Tài liệu Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 14 MẪU MÁU Mục tiêu · Giúp được lâm sàng cho các chỉ định cấy máu thích hợp nhất vì biết được chỉ định cấy máu và thời điểm tốt nhất để thực hiện cấy máu, · Thực hiện đúng cách xét nghiệm cấy máu vì biết được cách thực hiện cấy máu như thế nào, bao gồm thể tích máu nên lấy để cấy bao nhiêu, nên cấy máu mấy lần?... · Lựa chọn được phương tiện thích hợp nhất cho cấy máu trong các bệnh viện hiện nay nhờ biết được phương tiện (môi trường) phù hợp nhất để cấy máu. · Thực hiện tốt qui trình theo dõi cấy máu và cho các kết quả chính xác – kịp thời đến lâm sàng vì biết được qui trình theo dõi cấy máu · Biện luận được một cách chính xác kết quả cấy máu vì biết được các vi khuẩn thường gặp trong cấy máu là các vi khuẩn nào? Làm thế nào để có thể nhận biết được một cấy máu dương tính thật sự với một cấy máu dương tính do ngoại nhiễm. Chỉ định cấy máu ¦ Phải chỉ định cấy máu trước các trường hợp nhiễm trùng có thể có du khuẩn huyết tạm thời (transient bacteremia) hay nhiễm trùng huyết (septicemia).. ¦ Do vậy, nên chỉ định cấy máu trước các bệnh nhân có một trong các triệu chứng như sốt, ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim (cardiac murmur) nghi ngờ viêm nội tâm mạc, có xuất huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao (splinder) trên móng tay, choáng. Thời điểm cấy máu ¦ Phải cấy máu trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. Trong bệnh viện, Bác sĩ phải cho cấy máu trước khi bắt đầu cho bệnh nhân dùng kháng sinh. ¦ Tuy nhiên trong các trường hợp bệnh nhân đang điều trị kháng sinh nhưng các triệu chứng của du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết vẫn không thuyên giảm thì bác sĩ cũng nên cho chỉ định cấy máu để phát hiện tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng. ¦ Thời điểm tốt nhất để cấy máu là khi bệnh nhân bị ớn lạnh hay đang lạnh run trước khi sốt, hay lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt.. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 15 ¦ Có thể cấy máu 2 lần trong vòng 1 giờ đầu, và thực hiện cấy máu tại 2 vị trí lấy máu khác nhau trên cơ thể (vd: lần đầu lấy máu tay mặt thì lần sau lấy máu ở tay trái). Cách lấy máu để cấy ¦ Lấy máu tĩnh mạch bằng phương pháp vô trùng (sát trùng da bằng cồn 70%, chờ khô rồi mới chọc kim lấy máu). ¦ Thể tích máu được lấy để cấy nên chiếm 1/10 hay tối đa là 1/5 thể tích môi trường cấy máu. Thông thường lấy 3-10ml máu để cấy vào môi trường cấy máu có thể tích 50ml. Đối với trường hợp bệnh nhân là trẻ em, lấy khoảng 2-3ml máu để cấy là vừa. Môi trường cấy máu ¦ BHI, TSB hay Columbia broth, cho vi khuẩn hiếu khí. ¦ Để cấy kỵ khí, thêm vào môi trường các chất khử như Thioglycollate, L-cysteine. ¦ Để kháng đông, tốt nhất là dùng Sodium Polyanethol Sulfonate (SPS), nếu không có thì dùng citrate hay heparin. Theo dõi cấy máu ¦ Chai cấy