Tài liệu PCR và giải trình tự

khắc lịch sử cực kỳ quan trọng và đáng nhớ của nhân loại, đánh dấu ngày nhân loại đã có trong tay một bản đồ sinh học cần thiết để bước vào kỷ nguyên mới với nhiều hứa hẹn các thành tựu vĩ c a g g c a t t t c c a g c g g c g g c g g a g c a g c g a g c g g c g g c c a g c a g t g a g g a g a c a g c c c a g c a g t g a g g a g a c a g c c g a g c g g c g g g g c g g c g g a g c a g c a g g c a t t t c c a g c c g a g c g g c g g c g g a g c a g g c a t t t c c a g c a g t g a g g a g a c a g c t g t a c ccgtcaaccggagtta acgttct DNA từ mhiễm sắc thể được phá bung thành nhiều mãnh nhỏ Các mãnh DNA nhỏ được giải trình tự Các mãnh DNA nhỏ được chương trình phân tích tự động tìm các đầu trùng lặp, nhờ đó tái hiện được trình tự của đại phân tử DNA Hình 45: Phương pháp giải trình tự bộ gen người của công ty Celera Genomics: trước hết tách chiết toàn bộ DNA của nhiễm sắc thể tế bào người, sau đó phá tung DNA thành các mảnh nhỏ, giải trình tự tất cả các mảnh nhỏ này, cuối cùng nhờ chương trình vi tính cực mạnh để nối kết các đoạn DAN nhỏ này lại với nhau bằng cách dò tìm các đầu trùng lặp nhờ vậy tái hiện được mạch DNA nguyên thủy 91 đại về sinh y học trong tương lai. Dù thành công của các nhà khoa học giải trình tự được 3.1 tỷ các “ký tự hóa học” làm nên bộ gen người đã được ví như sự kiện lịch sử con người bước lên mặt trăng (ngày 26 tháng 7 năm 1969, từ khoang đổ bộ phi thuyền Apollo, Neil Armstrong bước xuống đi dạo trên mặt trăng và đánh dấu thời điểm con người thực hiện được hoàn toàn ước mơ đã từng ao ước bấy lâu: khắc dấu chân mình trên bề mặt chị Hằng), nhưng đây chưa phải là thời điểm mà con người đã toại nguyện được ước mơ hiểu biết tường tận được bộ gen của mình. Thật sự cho đến thời điểm đó các nhà khoa học ở Công ty Celera Genomic hãy còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen người, tức khoảng 150 triệu, và công việc này đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có thể hoàn tất vì 3% còn lại này nằm trên phần khó giải trình tự nhất. Còn HGP thì thành công ít hơn, hãy còn nhiều đoạn trình tự của bộ gen mà các nhà khoa học của HGP chưa giải được và cũng có nhiều đoạn trình tự đã giải được nhưng họ vẫn chưa sắp xếp vào đúng vị trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa học có giải trình tự được một cách trọn vẹn bộ gen con người, thì cuốn sách của đời sống (the book of life) này hãy còn chưa đọc được, như Gerald Rubin, Phó Giám đốc Nghiên Cứu Y Sinh Học của Viện Y Học Howard Hughes giải thích: “Cuốn sách được viết bằng một ngoại ngữ rất phức tạp, cần phải có một thời gian dài chúng ta mới hiểu được”. Thật vậy, có thể tưởng tượng là nếu các trình tự của bộ gen người được in ra thành sách thì sẽ cần phải khoảng 200 cuốn và mỗi cuốn dày phải 500 trang. Có 3000 trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý nghĩa tức là có gen, mà cho đến hiện nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa học đã đọc được tức là xác định được gen. Hãy còn vài trang (khoảng 3%) chưa viết xong và những trang này là những trang khó viết nhất vì thuộc những vùng khó giải trình tự nhất trong bộ gen người. Cho đến tháng 4 năm 2003, các trang khuyết này đã được các nhà khoa học viết hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra trước mắt các nhà khoa học đó là phải xác định được các trình tự nào là gen và chức năng của các gen này. Chỉ có 3% của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa học cũng chưa biết chính xác là thật sự có bao nhiêu gen trong bộ gen người. Câu trả lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và gần đây nhất có lẽ là đang gần đến con số chính xác hơn, đó là 30.000 gen. Trong khoảng 30.000 gen này, các nhà 92 khoa học hiện chỉ biết được chức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 chưa biết chức năng của chúng. Đây chính là một cuộc đua mới cũng hứa hẹn đầy sôi động vì kết quả từng chặng một của cuộc đua, tức kết quả của việc xác định được chúc năng của từng gen, đều hứa hẹn những áp dụng cực kỳ ngoạn mục và đầy triển vọng trong sinh học cũng như y học. 3. Giải trình tự bộ gene người – cuộc đua chưa kết thúc Gen chính là trình tự các nucleotide trong chuỗi DNA chỉ huy được sự tổng hợp một protein. Chính vì vậy xác định được chức năng của một gen tức là xác định được protein mà gen tổng hợp có cấu trúc như thế nào và có nhiệm vụ gì trong cơ thể sống. Sau kết quả giải trình tự bộ gen người, hiện nay các nhà khoa học đang có nhiều chiến lược để có thể nhanh chóng phát hiện chức năng của các gen trong bộ gen người. Chúng tôi xin trình bày ra đây ba trong số những chiến lược đó. (1) Nhờ kết quả giải trình tự bộ gen người, các nhà khoa học sẽ nhanh chóng xác định các trình tự mang gen. Với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như kỹ thuật PCR, các nhà khoa học sẽ dễ dàng nhân bản các gen này trong ống nghiệm rồi dòng hóa chúng vào các vectơ để sau đó nhờ các hệ tế bào biểu hiện để biểu hiện các protein. Với cách này các nhà khoa học sẽ nhanh chóng thành lập được một thư viện các protein của các gen có trong bộ gen người. Vấn đề tiếp theo là phải xác định các protein trong thư viện protein là có chức năng gì? Để biết được chức năng của protein trong thư viện, các nhà khoa học sẽ thử nghiệm các protein này hệ thống các loại nuôi cấy tế bào để tìm hiểu mối giao tiếp giữa protein thử nghiệm với tế bào đích, Dùng PCR để tổng hợp các gen Clone vào các vector Đưa vào các hệ thống tế bào biểu hiện Lập thư viện protein Thử nghiệm trên các loại tế bào đích Hình 46: Chiến lược tạo thư viện protein để đò tìm chức năng của gen, tóm tắt là từ gen tổng hợp các protein, trữ trong thư viện protein, rồi thử trên các hệ thống tế bào đích để phát hiện chức năng của protein, từ đó biết được chứng năng của gen. 93 nhờ đó xác định tế bào đích nào có phản ứng với protein thử nghiệm, và nhờ vậy sẽ biết được chức năng protein để biết được chức năng của gen. (hình 46). (2) Giải trình tự bộ gen của động vật hữu nhũ như dã nhân (rất giống bộ gen người) hay chuột, đây là những bộ gen của các động vật có nhiều tương đồng với bộ gen người, nhưng lại trên các động vật mà các nhà khoa học rất dễ làm thí nghiệm. Trên bộ gen động vật này, các nhà khoa học sẽ dễ dàng phát hiện các gen, và các chức năng của gen thông qua sự thay đổi hoặc biểu hiện của một tính trạng nào đó của động vật thí nghiệm một khi các nhà nghiên cứu dùng các kỹ thuật sinh học phân tử gây đột biến hay làm knock-out ngay trên những vùng mang gen của bộ gen. Một khi đã xác định được gen và chức năng của một gen trên động vật thí nghiệm, các nhà nghiên cứu sẽ dễ dàng truy tầm và phát hiện gen và chức năng của gen này trên bộ gen người nhờ phát hiện sự tương đồng về trình tự trong gen người với gen của động vật thí nghiệm. (3) Chúng ta biết rằng một protein được tổng hợp từ gen hoạt động như một vai trò cấu trúc hoặc vai trò chức năng là nhờ hình dáng của nó với các hốc nhỏ hay các nếp gấp. Chính vì vậy cho nên dù một gen có được giải mã và biểu hiện được một protein, thì cũng chưa thể xác định được chức năng của protein này nếu chưa biết được các hình dáng của nó. Chính vì vậy mà Viện Quốc