Tách và xác định thành phần các polysaccharide tan trong nước từ rong nâu sargassum crassifolium ở vịnh Nha Trang

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC POLYSACCHARIDE TAN TRONG NƯỚC TỪ RONG NÂU SARGASSUM CRASSIFOLIUM Ở VỊNH NHA TRANG Bùi Văn Nguyên(1), Lê Công Hoan(1), Phạm Đức Thịnh(2), Trần Thị Thanh Vân(2) (1) Trường Đại học Khánh Hòa, (2) Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Ngày nhận bài 15/06/2018; Ngày gửi phản biện 20/06/2018; Chấp nhận đăng 08/07/2018 Email: buivannguyen@ukh.edu.vn Tóm tắt Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về thành phần polysaccharide từ rong nâu Sargassum crassifolium thu thập ở Vịnh Nha Trang. Kết quả cho thấy hàm lượng alginate lớn nhất chiếm 25%, fucoidan 1,4% và laminaran 0,09%. Bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion fucoidan thô được tách thành 3 phân đoạn trên cột sắc ký DEAE-cellulose. Kết quả phân tích thành phần monosaccharide cho thấy trong fucoidan thành phần chủ yếu là fucose và galactose. Từ khóa: rong nâu, tan trong nước, thành phần, Vịnh Nha Trang Abstract ISOLATION AND CHEMICAL COMPOSITION OF WATER-SOLUBLE POLYSACCHARIDES FROM BROWN SEAWEED SARGASSUM CRASSIFOLIUM IN NHA TRANG BAY Water-soluble polysaccharides such as fucoidans, alginates and laminarans were isolated from brown seaweed Sargassum crassifolium. The yield of polysaccharides studied seaweeds was alginate 25%, laminaran 0.09% and fucoidan 1.4%. Three fractions of sulfate polysaccharide (fucoidan) extracted from the brown alga Sargassum crassifolium were fractionated by using anion – exchange chromatography on DEAE-cenlulose column. All fucoidans were sulfated polysaccharides. The main components of fucoidans were fucose and galactose along with small amounts of xylose, mannose, rhamnose and glucose. 1. MỞ ĐẦU Trong đa dạng vô tận của thảm thực vật đại dương, rong Nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng được lưu ý nhất mà loài người đã phát hiện ra. Rong Nâu chứa rất nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các đường (galactose, mannose, xylose); axit amin; axit béo nhiều nối đôi; chất khoáng dưới dạng keo; các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có hoạt tính chống oxi hóa mạnh bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hại; fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu; alginat là chất giải độc thiên nhiên và laminaran là chất chống đông cục máu và ung thư [3, 4, 5, 11]. Fucoidan là một sulfate polysaccharide có cấu trúc hóa học phức tạp. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các loại khác như galactose, glucose, manose..., ngoài ra còn có axít uronic. Fucoidan được biết đến là một chất có nhiều hoạt tính sinh học quí báu như hoạt tính chống u, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ máu và kháng virus như HIV. Ngoài ra fucoidan còn được mô tả có nhiều tác dụng sinh học khác như tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu... Do có các tính chất quí báu như vậy nên fucoidan thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới [3, 4, 5, 11]. Nước ta có hơn 3600 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong phú, rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất, trong đó chi rong có trữ lượng lớn nhất là sargassum[8]. Các nghiên cứu về polysaccharide từ chi sargassum mới được nghiên cứu rất ít. Đặc biệt là rong nâu sargassum crassifolium lần đầu tiên được chúng tôi tiếp cận nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu thành phần polysaccharide tách chiết từ rong nâu sargassum crassifolium thu thập ở Vịnh Nha Trang giúp định hướng nghiên cứu công nghệ cũng như nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và hoạt tính, cho biết hàm lượng dinh dưỡng và sử dụng làm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng. Từ đó làm nền tảng cơ sở cho sự phát triển và sử dụng nguồn tài nguyên rong nâu một cách hiệu quả ở Khánh Hòa. 2. THỰC NGHIỆM Mẫu rong: Rong được thu thập tại Vịnh Nha Trang vào tháng 6/2017 và định danh bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Mẫu rong sau khi thu thập được rửa sạch tạp chất (rác, cát, mùn,...) bằng nước ngọt, đem phơi khô ở nhiệt độ thường trong không khí và được cắt nhỏ. Hóa chất và thiết bị: Hóa chất: rượu etylic (C2H5OH), axeton (CH3COCH3), axít clohyđric (HCl), nước cất (H2O), natri hiđrocacbonat (NaHCO3), natri cacbonat (Na2CO3), nhựa