máu được ủ trong tủ ấm 35oC hay 37oC và theo dõi mỗi ngày trong 5-7 ngày xem có dấu hiệu có vi khuẩn mọc hay không trong môi trường cấy máu lỏng, đó là: (1) có hạt đóng trên mặt hồng cầu, (2) đục đều hay có màng, (3) tiêu huyết, (4) đông huyết tương, (5) có gas, (6) có hạt trắng trong lớp hồng cầu hay mặt lớp hồng cầu. ¦ Nếu là chai cấy máu có 2 phase thì trước khi ủ và mỗi ngày sau khi quan sát mặt thạch của phase đặc xem có khúm vi khuẩn mọc hay không? nếu không có khúm vi khuẩn mọc trên phase đặc, tráng phase lỏng lên phase đặc. Có một số vi khuẩn rất dễ bị ly giải sau khi mọc trong môi trường lỏng như S. pneumoniae, hay khó mọc thành khúm trên phase đặc như Streptococci, do đó nên làm một cấy truyền mù lên mặt thạch (thạch máu hay thạch nâu, sau đó ủ trong tủ ấm CO2 hay bình nến) sau khi ủ chai cấy máu qua đêm hoặc sau 24 giờ. ¦ Bất cứ lúc nào phát hiện có dấu hiệu vi khuẩn mọc (trên phase đặc thấy có khúm vi khuẩn mọc, hay trên phase lỏng thấy có một trong các dấu hiệu vi khuẩn mọc như kể trên) hay nghi ngờ vi khuẩn mọc, tiến hành cấy phân lập ngay, tốt nhất là trên thạch bổ dưỡng nhất Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 16 là thạch nâu có bổ sung XV (CAXV = Chocolate Agar Isovitex), nếu không có thì cấy trên thạch máu (BA) hay thạch nâu (CA), đồng thời làm một phết nhuộm Gram khảo sát trực tiếp. Nếu kết quả nhuộm Gram thấy có vi khuẩn, có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu. Nếu trên phase đặc có vi khuẩn mọc thì tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ ngay. ¦ Sau 5 ngày theo dõi chai cấy máu, phải cấy truyền mù một lần nữa để chắc chắn không có vi khuẩn mọc trong chai cấy máu trước khi trả lời cấy máu âm tính. Các vi khuẩn hay vi nấm thường là tác nhân nhiễm trùng huyết hay nhiễm nấm huyết. ¦ Gram (-) Ư Escherichia Coli Ư Klebsiella spp. Ư Enterobacter spp. Ư Proteus spp. Ư Samonella typhi Ư Samonella (ngoài S. typhi) Ư Pseudomonas aeruginosa Ư Neisseria meningitidis Ư Haemophilus influenzae Ư Bacteroides fragilis Ư Brucella spp Ư Pseudomonas pseudomallei ¦ Gram (+) và nấm men Ư Staphylococcus aureus Ư S. epidermidis Ư S. pyogenes (nhóm A) Ư S. agalactiae (nhóm B) Ư Streptococci tiêu huyết a (viridans) Ư Streptococcus pneumoniae Ư E. faecalis (nhóm D) Ư Listeria monocytogenes Ư Clostridium perfringens Ư Peptococcus spp. Ư Peptostreptococcus spp. Ư Candida albicans và các nấm men khác Vấn đề vi khuẩn ngoại nhiễm. ¦ Các vi khuẩn ngoại nhiễm có thể Từ da: Ư Staphylococcus epidermidis, Ư Propionobacterium acnes, Ư Diphtheroides. Từ môi trường xung quanh: Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 17 Ư Clostridium spp., Ư Acinetobacter spp., Ư Bacillus spp. ¦ Loại trừ được ngoại nhiễm khi kết quả cấy máu cho thấy vi khuẩn: - Cùng phân lập được từ hai chai cấy máu cấy từ một bệnh nhân. - Cùng phân lập được từ một bệnh phẩm khác cũng trên bệnh nhân đó. - Vi khuẩn