Gia Khoa Học Y Khoa Tổng Quát tại Hoa Kỳ đang chi một khoảng 20 triệu đô la để thành lập các trung tâm Proteomics, là các trung tâm chuyên nghiên cứu và lưu trữ các cấu trúc và hình dáng được vi tính hóa (hình 47) của các protein có trong thiên nhiên. Các viện Proteomics như vậy cũng đang và sẽ thành lập tại các nước khác. Các nhà khoa học hy vọng rằng trong vòng 10 năm tới đây, các viện proteomics sẽ lưu trữ được hình dáng của gần 10.000 protein có trong thiên nhiên. Con số này dù hãy còn rất nhỏ so với một số lương khá lớn các protein thực sự có trong thiên nhiên, nhưng các nhà khoa học cũng hy vọng rằng thư viện này đủ sức bao gồm tất cả hình dạng của tất cả các protein có liên quan đến sinh học và y học, vì các protein khác không có trong danh sách cũng chỉ là các biến thể hay Hình 47: Hình dạng của phân tử kháng thể được vi tính hóa 94 các đồng dạng với các protein có trong danh sách mà thôi. Nhờ các trung tâm proteomics và thư viện các hình dạng protein, các nhà nghiên cứu chắc chắn sẽ dễ dàng hơn trong xác định các chức năng của gen. 4. Việt Nam có thể tham gia vào cuộc đua này không? Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu khai phá các bí mật trong cuốn sách đời sống ghi chép đầy đủ trình tự bộ gen người với nhiều triển vọng sẽ có các ứng dụng cách mạng trong sinh học, y học, cũng như các lĩnh vực khoa học khác và sẽ đưa đến nhiều tiến bộ mới cho loài người trong kỷ nguyên mới này. Các nhà y- sinh học của chúng ta hoàn toàn có thể tham gia trong cuộc đua này, vì theo chúng tôi thì sinh học phân tử đối với các quốc gia thu nhập thấp có thể coi như là một ngành khoa học tiểu thủ công nghiệp hiện đại. Tiểu thủ công nghiệp vì không nhất thiết phải có các máy móc cực kỳ hiện đại và tốn kém mà vẫn có thể thực hiện được các kỹ thuật bằng các thiết bị không quá đắt tiền. Hiện đại vì nhà nghiên cứu thực hiện kỹ thuật dựa trên các kiến thức hiện đại với các kết quả hoàn toàn có thể có đóng góp lớn vào kho tàng kiến thức hiện đại của nhân loại. Vấn đề chính là chúng ta phải có chuẩn bị như thế nào và phải có chiến lược tham gia vào cuộc đua như thế nào. Để chuẩn bị, quan trọng nhất là chúng ta phải cố gắng xây dựng và đào tạo trong cũng như ngoài nước đội ngũ các nhà nghiên cứu y sinh học có trình độ và bản lĩnh ngang tầm với thế giới. Các nhà nghiên cứu của chúng ta không chỉ phải có kiến thức và kỹ năng về chuyên môn sinh-y học mà còn phải có khả năng tiếp cận để khai thác được kho tàng kiến thức cũng như các dữ liệu ngày càng cập nhật trên mạng internet. Ngoài ra, chúng ta phải tránh tình trạng đào tạo các nhà nghiên cứu nhưng lại không chuẩn bị cho họ các điều kiện cũng như phương tiện làm việc. Chính vì sự thiếu thốn điều kiện cũng như phương tiện làm việc mà các nhà nghiên cứu của chúng ta dù có trình độ và bản lĩnh đến đâu cũng sẽ thui chột dần nhiệt huyết cũng như khả năng theo thời gian, và dần dần tình trạng chảy máu chất xám trong cũng như ngoài nước sẽ không thể tránh khỏi. Về chiến lược, thì có lẽ chúng ta cũng cố gắng tham gia cuộc đua với những đích nhắm là giải quyết và khai thác những đặc thù trong nước. Chẳn hạn khai thác nghiên cứu cơ chế ở mức độ sinh học phân tử tác động của các dược liệu trong nước bằng cách xây dựng các mô hình thí nghiệm ex-vivo trên các cấy tế bào để phát hiện sự cảm ứng 95 biểu hiện gen khi cho các hệ thống nuôi cấy tế bào này tiếp cận với các trích phân của dược liệu. Phát hiện các cơ chế tác động của dược liệu ở mức độ sinh học phân tử, chắc chắn chúng ta sẽ khai thác được các nguồn dược liệu quí mà chúng ta vốn có sẵn trong