Tách lớp chất kháng nấm và khảo sát hiệu lực phõng trừ bệnh héo vàng cà chua (fusarium oxysporum) của chế phẩm sinh học VH- BIOCHEM 01

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 25 gia tăng tỷ lệ chết do độc tố Bt trong lá bông chuyển gen đối với sâu non tuổi nhỏ của sâu xanh. Cùng dinh dưỡng trên lá bông chuyển gen Bt (CS95), nguồn sâu xanh ở vùng chưa trồng giống bông chuyển gen Bt (Bình Thuận) có tỷ lệ chết cao hơn so với tỷ lệ chết của nguồn sâu xanh ở vùng đã trồng giống bông chuyển gen Bt (Nha Hố, Ninh Thuận). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Joanne D. and K. Olsen, 1996. The Potential for Transgenic Cotton Plants to select for resistance in Helicoverpa armigera. Cotton on to the future. Proceeding of the 8 th Australian Cotton conference, 14 th -16 th , August, The Australian Cotton Growers’ Research Association, p. 295-298. 2. Du Min, 2002. Situation of the Bt transgenic cotton in China. New Genetical Approaches to Cotton Improvement, Proceeding of the 2 nd Meeting of the Asian Cotton Research and Development Network, November 14-16, Tashkent, Uzbekistan, p. 10-21. 3. Li Fuguang and Cui Jinjie, 2001. Study on insect resistant transgenic cotton harbouring double gene and its resistance to insect pest. Chinese Agricultural Science, p. 70-76. 4. Xia Jingyuan, 2000. Resistance of transgenic Bt cotton to Helicoverpa armigera Hỹbner (Lepidoptera: Noctuidae) and its effects on other insects in China. Proceeding of the first Vietnam-Sino conference on cotton technology and its industrialization, November, 2000, Hochiminh City, Vietnam, p. 13-14. Phản biện: GS-TS-NCVCC. Phạm Văn Lầm TÁCH LỚP CHẤT KHÁNG NẤM VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC PHÕNG TRỪ BỆNH HÉO VÀNG CÀ CHUA (Fusarium oxysporum) CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC VH- BIOCHEM 01 Isolation of Antifungal Class and Evaluation of The Disease Control Efficacy of VH-Biochem 01 Against Wilt Disease on Tomato Caused by Fusarium oxysporum Nguyễn Mai Cƣơng 1 , Hà Viết Cƣờng 2 , Nguyễn Đức Huy 2 và Đoàn Thị Xuân Liễu 1 Ngày nhận bài: 26.03.2018 Ngày chấp nhận: 16.04.2018 Abstract The result of bioautography assay and isolation of antifungal class from Bacillus velezensis HSHC1 broth culture using an Amberlite TM XAD16 shown that the antifungal compounds against Fusarium oxysporum caused wilt disease on tomato belongs to lipopeptide family. The antifungal efficacy of VH-Biochem 01 product containing 10 5 CFU/g had a disease control value of 71.31% after 21 days treatment at a concentration of 1 g/l against Fusarium wilt disease on tomato. This value is less than that from Tramy 2 SL (74.24%), at a concentration of 1 ml/l. Keywords: Fusarium wilt disease, Fusarium oxysporum, Bacillus velezensis HSHC1, bioautography assay, VH-Biochem 01. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) là một loại bệnh hại phổ biến, xuất hiện và gây hại ở nhiều vùng trồng cà chua tại 1. Trung tâm Hóa sinh Hữu cơ, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam 2. Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 26 Việt Nam. Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phận của cây. Khi cây bị nhiễm bệnh, lá chuyển sang màu vàng và héo dần từ phần dưới lên ngọn, cây sinh trưởng kém, cuối cùng toàn cây héo dần và chết. Nấm gây bệnh phát triển thích hợp ở nhiêt độ 25 – 30 o C, phát sinh và gây hại nặng vào mùa mưa ở giai đoạn cây bắt đầu ra hoa trở đi. Nấm F. oxysporum có phổ ký chủ rộng và có thể xâm nhiễm ký sinh gây hại trên nhiều họ cây trồng có giá trị kinh tế như chuối, cà chua, khoai tây, lạc, vừng, hồ tiêu, dưa hấu... [1,2]. Mỗi dạng F. oxysporum thường chỉ gây héo trên một loài ký chủ, bệnh héo vàng hại cà chua được ghi nhận là do loài F. oxysporum f.sp. lycopersici. Nấm F.oxysporum tồn tại chủ yếu trong đất, nấm xâm nhập qua bộ rễ và gây bệnh vào bó mạch. Do đây là nơi đảm nhận chức năng hút nước, hút chất dinh dưỡng và ở dưới mặt đất nên việc phòng trừ bằng thuốc hóa học luôn gặp nhiều khó khăn [3,4]. Trong giai đoạn 2003-2005, tỉ lệ mắc bệnh héo vàng do nấm F. oxysporum gây ra trên cây cà chua ở Hà Nội chiếm 5% [5]. Những năm gần đây, người dân thường sử dụng các chế phẩm như Starner 20WP, Copper-B 75WP, Bonny 4SL, Ridozeb 72WP, Manozeb 80WP, Tramy 2SL, Tachigaren 30SLTuy nhiên, việc sử dụng các biện pháp hóa học trong phòng trừ nấm F. oxysporum gây ra những tác động lớn tới môi trường, hiệu quả sử dụng giảm dần do bị kháng thuốc và có nguy cơ tồn dư thuốc trong sản phẩm sau thu hoạch và chế biến do chủ yếu dùng để tưới xuống đất. Bên cạnh đó, các biện pháp kỹ thuật canh tác đã được áp dụng nhằm giảm thiểu thiệt hại như thay đổi cơ cấu vụ mùa, sử dụng giống cây trồng ít mẫn cảm với bệnh. Tuy nhiên, hiệu quả đạt được vẫn luôn thấp do nguồn bệnh có thể tồn tại trong một thời gian rất dài, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ bùng phát trở lại [4,6]. Để khắc phục những nhược điểm trên thì biện pháp sinh học đang được các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu, ứng dụng và khuyến khích sử dụng. Biện pháp này sử dụng các vi sinh vật có ích, các sản phẩm có nguồn gốc sinh học như thuốc thảo mộc, sản phẩm công nghệ sinh học như giống chuyển gen kháng bệnh nhằm ngăn chặn hoặc giảm bớt thiệt hại do bệnh hại gây ra. Đây là một biện pháp tốt, có nhiều triển vọng trong tương lai. Cho tới thời điểm hiện nay, chưa có chế phẩm kháng nấm F. oxysporum hiệu quả có nguồn gốc VSV được thương mai hóa hay nghiên cứu chuyên sâu tại Việt Nam. Trên thế giới, có nhiều loại vi sinh vật đối kháng, thường là nấm và vi khuẩn, chủ yếu có nguồn gốc từ đất, đã và đang được nghiên cứu, ứng dụng ở mức thương mại trong phòng chống sinh học bệnh cây như vi khuẩn Agrobacterium, Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, và nấm Gliocladium, Trichoderma, Ampelomyces, Candida, Coniothyrium, Chaetomium [8,9,10]. Trong số đó Bacillus có những ưu điểm nổi bật như sự đa dạng về chủng loài, khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt cao. Nghiên cứu này cung cấp dẫn liệu khoa học về xác định lớp chất kháng nấm và khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) của chế phẩm VH- Biochem 01. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguồn nấm Fusarium oxysporum được phân lập từ mẫu bệnh héo vàng hại cà chua ở Nam Hồng - Đông Anh – Hà Nội. Chế phẩm sinh học dạng bột thấm nước chứa vi khuẩn đối kháng chủng Bacillus velezensis HSHC1 với mật độ 10 5 CFU/g. Môi trường dùng để phân lập và nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum: WA (20g agar/l), PGA (dịch lọc từ 200g khoai tây/l, 20 g agar/l, 20 g glucose/l), trấu cám (trấu cám 40g, nước cất vô trung 24 ml), TSB (17 g tryptone/l, 3 g phytone/l, 5 g NaCl/l, 2,5g K2HPO4/l, 2,5 g glucose/l ), PDA (4g khoai tây/l, 20 g agar/l, 20 g dextrose/l). Thuốc trừ nấm: Tramy 2 SL. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và phát triển của HSHC1 Khuẩn lạc của Bacillus velezensis được tách và cấy truyền vào trong ống nghiệm có thể tích 15 ml chứa 5 ml môi trường TSB và nuôi cấy tại 30 o C, trong 24h. Sau đó, dịch nuôi cấy được tiếp tục cấy truyền sang bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường TSB với tỉ lệ giống là 1%. Qui trình nuôi cấy được thực hiện ở khoảng nhiệt độ Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 27 từ 20-45 0 C, pH ban đầu 2-8, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24h. Chỉ số OD được đo bằng thiết bị đo OD600 DiluPhotometer™ tại bước sóng 600 nm. Giá trị pH được điều chỉnh bởi HCl 6N/NaOH 2N. 2.2.2 Xác định lớp chất kháng nấm có hoạt tính từ dịch nuôi cấy Bacillus velezensis được nuôi cấy trong môi trường TSB ở 30 o C, 120 vòng/phút trong 72h. Tổng cộng 500 ml dịch nuôi cấy được ly tâm tại 4 o C, 7500 vòng/phút trong 20 phút để tách phần tế bào. Dịch sau ly tâm được hấp thụ bằng 4% (g/ml) nhựa Amberlite XAD 16 trong 2,5h có khuấy trộn (150 vòng/phút). Phần nhựa hấp thu được thu hồi và rửa giả bằng 250 ml methanol. Sau khi loại methanol bằng quay chân không thu được cặn rắn. Phần cặn này là các lipopeptide thô [8,11]. Phần tế bào, hoạt chất lipopeptide, chất mang, phụ gia được sử dụng để tạo ra sản phẩm VH-Biochem 01. Phần dịch thu được sau hấp thu bằng XAD 16 được cất loại nước. Hòa tan cặn nước thu được băng methanol 50% tại nồng độ 1000 ppm. Phần lipopeptide thô, và căn sau khi đã hấp thu bằng XAD 16 được thử hoạt tính trên đĩa thạch PDA, đĩa giấy 8 mm sử dụng 30µl dung dịch methanol chứa lipopeptide nồng độ 500 ppm và 60 µl cho phần cặn nước. Các khảo sát trên bioautography được thực hiện trong hệ dung môi chloroform/methanol/H2O: 65/25/4, sử dụng bản mỏng Silica tráng trên kính, chiều dày 0.5 mm. Bản mỏng cắt đôi, đặt vào đĩa, đổ 20 ml môi trường PDA chứa nấm F. oxysporum (0.2%), nuôi cấy ở 30 o C trong 4 ngày. Khả năng đối kháng nấm của B. velezensis HSHC1 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở điều kiện 30 o C trong 7 ngày để đánh giá. 2.2.3 Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng Fusarium oxsporum hại cà chua bằng chế phẩm VH–Biochem 01 có vi khuẩn đối háng chủng Bacillus trong điều kiện nhà lưới Thí nghiệm được tiến hành trên cây cà chua 20 ngày tuổi có 4 – 5 lá thật, bào tử nấm gây bệnh héo vàng được đưa vào xung quanh gốc cây, gồm 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây [7]. Công thức 1: Tưới Chế phẩm VH - Biochem 01 với liều lượng 1g/l vào đất quanh gốc cây sau khi lây bệnh nhân tạo 1 ngày. Công thức 2: Tưới thuốc so sánh Tramy 2 SL với liều lượng 1ml/l vào đất quanh gốc cây sau khi lây bệnh nhân tạo 1 ngày. Công thức 3 (Đối chứng): Tưới nước cất vào đất quanh gốc cây sau khi lây bệnh nhân tạo 1 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi: Tính số cây bị bệnh (TLB %) ở từng công thức sau 7, 14, 21 ngày và hiệu quả phòng trừ sau 21 ngày theo dõi. Tỷ lệ bệnh được tính theo công thức: Trong đó: A là số cây bị bệnh héo vàng. B là tổng số cây điều tra. Hiệu lực phòng trừ được xác định theo công thức Abbott: Trong đó: C: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng, T: Chỉ số bệnh ở công thức thử nghiệm Xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2007. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và phát triển của Bacillus velezensis HSHC1 Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Bacillus là 30-35 0 C, khi nhiệt độ giảm xuống, sự sinh trưởng và phát triển sẽ kém đi (bảng 1). Ở điều kiện 40 o C, vi sinh vật tiếp tục phát triển, khi nhiệt độ tăng tới 45 o C, Bacillus không sinh trưởng và phát triển. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu được thực hiện tại 30 o C, trong môi trường TSB, các giá trị OD cho thấy chủng này có thể phát triển tốt sau 24h khi pH ban đầu 6-7. Do vậy trong quá trình nuôi cấy, giá trị pH thích hợp nhất trong khoảng 6-7. Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 28 Bảng 1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy và pH ban đầu tới sự sinh trƣởng và phát triển của B. velezensis HSHC1 Nhiệt độ ( 0 C) 20 25 30 35 40 45 OD (600 nm) 1,16 ± 0,07 1,49 ± 0,06 1,87 ± 0.06 1,86 ± 0,01 0,71 ± 0,05 0,01 ± 0,01 pH ban đầu 3 4 5 6 7 8 9 OD (600 nm) 0,21 ± 0,01 0,83 ± 0,06 1,77 ± 0,06 1,91 ± 0,06 1,92 ± 0,04 1,24 ± 0,01 0,18 ± 0,04 3.2 Xác định lớp hoạt chất kháng nấm mang hoạt tính từ dịch nuôi cấy Hoạt tính đối kháng của B. velezensis HSHC1 đối với nấm F.oxysporum gây bệnh héo vàng trên cây cà chua được đánh giá trên môi trường PDA (hình 1). Vòng đối kháng đã chỉ ra hiệu quả đối kháng mạnh của chủng HSHC1. Từ kết quả này, cơ chế đối kháng nấm có thể do các hoạt chất được sinh tổng hợp và giải phóng ra trong quá trình phát triển của vi khuẩn, do enzyme hoặc do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng hoặc do tác động của tất cả các cơ chế đã nêu. Các thử nghiệm tiếp theo sẽ chứng minh sự có mặt của các chất kháng nấm trong môi trường nuôi cấy. Hình 1. Tính đối kháng của B.Velezensis HSHC 1 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của lớp chất sau khi hấp thu bằng nhựa XAD 16 và phần cặn nước thu được sau khi hấp thu cho thấy phần dung dịch còn lại không thể hiện hoạt tính kháng nấm trên đĩa thạch. Điều đó chứng tỏ các chất kháng nấm đã được hấp thu hoàn toàn vào hạt nhựa, nếu còn trong dung dịch thì hàm lượng rất nhỏ, dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp thử hoạt tính (hình 2). Hình 2. Hoạt tính kháng nấm sau hấp thu bằng XAD 16 Trên sắc ký bản mỏng hiện bằng phun nước, kết hợp với kết quả thử bioautography (hình 3) và tính chất hấp thu các chất của nhựa XAD 16 cho thấy, phần hoạt chất tạo ra trong dịch nuôi cấy B. velezensis HSHC1 thuộc lớp chất lipopeptide. Đây là lớp chất kháng nấm đặc trưng cho Bacillus. Trong bioautography, có hai vùng thể hiện hoạt tính kháng nấm khác nhau. Vùng 1 tương ứng với chất hoạt động bề mặt biosurfactant, vùng 2 tương ứng với các cyclo lipopeptide [8-11]. B1: B. Velezensis HSHC 1; FO: Fusarium oxysporum B.1 B.1 FO Hình 1. Tính đối kháng của B. Velezensis HSHC 1 HP1 HP2 HPO1 HPO2 CK Hình 2. Hoạt tính kháng nấm sau hấp thu bằng XAD 16 HP: Lipopeptide hấp thu bằng XAD 16 HPO: Cặn sau khi hấp thụ bằng XAD 16 Nông độ: 500 ppm; thể tích sử dụng: 30 µL Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 29 Hình 3. Sắc ký bản mỏng và bioautography 3.3 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến lƣợng hoạt chất thu nhận Tại điều kiện nuôi cấy: 30 o C và pH ban đầu 6,5; giá trị OD không có sự biến động đáng kể trong khoảng thời gian 20-72h (bảng 2). Điều này được giải thích do giai đoạn sinh trưởng kết thúc sau 16h, sau đó đi vào giai đoạn cân bằng và suy vong. Để thu được lượng CFU tốt nhất cho quá trình nhân giống để nuôi cấy trong môi trường mới, thời gian nuôi cấy nên thực hiện trong khoảng thời gian từ 16-24h, sau giai đoạn này, vi sinh vật sẽ đi vào giai đoạn tiêu thụ cơ chất và tạo nên các chất có hoạt tính. Nếu thời gian tiếp tục kéo dài, Bacillus sẽ tạo thành các dạng bào tử để chống lại sự nhiễm độc và thiếu cơ chất. Điều này được thể hiện rõ qua số lượng hoạt chất thu nhận tăng từ 0,82 g (20h) lên 1.00 g sau 72h, mặc dù chỉ số OD không có sự thay đổi. Do vậy, để thu nhận hoạt chất, quá trình nuôi cấy cần được tiến hành trên 72h. Bảng 