mọc nhanh (trong vòng 48 giờ). - Các dòng vi khuẩn có cùng type sinh học và đề kháng như nhau với kháng sinh được cấy từ hai chai cấy máu khác nhau trên cùng một bệnh nhân. Trả lời kết quả cấy máu dương tính Tất cả các vi khuẩn mọc được trong chai cấy máu đều phải trả lời cho Bác sĩ điều trị. Tham khảo với Bác sĩ lâm sàng để rút kinh nghiệm trong các trường hợp ngoại nhiễm. Các vi khuẩn nghi là ngoại nhiễm, không cần thiết phải làm kháng sinh đồ và thông báo cho Bác sĩ biết sự nghi ngờ này. Phải thường xuyên thông báo cho bác sĩ lâm sàng biết các kết quả tạm thời bất cứ khi nào thấy có dấu hiệu vi khuẩn mọc bằng các phiếu trả lời kết quả tạm thời. Câu hỏi ôn tập 1. Hãy cho biết khi nào một bệnh nhân cần phải được cấy máu? 2. Cấy máu cho bệnh nhân vào thời điểm nào là tốt nhất? Cần phải cấy bao nhiêu lần? 3. Thể tích máu được cấy là bao nhiêu và tỷ lệ máu được cấy so với môi trường cấy máu nên là bao nhiêu thì tốt? 4. Môi trường cấy máu tốt nhất? Kháng đông bằng gì là tốt nhất và tại sao? 5. Chai môi trường cấy máu thích hợp nhất cho các bệnh viện hiện nay tại Việt Nam là loại nào? Phân tích các ưu khuyết điểm của chai cấy máu này? 6. Hãy cho biết cách theo dõi một chai cấy máu 2 phase trong phòng thí nghiệm? Dấu hiệu nào cho biết chai cấy máu dương tính (có vi khuẩn mọc)? Thời gian theo dõi chai cấy máu cho đến khi trả lời được kết quả cuối cùng là bao lâu? 7. Hãy cho biết các vi khuẩn thường gặp trong cấy máu dương tính? 8. Làm thế nào có thể nhận biết được một cấy máu là dương tính thật sự hay do ngoại nhiễm? Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 18 CẤY MÁU – Các câu hỏi thường gặp Trên thực tế, tỷ lệ cấy máu dương tính tại các bệnh viện rất thấp, có phải là do chỉ định cấy máu quá rộng rãi không? ¦ Thật sự tỷ lệ cấy máu dương tính thấp tại các bệnh viện không phải do chỉ định cấy máu quá rộng rãi mà lại là do lâm sàng ít bao giờ nghĩ đến việc cho chỉ định cấy máu sớm ngay từ đầu. Lâm sàng chỉ cho cấy máu sau khi đã thất bại điều trị kháng sinh và chính chỉ định cấy máu quá hẹp nầy đã làm cho tỷ lệ cấy máu dương tính tại các bệnh viện rất thấp. ¦ Cấy máu là một xét nghiệm vi sinh lâm sàng cần phải thực hiện trước các trường hợp bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ có du khuẩn huyết tạm thời (nhiễm trùng hô hấp cấp...), nhiễm trùng huyết, hay có nguy cơ nhiễm trùng huyết (thương hàn, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng gan mật...). Cấy máu cũng cần phải thực hiện trên các bệnh nhân có các dấu hiệu nhiễm trùng mạch máu hay tim mạch (viêm valve tim cấp tính hay bán cấp, viêm nội mạc mạch máu...). Nói chung chỉ định cấy máu rất rộng rãi, có thể gần như một chỉ định làm công thức bạch cầu trước các bệnh nhân có dấu chứng nhiễm trùng. Thời điểm tốt nhất để cấy máu là khi nào, và nên cấy máu mấy lần? ¦ Tốt nhất là cấy máu trước khi cho bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. Tuy