nước. Ngoài ra, dân tộc Việt của chúng ta là một dân tộc khá thuần nhất, bên cạnh đó chúng ta cũng có những dân tộc ít người sống rất tập trung và chưa hề bị lai trộn, đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu về sự phân bố các gen cũng như các mã di truyền cho các nghiên cứu ứng dụng sau này để phát hiện, chữa trị hoặc phòng ngừa các bệnh lý di truyền. Nhân loại đang bước vào thiên niên kỷ 21 với hành trang mang theo là các tiến bộ vượt bậc ở nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau, trong đó có khoa học Y học và Sinh học. Một hành trang cần yếu nhất cho một cuộc sống dễ dàng hơn và tốt đẹp hơn là cuốn sách của đời sống với hầu như toàn bộ trình tự của bộ gen người mà các nhà khoa học mới vừa kịp hoàn tất. Việc khai thác cuốn cẩm nang sinh học cần yếu nhất này của nhân loại đòi hỏi một sự hợp tác đa ngành cũng như chuyên ngành. Chính vì vậy nên chúng tôi cho rằng chúng ta cũng không thể bỏ qua yếu tố hợp tác và học hỏi: chúng ta phải hợp tác và học hỏi từ bạn bè quốc tế, và quan trọng nhất là phải biết học hỏi và biết hợp tác giữa chúng ta với nhau. Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek Phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã ứng dụng khá thành công kỹ thuật giải trình tự vào các dịch vụ chẩn đoán và nghiên cứu. Dưới đây xin đưa ra một số thành tựu tiêu biểu. 1. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn Nhờ phát hiện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK16s-F và NK16s-R khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và loài các vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã xây dựng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn. Thành công này đã giúp phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa thực hiện được khá nhiều ứng dụng trong các xét nghiệm dịch vụ và nghiên cứu. 96 a. Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí Vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn chỉ có thể tăng trưởng trong điều kiện khí trường không có oxygene phân tử (O2). Vi khuẩn kị khí có thể là các vi khuẩn có lợi được sử dụng trong công nghệ vi sinh, tuy nhiên về mặt y học rất có nhiều loài vi khuẩn kị khí là các tác nhân nhiễm khuẩn nội sinh hay ngoại sinh. Bệnh lý nhiễm khuẩn kị khí rất đa dạng, từ các nhiễm khuẩn tại chỗ kết hợp với các vi khuẩn không kị khí, hay các nhiễm khuẩn hệ thống, hay các nhiễm khuẩn đặc hiệu. Do đa dạng như vậy nên việc xác định một nhiễm khuẩn kị khí về mặt lâm sàng không phải dễ dàng. Trong khi đó xét nghiệm vi sinh lâm sàng tại các phòng thí nghiệm thường bỏ hẳn xét nghiệm vi khuẩn kị khí vì gặp phải nhiều trở ngại về kỹ thuật như là: (1) Có được phương tiện chuyên chở bệnh phẩm sao cho giữ được bệnh phẩm luôn ở điều kiện kị khí cho đến khi đến được phòng thí nghiệm. (2) Tạo khí trường kị khí để nuôi cấy phân lập được vi khuẩn kị khí từ các bệnh phẩm. (3) Định danh cho được vi khuẩn kị khí. (4) Làm được kháng sinh đồ vi khuẩn kị khí. Trong các trở ngại trên, trở ngại khó giải quyết nhất là vấn đề định danh vi khuẩn kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm. Có nhiều bộ thử nghiệm như API 20A của Bio- Merieux, RapIDTM ANA II của Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA card (Vitek)...có sẵn trên thị trường để cho các phòng thí nghiệm chuyên dùng cho định danh vi khuẩn kị khí. Tuy nhiên các bộ thử nghiệm này khó có sẵn tại Việt Nam vì nhu cầu không nhiều. Hơn nữa các bộ thử nghiệm này cũng có nhiểu hạn chế như tỷ lệ định danh sai khá cao (19% đối với API 20A, 10% đối với RapIDTM ANA II), tỷ lệ không