2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến chỉ số OD và lƣợng lipopeptide thu đƣợc Thời gian nuôi cấy (h) 16 18 20 22 24 48 72 OD (600 nm) 1,77 ± 0,06 1,83 ± 0,03 1,92 ± 0,04 1,91 ± 0,01 1,90 ± 0,04 1,90 ± 0,01 1,93 ± 0,00 Thời gian nuôi cấy (h) 24 36 48 60 72 84 96 Lượng lipopeptide thô (g) 0,33 ± 0,02 0,63 ± 0,01 0,82 ± 0,01 0,95 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,99 ± 0,02 1,00 ± 0,02 3.4 Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxsporum) hại cà chua của chế phẩm VH – Biochem 01 trong điều kiện nhà lƣới Chế phẩm VH – Biochem 01 được sử dụng để đánh giá với bệnh héo vàng hại cà chua trong điều kiện nhà lưới cho thấy: công thức được xử lý bằng chế phẩm VH – Biochem 01 và công thức sử dụng thuốc Tramy 2 SL đều có hiệu quả cao trong việc kìm hãm sự phát triển của bệnh so với công thức đối chứng sau xử lý 7, 14 và 21 ngày (bảng 3, hình 4). Chế phẩm VH – Biochem 01 có hiệu quả phòng trừ bệnh héo vàng cà chua đạt cao nhất (71,21%). Chế phẩm VH-Biochem 01 có tiềm năng ứng dụng trong phòng trừ bệnh héo vàng cà chua nhằm thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Hình 3: Sắc ký bản mỏng và bioautography 1 2 Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 30 Bảng 3. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum) hại cà chua bằng chế phẩm VH – Biochem 01 Công thức Tỷ lệ bệnh (%) sau phun lần 2 Hiệu quả phòng trừ (%) 7 DAI 14 DAI 21 DAI 7 DAI 14 DAI 21 DAI CT1 0 a 11,11 a 21,11 a 100 72,97 71,21 CT2 0 a 10 a 18,89 a 100 75,67 74,24 Đối chứng 18,89 b 41,11 b 73,33 b - - - LSD0.05 5,037 13,32 10,23 CV 35,29 28,34 11,95 CT1: Xử lý bằng chế phẩm VH – Biochem 01 CT2: Xử lý bằng thuốc Tramy 2 SL CT3: Công thức đối chứng Hình 4. Cây cà chua sau khi xử lý 21 ngày với chế phẩm VH – Biochem 01 trong điều kiện nhà lƣới 4. KẾT LUẬN 1. Kết quả phân tích bằng bioautography, hiện bằng phun nước và hấp thu bằng nhựa XAD 16 đã xác định được lớp chất kháng nấm tạo ra bởi B. velezensis HSHC 1 trong sản phẩm VH-Biochem 01 thuộc lớp chất lipopeptide, lớp chất kháng nấm đặc trưng cho Bacillus. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho HSHC 1 để thu nhận hoạt chất và tăng sinh khối là 30 o C, pH ban đầu 6-7 trong 72h. 2. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum) cà chua trong điều kiện nhà lưới bằng chế phẩm sinh học VH – Biochem 01 có chủng vi khuẩn Bacillus cho hiệu quả phòng trừ cao và đạt 71,21% sau 21 ngày xử lý chế phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tấn Dũng, 2002. Bệnh héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng chống. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng 2003. Bệnh hại cà chua do nấm, vi khuẩn và biện pháp phòng chống. Sách chuyên khảo, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. 3. Đỗ Tiến Hoàng, 2007. Nghiên cứu bện héo vàng (Fusarium oxysporum) hại cây trồng cạn Hè Thu năm 2017 tại Gia Lâm – Hà Nội và thử chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh. NXB Nông Nghiệp. 4. Huang et al, 2013. Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7. BMC Microbiology, 13:87 5. Nguyễn Kim Vân ,1998. Bệnh héo vàng cà chua và một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh trên đồng ruộng. Tạp chí Bảo vệ thực vật, 16 (160), tr 8-10. 6. Ngô Thị Xuyên và Nguyễn Văn Đĩnh, 2006. Nghiên cứu tinh hình bệnh hại cà chua trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng năm 2003 – 2005. Tạp chí Khoa học và Nông nghiệp Việt Nam, số 4- 5, trang 1-7. 7. Ongena M, et al, 2008. Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology, 16(3), 115-125