nhiên vẫn phải chỉ định cấy máu trong các trường hợp bệnh nhân đã dùng kháng sinh mà vẫn còn các dấu hiệu nhiễm trùng tiến triển. ¦ Thời điểm cấy máu tốt nhất là lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt hay lúc bệnh nhân rét run. Có thể thực hiện hai lần cấy máu cách nhau 1 giờ tại 2 vị trí lấy máu khác nhau (lần đầu lấy máu tay mặt, lần sau lấy máu tay trái chẳng hạn...) Nên lấy thể tích máu là bao nhiêu để cấy? ¦ Thể tích máu được cấy là 1/10 hay tối đa là 1/5 thể tích môi trường cấy máu. ¦ Người lớn, mỗi lần cấy, lấy 5-10ml máu cho vào chai 50ml môi trường. Trẻ con có thể từ 1ml đến 3ml cho chai 30 đến 50ml môi trường. Phương tiện nào hiện nay là thích hợp nhất cho các bệnh viện để cấy máu? ¦ Phương tiện cấy máu thích hợp nhất cho điều kiện của các phòng thí nghiệm lâm sàng hiện nay là chai cấy máu 2 phase do công ty Nam Khoa sản xuất. Chai cấy máu này có đủ các ưu điểm của một môi trường cấy máu lý tưởng, của phương pháp cấy máu tại giường thuận tiện, của phương pháp theo dõi để phát hiện vi khuẩn rất tiện lợi. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 19 Qui trình theo dõi cấy máu được thực hiện như thế nào? Bao lâu sau thì lâm sàng sẽ có kết quả cấy máu? ¦ Để theo dõi cấy máu, cần phải ủ chai cấy máu trong tủ ấm 35-37oC liên tục trong 5-7 ngày. Sau ngày đầu, phải cấy mù lên hộp thạch CA để phát hiện được các vi khuẩn mọc nhanh và khó thành khúm trên mặt thạch nghiêng của chai cấy máu 2 phase, các ngày sau tráng phase lỏng lên phase đặc để cấy vi khuẩn mọc trong phase đặc lên mặt nghiêng. Bất cứ lúc nào phát hiện được vi khuẩn mọc trong phase lỏng hay trên phase đặc thì phải tiến hành định danh và kháng sinh đồ. Ngày theo dõi cuối cùng, phải cấy mù một lần nữa lên thạch CA để đảm bảo không có vi khuẩn mọc trước khi trả lời kết quả cấy máu âm tính. ¦ Một qui trình cấy máu và theo dõi cấy máu để trả lời kết quả cho lâm sàng tối đa là 7 ngày. Nhiều trường hợp vi khuẩn mọc nhanh, ta có thể có kết quả trong vòng 48 giờ. Vì cấy máu cần phải có thời gian như vậy nên bất cứ lúc nào chúng ta phát hiện có vi khuẩn mọc trên chai cấy máu thì phải trả lời kết quả tạm thời cho lâm sàng trước khi cho kết quả chung cuộc. Làm thế nào nhận biết được một chai cấy máu dương tính là do ngoại nhiễm ¦ Một kết quả cấy máu dương tính do ngoai nhiễm có thể nhận biết được khi: (1) Các vi khuẩn phân lập được là các vi khuẩn hoại sinh như Bacillus subtilis, Bacillus cereus...; (2) Vi khuẩn cấy được trên hai chai cấy máu trên cùng một bệnh nhân trong cùng một thời điểm hay trong hai thời điểm cách nhau 30’ đến 1giờ lại có kết quả khác nhau ¦ Một kết quả cấy máu chắc chắn là dương tính thật sự khi: (1) Vi khuẩn cấy được là vi khuẩn chắc chắn gây bệnh, không thể hoại sinh như: S. typhi, S. pneumoniae, N. meningitidis...; (2) Vi khuẩn mọc rất nhanh, chỉ 24 giờ sau khi cấy; (3) Vi khuẩn cấy được trên