thể định danh đến loài cũng nhiều (38% đối với RapIDTM ANA II, 29% đối với API 20A). Chính vì vậy nên để có thể thực hiện được xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã triển khai một giải pháp toàn diện, bao gồm chế tạo được môi trường chuyên chở CaryBac có thể giữ bệnh phẩm ở điểu kiện kị khí trong thời gian 24 giờ hơn cả thời gian cần thiết để chuyển mẫu từ lâm sàng đến phòng thí nghiệm, sử dụng ổn định phương tiện tạo khí trường kị khí bằng các túi Anaerocult A của Merck, thực hiện được kháng sinh đồ vi khuẩn kị khí bằng bộ thử nghiệm kháng sinh đồ kị khí do đơn vị R&D nghiên cứu và thiết kế ra. Trong định danh vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và 97 đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã đưa ra một tiếp cận hoàn toàn mới và hiện đại, nhưng lại ít tốn kém nhất, đó là giải pháp giải trình tự một đoạn chứa trình tự đặc hiệu giống và loài nằm trong gene 16S của vi khuẩn. Có thể tóm tắt qui trình như sau: Vi khuẩn mọc trên hộp thạch phân lập được gặt vào nước muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun cách thủy sôi trong 10 phút. Để nguội rồi ly tâm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5ml dịch nổi cho vào PCR mix 45ml chứa sẵn các thành phần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase, rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được điện di trên thạch và sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau đó được đưa vào phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi và mồi ngược của PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “DTCS cycle sequencing kit” của Beckman Coulter. Chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 30 chu kỳ 96oC/20”-50oC/20”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được tủa bằng ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000. Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn. Sau này, với các trang bị thêm như điện di bằng DNA chip của Bio-analyzer và máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillary, qui trình của phản ứng giải trình tự và điện di giải trình tự cũng đã được nghiên cứu để tương thích với các trang bị này. Cụ thể là thay vì điện di trên gel rồi định lượng bằng quang phổ 260/280 thì kết hợp cả hai bằng điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip của Agilent; thay vì dùng DTCS để là phản ứng giải trình tự thì dùng “BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit” của ABI với chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự là trước hết 1 chu kỳ 96oC/1’, theo sau 25 chu kỳ 96oC/10”-50oC/5”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự sau khi tủa bằng ethanol, được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL với gel POP 7 và mao quản 50cm. Hình 48 là một kết quả định danh bằng giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu mủ xoang của bệnh nhân. Phòng thí nghiệm NK biotek đã áp dụng tiếp cận này trong năm 2008 cho xét nghiệm 98 Hình 48: Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí với các mẫu bệnh phẩm là 39 mẫu mủ xoang lấy từ bệnh nhân bị viêm xoang mạn tính. Kết quả xét nghiệm cho thấy có 31% (18/59) cấy ra tác nhân vi khuẩn kị khí và kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự 16s rDNA cho thấy có 11% (2/18) Veillonella (cầu khuẩn Gram -), 17% (3/18) Prevotella buccae (trực khuẩn Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là Peptostreptococcus stomatis. Kết quả này cho thấy PCR và giải trình tự 16s rDNA là một giải pháp kỹ thuật hoàn toàn có thể sử dụng để định danh vi khuẩn kị