 5mM (63,49%). Bảng 3. Kết quả thử trên mẫu đối chiếu. Trolox/MDA Nồng độ (mM) OD HTCO% 0,1 0,529 4,86 0,5 0,445 19,96 1 0,376 32,37 5 0,203 63,49 10 0,124 77,70 Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ acid uric dự phòng trên mô hình tăng acid uric cấp. Lô chuột uống cao chiết độc vị Diệp hạ châu liều 200 mg/kg, lô uống cao chiết độc vị Râu mèo liều 200 mg/kg, và cả 3 lô uống cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo theo tỷ lệ 4:1 đều có tác dụng hạ acid uric máu ở chuột thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001) tương tự như lô được uống Allopurinol. Bảng 5. Hàm lượng acid uric máu ở các lô thử nghiệm trên mô hình tăng acid uric cấp. Lô N Liều dùng Nồng độ acid uric (mg/dl) Tỷ lệ giảm so với lô đối chứng bệnh Đối chứng trắng 6 - 1,29 ± 0,23 Đối chứng bệnh 6 - 1,83 ± 0,12 # Alopurinol 6 10 mg/kg 0,95 ± 0,22** 48% Râu mèo 6 200 mg/kg 1,02 ± 0,14** 44% Diệp hạ châu 6 200 mg/kg 0,93 ± 0,08** 49% Lô 4DHC:1RM (4) 6 (400 mg DHC + 100 mg RM)/kg 0,86 ± 0,1** 53% Lô 4DHC:1RM (2) 6 (200 mg DHC + 50 mg RM)/kg 0,88 ± 0,1** 52% Lô 4DHC:1RM (1) 6 (100 mg DHC + 25 mg RM)/kg 0,75 ± 0,28** 59% #P< 0,001: So với lô chứng trắng; **P<0,001: So với lô chứng bệnh lý. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ acid uric trên mô hình tăng acid uric kéo dài Lô chứng tiêm kali oxonat có lượng acid uric tăng 96,8% (ngày 7) và 65% (ngày 14), đạt ý nghĩa thống kê so với lô bình thường. Cao đặc Diệp hạ châu (liều 200 mg/kg), cao khô Râu mèo (liều 200 mg/kg) và cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo (liều 100 mg DHC + 25 mg RM/kg) cho uống 7 ngày hay kéo dài đến 14 ngày đều làm giảm hàm lượng acid uric máu đạt ý nghĩa thống kê tương tự như Allopurinol. Bảng 6. Hàm lượng acid uric sau 7 ngày và 14 ngày (Đơn vị: mg/dL). Lô N Nồng độ acid uric (mg/dl) sau 7 ngày sau 14 ngày Đối chứng trắng 6 1,29 ± 0,23 1,46 ± 0,44 Đối chứng bệnh 8 2,54 ± 0,82## 2,41 ± 0,63# Alopurinol (10mg/kg) 7 1,63 ± 0,34* 1,25 ± 0,23** Diệp hạ châu (200mg/kg) 7 1,47 ± 0,35** 1,48 ± 0,24** Râu mèo (200mg/kg) 7 1,44 ± 0,13 ** 1,50 ± 0,19** 4DHC:1RM (100mg DHC + 25mg RM)/kg 7 1,35 ± 0,25** 1,41 ± 0,38** ##P < 0,01: so với lô chứng trắng; #P < 0,05: so với lô chứng trắng; *P < 0,05: so với lô chứng bệnh lý; **P < 0,01: so với lô chứng bệnh lý. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 233 Tác dụng lợi tiểu Bảng 7. Lượng nước tiểu chuột sau 1h, 4h và 24h uống thuốc nghiên cứu. Sau 1h (ml) Sau 4h (ml) Sau 24h (ml) Lô NC 0,075 ± 0,075 0,21 ± 0,75 0,33 ± 0,12 Lô DHC 0,13 ± 0,15 0,46 ± 0,17 0,68 ± 0,19 Lô RM 0,25 ± 0,18 0,58 ± 0,11 0,75 ± 0,18 Lô DHC – RM 0,21 ± 0,19 0,53 ± 0,1 0,75 ± 0,18 Lô F 0,35 ± 0,2 0,81 ± 0,13 0,98 ± 0,14 Cả 3 lô chuột uống cao đặc Diệp hạ châu 200mg/kg, lô uống cao khô Râu mèo 200mg/kg và lô uống cao chiết phối hợp 100 mg/kg Diệp hạ châu và 25 mg/kg Râu mèo đều thể hiện tác dụng lợi tiểu ở giờ thứ 4 và sau 24 giờ uống thuốc đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (uống nước cất) (P < 0,05). BÀN LUẬN Khả năng ức chế xanthin oxidase Diệp hạ châu ức chế XO nhiều hơn Râu mèo nhưng khi kết hợp Diệp hạ châu và Râu mèo theo tỷ lệ 4:1 thì khả năng ức chế XO lại lớn hơn gấp đôi so với độc vị Diệp hạ châu. Mặc dù khả năng ức chế XO của cao chiết phối hợp Diệp hạ châu + Râu mèo tỷ lệ 4:1 nhỏ hơn nhiều so với Allopurinol nhưng tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phối hợp Diêp hạ châu + Râu mèo lại không khác biệt so với Allopurinol. Điều này chứng tỏ ngoài khả năng ức chế XO, cao chiết phối hợp Diệp hạ châu + Râu mèo còn có thể có tác dụng tăng thải acid uric hoặc làm tiêu uric acid. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid Kết quả thử nghiệm cho thấy cả 5 tỷ lệ phối hợp giữa Diệp hạ châu và Râu mèo trong thử nghiệm đều thể hiện khả năng ức chế tạo MDA rất rõ đặc biệt là tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần cao khô Râu mèo. Tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết Diệp hạ châu – Râu mèo Kết quả thử nghiệm cho thấy việc kết hợp Diệp hạ châu và Râu mèo rất có giá trị trong điều trị tăng acid uric máu vì các lý do sau: (1) Chỉ cần sử dụng 1/8 đến 1/2 liều so với khi điều trị bằng một thứ Diệp hạ châu hoặc Râu mèo riêng lẻ. (2) Hiện tượng tăng acid uric máu là một rối loạn chuyển hóa có liên quan đến các rối loạn khác như tăng huyết áp, đái tháo đường, rối loạn chuyển hóa lipid máu, thừa cân béo phì Do đó, lợi ích đầu tiên là cả Diệp hạ châu lẫn Râu mèo đều có tác dụng làm hạ huyết áp, hạ đường máu, ổn định tình trạng rối loạn lipid máu, nên sự phối hợp có thể sẽ làm tăng thêm hiệu quả điều trị. (3) Hai dược liệu này cùng có tác dụng điều trị sỏi đường tiết niệu – một bệnh lý thường gặp và ngày càng gia tăng trong dân số, đặc biệt là ở những người bị tăng acid uric máu. Tác dụng lợi tiểu của cao chiết Diệp hạ châu – Râu mèo Cả 3 lô chuột uống cao đặc Diệp hạ châu 200mg/kg, lô uống cao khô Râu mèo 200mg/kg và lô uống cao chiết phối hợp 100 mg/kg Diệp hạ châu và 25 mg/kg Râu mèo đều thể hiện tác dụng lợi tiểu ở giờ thứ 4 và sau 24 giờ uống thuốc đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (uống nước cất) (P < 0,05). Tuy nhiên, lượng nước tiểu ở các lô chuột này ít hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chuột uống Furosemide 10mg/kg thể trọng (P < 0,05). KẾT LUẬN Tỷ lệ phối hợp 4 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần Râu mèo thể hiện khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất. Cao chiết Diệp hạ châu – Râu mèo với liều uống (100 mg DHC + 25 mg RM)/kg, có tác dụng hạ acid uric trên mô hình tăng acid uric cấp và tăng acid uric kéo dài và sự phối hợp Diệp hạ châu với Râu mèo tạo nên hiệu quả hạ acid uric tốt hơn so với khi dùng riêng rẽ từng loại dược liệu. Cao chiết Diệp hạ châu – Râu mèo với liều uống (100 mg DHC + 25 mg RM)/kg thể hiện tác dụng lợi tiểu bắt đầu ở giờ thứ 4 sau khi uống thuốc. Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 234 thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, McDonald S, Robards K (2002). Methods for testing antioxidant activity. Analyst, 127(1): 183-198. 2. Bộ Y Tế. Viện Dược Liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 279 - 293. 3. Lê Thị Minh Dung (2011). Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết từ lá đại bi. Luận văn thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Tp. HCM. 4. Nguyen MT, Awale S, Tezuka Y, Shi L, Zaidi SF, Ueda JY, Tran QL, Murakami Y, Matsumoto K, Kadota S (2005). Hypouricemic effects of acacetin and 4,5-o-dicaffeoylquinic acid methyl ester on serum uric acid levels inpotassium oxonate-pretreated rats. Biologycal and pharmaceutical Bulletin, 28(12): 2231 – 2234 5. Nguyễn Thùy Dương và cộng sự (2011). Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric huyết thanh của Hy thiêm trên mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat. Tạp chí Dược liệu, tập 16, (số 1 + 2), tr. 79 – 82. 6. Phạm Thị Hóa, Bùi Mỹ Linh (2012). Khảo sát tác dụng hóa học, độc tính cấp và tác dụng lợi tiểu của cây dứa Caida (Pandanus kaida Kurz) trên thực nghiệm. Đề tài cấp cơ sở, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Ngày nhận bài báo : 14/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo : 17/10/2013 Ngày bài báo được đăng : 02/01/2014