hai chai cấy máu trên cùng một bệnh nhân cho kết quả giống nhau; (4) Vi khuẩn từ cấy máu giống hệt vi khuẩn phân lập được từ một nhiễm trùng khác là nguồn gốc gây du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 20 Sản phẩm liên quan: Chai cấy máu HAI PHASE Mô tả ¦ Chai cấy máu HAI PHASE (BIPHASIC) là sản phẩm từ đề tài nghiên cứu cấp bộ của TS. BS. Phạm Hùng Vân. Sản phẩm nầy chỉ dùng một lần (disposable), không dùng lại được. Cấu tạo (xem hình dưới) gồm các thành phần sau: 1. Chai bằng nhựa polystyrene. 2. Nút cao su để chọc kim cấy máu qua, làm bằng cao su trung tính. 3. Nắp vặn bằng nhựa màu đỏ để mở nắp chai cấy máu cấy truyền khi đã có dấu hiệu vi khuẩn mọc trong phase lỏng hay trên bề mặt phase đặc. 4. Nắp che bằng nhựa màu xanh lá để bảo vệ phần nút cao su. 5. Phase đặc là mặt môi trường BHI agar (Difco, Biorad hay Merck). 6. Phase lỏng là BHI lỏng (Difco, Biorad hay Merck) có SPS (Sigma). 7. Vách ngăn phase đặc và phase lỏng. ¦ Chai cấy máu được bọc trong màng co, có ghi lot và ngày sản xuất. Khi chưa dùng, bảo quản trong tối, nhiệt độ phòng thí nghiệm, và có hạn dùng 2 năm kể từ ngày sản xuất. Nếu bảo quản trong tủ lạnh, SPS sẽ bị kết tủa lại, nhưng kết tủa nầy sẽ tan sau khi ủ trong tủ ấm vài giờ. Cách cấy máu ¦ Xé rách màng co, rút nắp che ra khỏi nắp vặn (không vặn nắp). ¦ Sát trùng mặt nút cao su của nắp vặn bằng cồn 70% rồi chờ khô. ¦ Chọc kim cấy qua nút cao su, bơm 3-10ml máu vào phase lỏng. ¦ Đậy nắp che lại. Lắc đều để trộn, tráng qua mặt môi trường phase đặc. Ủ 35-37oC. Các ưu điểm của chai cấy máu hai phase ¦ Tránh ngoại nhiễm nhờ: · Không cần mở nút chai khi cấy máu. · Cấy truyền ngay trong chai cấy máu kín từ phase lỏng qua phase đặc. ¦ Môi trường cấy máu lý tưởng vì: · Chế từ môi trường BHI của Difco, Biorad hay Merck. · Có SPS với các công dụng Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 21 - Kháng đông, nhờ đó vi khuẩn không bị bẫy trong cục máu đông. - Ức chế thực bào. - Ức chế bổ thể. - Ức chế tác động của các kháng sinh Aminoglycosides ¦ Tách rời phase đặc khỏi phase lỏng để: · Nếu trong máu có chất ức chế vi khuẩn (kháng sinh), chất ức chế từ máu hòa vào phase lỏng sẽ sẽ không thấm qua phase đặc. Nhờ vậy vi khuẩn không mọc trong phase lỏng vẫn có thể mọc trong phase đặc. · Làm được kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính. ¦ Tiết kiệm thời gian, có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính bằng cách dùng phase lỏng làm huyền dịch vi khuẩn trải lên mặt thạch Mueller Hinton để làm kháng sinh đồ, đọc kết quả sau 6-8 giờ ủ. 95% các trường hợp này có kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn. Hình 1: Cấu tạo chai cấy máu hai phase Nắp che Nút cao su Nút cao su Phase đặc Chai nhựa Phase lỏng Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 22 Một số điểm cần cân nhắc để lựa chọn chai cấy máu 2 phase hiện đang có mặt trên thị trường việt nam Chai cấy máu 2 phase sản xuất trong nước 1. Công ty sản xuất đạt ISO 9001:2000, WHO-GMP/GLP (UKASS) 2. Kháng đông bằng SPS của Sigma (Mỹ). 