khí, giải quyết được khâu kỹ thuật phức tạp và khó khăn nhất trong qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí. b. Phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản Probiotic chính là các vi sinh vật không gây bệnh, được dùng làm sản phẩm trợ sinh qua đường ăn hay uống sử dụng trên người, gia súc, hay thủy sản để phát huy hiệu quả chống lại các nhiễm trùng nhờ các cơ chế như cạnh tranh chất dinh dưỡng và chổ 99 bám của vi sinh vật gây bệnh, phục hồi vi khuẩn chí bình thường cho ruột hay cho môi trường, kích thích hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể vật chủ chống lại vi sinh vật gây bệnh, hay tiết ra các chất có tính kháng sinh kháng được các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn thường được dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium...và thường được cung cấp dưới dạng bột ghi hàm lượng và các loại vi khuẩn có trong sản phẩm. Do các vi khuẩn này thường là các vi khuẩn dễ mọc nên chỉ với các phương tiện phòng thí nghiệm và các môi trường nuôi cấy thông thường là có thể sản xuất được các sản phẩm probiotic nên hiện nay trên thị trường của chúng ta xuất hiện khá nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ rất nhiều cơ sở trong và ngoài nước để sử dụng không chỉ cho gia súc, thủy sản mà cả cho người. Chính vì tình trạng này nên có một vấn đề mà nhiều người rất quan tâm, đó là liệu chất lượng của các sản phẩm probiotic hiện đang có mặt trong thị trường có thật sự đúng như nhà sản xuất công bố hay không, đặc biệt là liệu các vi khuẩn được ghi trong nhãn hiệu sản phẩm có đúng là vi khuẩn có trong sản phẩm hay không, và hàm lượng có đảm bảo đúng như vậy hay không. Để trả lời câu hỏi trên, trong năm 2008 phòng thí nghiệm NK-Biotek và bộ phận R&D của Nam Khoa đã hướng dẫn một số đề tài tốt nghiệp luận văn Thạc Sĩ có nội dung tìm hiểu chất lượng các sản phẩm probiotic dùng cho người và thủy sản hiện đang lưu thông trên thị trường. Để kiểm tra hàm lượng thì giải pháp kỹ thuật không khó, chỉ cần thực hiện cấy định lượng bằng phương pháp thạch đổ hay phương pháp láng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng và ủ ở điều kiện thích hợp là có thể cho được kết quả định lượng chính xác hàm lượng vi khuẩn đích có trong mẫu sản phẩm cần phải kiểm tra. Tuy nhiên để xác định chính xác tên vi khuẩn có trong sản phẩm có đúng như tên được nêu trong nhãn sản phẩm hay không lại là một vấn đề không đơn giản vì các vi khuẩn probiotic như B. subtilis, L. acidophilus...không phải là các vi khuẩn dễ dàng được định danh đến loài nếu chỉ dựa vào các tính chất sinh vật hóa học. Chính vì vậy, chúng tôi đã giải pháp PCR và giải trình tự gene 16s rDNA của vi khuẩn phân lập được từ các sản phẩm probiotic để xác định danh tính của vi khuẩn. Kết quả cho thấy có khá nhiều loại sản phẩm probiotic sử dụng cho người và cho thủy sản có vấn đề về mặt chất lượng cả về hàm lượng lẫn về vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm. 100 Bảng 13 và 14 trình bày kết quả cho thấy sự khác biệt giữa vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm probiotic so với kết quả được nhà sản xuất công bố trên nhãn. STT Tên sản phẩm Tên vi khuẩn trên nhãn sản phẩm Kết quả PCR và giải trình tự 16sDNA 1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 107/gr Bacillus subtilis 106/gr 2 Bidisubtilis (gói giấy) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr 3 Bidisubtilis (gói nhôm) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 106/gr 4 Bio – Acimin Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr 5 Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 107/gr Bacillus pumilus 107/gr 6 Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 108/gr 7 Subtyl Bacillus subtilis 107/gr Bacillus cereus 107/gr 8 Medilac – Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus cereus 106/gr 9 Bio Baby Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr 10 Bio Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr Bảng 13: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người STT Tên sản phẩm Tên và lượng* vi khuẩn trên nhãn sản phẩm Kết quả định danh và định lượng* thực tế 1 DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bacillus pumilus Không tìm thấyL. acidophilus 2 Bio-DW Bacillus subtilis 109/gr Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis 106/gr Không tìm thấyL. acidophilus 3 Probiotex-one Bacillus subtilis B. megaterium 4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 1011/gr Bacillus subtilis 104/gr 5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 106/gr 6 Novazyme F Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 105/gr 7 Subtyl-LA Bacillus subtilis Bacillus pumilus 8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis 106/gr Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 106/gr 9 ProKura Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 107/gr 10 Men gấu vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus 11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus pumilus 12 Pond clear Bacillus subtilis 1011/gr Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus 13 Bio Pond Bacillus subtilis 108/gr Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus 14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus 15 Microzyme Bacillus subtilis ? Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus 16 Zymmix Lactobacillus acidophilus Acidovorax sp. 17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Clostridium phylofermentant 18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus 109/gr L. acidophilus 106/gr *Chỉ nêu lên lượng các vi khuẩn mà định danh bằng PCR và giải trình tự cho thấy kết quả không sai lệch Bảng 14: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng* các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản 101 Phân tích các dữ kiện trình bày trong hai bảng trên, chúng ta thấy đối với các sản phẩm probiotic dùng cho người, sự sai biệt về hàm lượng giữa kết quả kiểm tra so với công bố trên nhãn không nhiều (không quá 10 lần), nhưng có đến 50% tên vi khuẩn công bố không đúng với kết quả định danh. Thậm chí có đến 4 sản phẩm lại sử dụng B. cereus, vi khuẩn không được phép có mặt trong thực phẩm vì có khả năng gây tiêu chảy và ói mữa do có thể chứa các toxin, làm vi khuẩn trợ sinh. Đối với các sản phẩm probiotic dùng cho thủy sản, kết quả kiểm tra cho thấy đối với vi khuẩn B. subtilis, có 6/15 mẫu không phải là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và chỉ có một sản phẩm là có chứa L. acidophilus còn hầu hết là không tìm thấy vi khuẩn này như công bố trên nhãn. Hình 49 minh họa một kết quả giải trình tự gene 16s rDNA xác định vi khuẩn là B. cereus trong khi nhãn sản phẩm lại là B. subtilis. Còn về mặt hàm lượng thì thật thảm hại, trong các các sản phẩm được kiểm tra thật sự có vi khuẩn như công bố thì đa số hàm lượng tụt giảm từ 104 đến 105 so với công bố. Kết quả của nghiên cứu là một tiếng chuông báo động để các nhà sản xuất cũng như các cơ quan kiểm tra chất Hình 49: Một chủng vi khuẩn phân lập từ một sản phẩm probiotic nếu chi dựa vào tính chất khuẩn lạc và nhuộm Gram thì không thể biết đây không phải là B. subtilis, nhưng khi giải trình tự 16s rDNA thì xác định được đây là B. cereus. 