DEAE-cellulose, natri clorua (NaCl), trifloaxetic TFA (CF3COOH), amoniac (NH3), natrihiđroxit (NaOH), các hóa chất chuẩn bao gồm: fucose, galactose, mannose, rhamnose, glucose và xylose tất cả của hãnh Sigma (Mỹ). Thiết bị: Máy phân tích cacbonhyđrat (ICS 3000 của hãng Dionex Mỹ), máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy đông khô, máy phân tích UV-VIS, máy đo pH. Tách fucoidan: Rong khô xử lý với cồn và axeton để loại các hợp chất béo, chất màu,... Mẫu rong thu được sử dụng để chiết polysaccharide. Lấy 500 gam rong khô đem chiết bằng dung dịch HCl 0,02M (pH = 2-3) (tỉ lệ rong khô : dịch chiết = 1:10) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2 giờ, lọc tách bã rong qua một lớp vải lọc mịn và đem chiết lại hai lần với điều kiện tương tự. Dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và được trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết được cô quay chân không ở nhiệt độ 50oC đến còn 1/5 thể tích ban đầu. Sau đó được tiến hành chạy thẩm tách qua màng 10kDa trong 48h, cuối cùng đông khô để chuyển thành dạng bột. Kết quả ta thu được hỗn hợp polysaccharide có thành phần chính là fucoidan [9, 10, 11, 14]. Tách alginate: Bã rong còn lại sau khi chiết fucoidan được phơi khô và tiếp tục chiết alginat. Chiết alginat (50g rong khô) tiến hành chiết với 2,5 lít dung dịch Na2CO3 3% trong 3 giờ tại 60oC (lặp lại 2 lần), sau đó chiết thêm với 2 lít dung dịch Na2CO3 3% nữa và để qua đêm. Dịch chiết alginat natri được tách khỏi bã rong bằng cách lọc thô qua lớp vải lọc mịn, dịch lọc được cô chân không đến 1/5 thể tích ban đầu và thẩm tách với màng 10kDa. Sau đó, dung dịch HCl 0,1M được thêm vào đến pH = 2 và để yên 12 giờ để kết tủa hoàn toàn axit alginic. Ly tâm tách tủa khỏi dung dịch, rửa lại tủa 3 lần bằng dung dịch HCl 0,1M (hoặc dung dịch axit alginic được tủa trong cồn 960 theo tỷ lệ 1:2). Sau đó tủa axit alginic được hòa tan lại bằng dung dịch NaOH 1M, đem thẩm tách và tủa lại bằng 2 thể tích cồn 85%. Li tâm, tách tủa và rửa lại 3 lần với dung dịch cồn 85% đem sấy chân không ta thu được alginat natri dạng thô [6,13]. Tách laminaran: Bột fucoidan thô thu được có chứa thành phần chính là fucoidan lượng ít laminaran và axit alginic. Cân 0,5g mẫu đem hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, đặt vào máy khuấy trộn để hòa tan, sau đó ly tâm ở 15oC với tốc độ 10.000 (v/p) trong 10 phút. Phần dịch được đưa lên cột DEAE-Cellulose (4x24 cm), phần không tan là polymanuronic. Sau đó, lần lượt rửa giải với dung dịch HCl 0,04N. Phân đoạn laminaran tách ra được cô chân không đến thể tích nhỏ nhất có thể (10ml) và được thẩm tách để ở 4oC (2-3 ngày) sau đó đem đông khô ta thu được bột laminaran [9, 10, 11, 14]. Tách phân đoạn fucoidan thô: Sau khi tách laminaran ở trên tiếp tục rửa giải với các dung dịch NaCl có nồng độ tăng dần 0,5N; 1,0N; 2,0N. Mỗi một lần như vậy cột được rửa cho đến khi dung dịch giải hấp không còn thấy xuất hiện phản ứng dương tính của carbohydrate với phenol và axit sulfuric đậm đặc [7]. Tất cả các phân đoạn thu được đem thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1, F2, F3 [9]. Phân tích thành phần monosaccharide của fucoidan: Thủy phân fucoidan sử dụng TFA 4N ở 100ºC trong 6h, sau đó để nguội cô quay gần đến khô thêm tiếp NH3(2,5%) cô quay tiếp (lập lại 3 lần), mẫu thu được hòa tan lại trong H2O cất, ly tâm lấy dịch trong đem phân tích thành phần monosaccharide[1, 6]. Xác định thành phần monosaccharide bằng phương pháp HPAE-PAD (High performance anion exchange – pulsed amperometric detection) trên hệ thống ICS 3000 tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Chương trình chạy: rửa isocratic với hệ dung môi: H2O:NaOH 10mM = 99:01, tốc độ rửa giải 0,1ml/min, thời gian chạy 25min, nhiệt độ 300C trên cột CarboPac PA20 (3x150mm). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thành phần polysaccharide chủ yếu trong rong nâu bao gồm alginate, laminaran và fucoidan. Trong mẫu rong nâu Sargassum crassifolium nghiên cứu có chứa alginate 25%, laminaran 0,09% và fucoidan 1,4%. So sánh với kết quả phân tích hàm lượng polysaccharide trong một số loài rong nâu trên thế giới[12] thì loài rong Sargassum crassifolium ở Vịnh Nha Trang có hàm lượng laminaran thấp hơn, fucoidan là tương tương và hàm lượng alginate tương đối cao. Điều này một lần nữa khẳng định các yếu tố địa lý nơi cây rong sinh trưởng như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối, ... đã ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong . Nghiên cứu fucoidan từ rong nâu sargassum crassifolium kết quả tách phân đoạn thu được 3 phân đoạn khác nhau F1, F2 và F3 như miêu tả Hình 3.1. Kết quả xác định thành phần hóa học monosaccharide của fucoidan được đưa ra trên Bảng 3.1. Giống như các fucoidan khác, fucoidan từ rong nâu Sargassum crassifolium có thành phần bao gồm nhiều loại đường với tỉ lệ khác nhau, fucoidan từ rong nâu sargassum crassifolium thì hai thành phần chủ yếu là fucose và galactose. Ngoài ra còn có các thành phần khác như xylose, mannose, glucose và rhamnose. Riêng chỉ phân đoạn F3 là đơn giản nhất ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose còn có rất ít rhamnose và không có thành phần xylose, mannose và glucose. Hình 1. Phân đoạn fucoidan bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-Cellulose Bảng 1. Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan Phân đoạn Thành phần monosaccharide (%mol) Fucose Galactose Xylose Manose Glucose Rhamnose F1 80,00 15,10 1,00 1,30 1,10 1,50 F2 69,50 25,59 1,20 1,30 1,01 1,40 F3 86,25 12,05 0,00 0,00 0,00 1,70 Hình 2. Sắc ký đồ của chuẩn và mẫu 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu tách và xác định thành phần polysaccharide từ rong Nâu Sargassum Crassifolium thu thập ở Vịnh Nha Trang cho thấy hàm lượng alginate lớn nhất chiếm 25%, fucoidan 1,4% và laminaran 0,09%. Kết quả phân tích thành phần monosaccharide cho thấy trong fucoidan thành phần chủ yếu là fucose và galactose. Kết quả giúp định hướng nghiên cứu công nghệ cũng như nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và hoạt tính, cho biết hàm lượng dinh dưỡng và sử dụng làm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng. Từ đó làm nền tảng cơ sở cho sự phát triển và sử dụng nguồn tài nguyên rong nâu một cách hiệu quả ở Khánh Hòa. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học của monosaccharide từ rong nâu Sargassum crassifolium, những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ công bố trong những bài báo khoa học sau. TÀI LIỆU THAM KHẢO S. D. Anastyuk, N. M. Shevchenko, E. L. Nazarenko, P. S. Dmitrenok, and, T. N. Zvyagintseva (2009). Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry. Carbohydrate Research, 344 (6), 779-787. M. I. Bilan, A. A. Grachev, N. E. Ustuzhamina, A. S. Shashkov, N. E. Nifantiev, A. I. Usov (2002). A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. Carbohydrate Research, 337, 719-730. B. Li, F. Lu, X. Wei and R. Zhao (2008), Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules, 13, 1671-1695. W. A. P. Black, E. T. Dewar, F. N. Woodward (1952). Manufacture of algal chemicals. IV.-Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae, J. Sci. Food Agric., 3, 122-129. Bùi Minh Lý (2010). Đánh giá hiện trạng và Nghiên cứu giải pháp bảo vệ nguồn lợi rong Mơ (Sargassum) tại Khánh Hòa. Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Khánh Hòa. D. Choosawad, U. Leggat, C. Dechsukhum, A. Phonggdara and W. Chotigeat (2005). Anti-tumour activities of fucoidan from the aquatic plant Utricularia aurea lour. Songklanakarin J. Sci. Technol., 27 (3), 799-807. M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and F. Smith (1956), Colorimetric, method for determination of sugars and related substances, Anal Chem, 28, 350-6. Huynh Q. N and Nguyen H. D (1998). The seaweed resources of Vietnam, A.T Critchley, M. Ohno. Seaweed resources of the World, Japan, 62-69. O. S. Vishchuk, S. P. Ermakova, T. N. Zvyagintseva (2011). Sunphated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity. Carbohydrate Research, 346, 2769-2776. E. G. V. Percival and A. G. Ross (1950), Fucoidin. Part I. The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, 717-720. M. S. Pereira, F. R. Melo and P. A. S. Mourão (2002). Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sunphated galactans and sunphated fucans?. Glycobiology, 12(10), 573-580. P. Ruperes (2002). Mineral content of edible marine seaweeds. Food chemistry, 79, 23-26. P. Vauchel, R. Kaas, A. Arhaliass, R. Baron and J. Legrand (2008). A new process for extracting alginates from Laminaria digitata, Reactive Extrusion. Food Bioprocess Technol, 1, 297-300. T. N. Zvyagintseva, N. M. Shevchenko, I. B. Popivnich (1999). A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res, 322, 32-39.