3. Môi trường BHI của Merck (Đức), hay Biorad (Mỹ) 4. Thể tích môi trường 50ml tương thích để cấy máu cho cả người lớn (5ml máu) hay con nít (1-3ml) 5. Chai bằng nhựa trong suốt, rất dễ phát hiện khúm vi khuẩn mọc 6. Tách rời phase đặc ra khỏi phase lỏng nên khúm vi khuẩn sẽ dễ mọc và dễ tách rời. 7. Dễ thao tác trong thí nghiệm vì nhẹ, miệng chai rộng dễ cho vòng cấy vào bên trong để lấy dịch cấy cũng như khúm vi khuẩn. 8. Các vi khuẩn khó mọc như H. influenzae hay S. pneumoniae vẫn mọc được dễ dàng. Chai cấy máu 2 phase của Ấn Độ (Hi-Media) 1. Không chắc kháng đông bằng SPS của Sigma (Mỹ). 2. Môi trường BHI của HiMedia (Ấn Độ), kém xa về chất lượng so với BHI của Merck hay Biorad 3. Thể tích môi trường <20ml chỉ tương thích để cấy máu cho con nít (1-2ml). Muốn dùng cấy máu cho người lớn thì phải dùng chai có thể tích môi trường 50ml với giá thành cao hơn. 4. Chai bằng thuỷ tinh dày, khó phát hiện khúm vi khuẩn mọc trên phase đặc và phase lỏng. 5. Không tách rời phase đặc ra khỏi phase lỏng nên khúm vi khuẩn sẽ rất khó mọc trên phase đặc và dễ bị bong khỏi phase đặc khi thao tác. Ngoài ra nếu bệnh nhân đã dùng kháng sinh thì kháng sinh sẽ thấm vào phase đặc và ức chế vi khuẩn mọc trên phase đặc. 6. Rất khó thao tác trong thí nghiệm vì nặng, miệng chai hẹp khó cho vòng cấy vào bên trong để lấy dịch cấy cũng như khúm vi khuẩn 7. Thử nghiệm cho thấy vi khuẩn H. influenzae và S. pneumoniae rất khó mọc trong chai cấy máu này Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 23 Hình 2: Chai cấy máu 2 phase có vi khuẩn mọc (trái) và chai cấy máu 2 phase chưa cấy bệnh phẩm (phải) Hình 3: Chai cấy máu 2 phase nước ngoài dùng môi trường Hi-media của Ấn Độ Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 24 D0 D1 Nếu có dấu hiệu VK mọc Qui trình A Nếu không có dấu hiệu VK mọc Qui trình B Nếu trên phase đặc có khúm vi khuẩn Trên phase đặc không VK mọc Lấy vài giọt môi trường Định danh, kháng sinh đồ Không có VK mọc Qui trình B Có VK mọc Định danh, kháng sinh đồ Kết quả chung cuộc Kết quả chung cuộc Lắc trộn, tráng lên phase đặc Ủ tiếp 37oC, qua đêm Nếu không có dấu hiệu VK mọc Nếu có dấu hiệu VK mọc Qui trình A Tiếp tục đến ngày 7 Kết quả chung cuộc sau 5 ngày: Cấy máu (-) nếu không có VK mọc Cấy máu (+) với KQ định danh và KSĐ Sơ đồ 1: QUI TRÌNH VI SINH LÂM SÀNG CẤY MÁU VỚI CHAI CẤY MÁU HAI PHASE Ủ 37oC Nhuộm Gram CAXV hay BA. Ủ 37oC/CO2 Làm KSĐ trực tiếp từ phase lỏng Nếu có vi khuẩn Nếu không có VK Chờ KQ cấy trên CAXV hay BA Lấy vài giọt môi trường Quan sát chai cấy máu mỗi ngày, cho đến N5. Sau khi quan sát,, lắc trộn - tráng lên phase đặc. Sau đó tiếp tụïc ủ Thực hiện cấy mù Trước khi trả kết quả chung cuộc, thực hiện cấy mù như qui trình B D1 D2 D3-D5 KQ sơ bộ: KSĐ trực tiếp