102 lượng nên quan tâm đến vấn đề chất lượng của các sản phẩm probiotic sử dụng cho người và thủy sản hiện đang lưu hành tại Việt Nam; và để kiểm tra được chất lượng các sản phẩm probiotic thì phải sử dụng PCR và giải trình tự gene 16s rDNA vì chỉ có giải pháp này mới có thể định danh chính xác vi khuẩn được sử dụng làm probiotic, tránh nhầm lẫn với các vi khuẩn không có tác dụng probiotic hay thậm chí có thể độc hại. Hình 50: Một phiếu lý lịch 16s rDNA của một chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn với các thông tin về tính chất khuẩn lạc, hình ảnh Gram, các tính chất sinh hóa cơ bản, và quan trọng nhất là trình tự gene 16s rDNA 103 c. Xây dựng lý lịch 16s rDNA của các chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn Trong nội kiểm hay ngoại kiểm vi sinh, rất cần thiết phải dùng các chủng vi sinh có lý lịch định danh chủng chính xác. Các phòng thí nghiệm vi sinh thường yêu cầu cung cấp các chủng quốc tế với lý lịch xuất phát từ nhà cung cấp chủng. Hiện nay rất khó để có thể đạt mua các chủng gốc quốc tế vì vấn đề nguy cơ khủng bố sinh học. Chính vì vậy giải pháp hay nhất hiện nay là sử dụng các chủng gốc quốc tế hiện đang lưu giữ tại các phòng thí nghiệm, thậm chí sử dụng các chủng gốc phân lập được nhưng phải có lý lịch dịnh danh chính xác đến loài. Đứng trước yêu cầu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã xây dựng lý lịch 16s rDNA của tất cả các chủng quốc tế ATCC, cũng như một số chủng phân lập được và tiêu biểu cho các giống và loại vi khuẩn cần cho kiểm chuẩn. Hình 50 minh họa một lý lịch 16s rDNA của 1 chủng vi khuẩn được phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vi R&D của Nam Khoa để cung cấp dùng trong kiểm chuẩn. Hình 51: Một kết quả định danh bằng PCR và giải trình tự 16s rDNA của một chủng vi sinh công nghiệp cho thấy đây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khuẩn rất khó định danh bằng vi sinh kinh điển 104 d. Làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn Cũng với công nghệ PCR và giải trình tự 16s rDNA của vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã và đang thực hiện dịch vụ định danh các vi khuẩn được dùng trong vi sinh công nghiệm cũng như vi sinh nông nghiệm được gửi đến từ các công ty, nhà máy, hay từ các yêu cầu của các đề tài nghiên cứu. Mẫu được gửi đến để định danh có thể là các chủng vi khuẩn cấy trên môi trường nuôi cấy, hay là các dịch tách chiết DNA, hay huyền dịch vi khuẩn. Có thể nói với giải pháp kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16s rDNA, các vi khuẩn dù lạ đến đâu, dù khó định danh đến đâu cũng đều được định danh đến loài. Hình 51 là kết quả một chủng vi khuẩn dùng trong vi sinh công nghiệm được yêu cầu định danh, và kết quả định danh cho thấy đây là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 2. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ là một trở ngại lớn nhất vì nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì không chỉ phân tích hình thái đại thể và vi thể, vốn dĩ phức tạp và công phu, mà còn phải làm cho được các khảo sát sinh vật hóa học khác như đồng hóa đường, phân tích các chất biến dưỡng...Chính vì vậy thông thường ít có phòng thí nghiệm vi sinh làm được xét nghiệm vi nấm. Nhận diện được trở ngại kỹ thuật chính yếu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D công ty Nam Khoa đã cố gắng tìm giải pháp vượt qua, và sau một thời gian nghiên cứu - thử nghiệm, đã xây dựng được một giải pháp kỹ thuật đó là sử dụng PCR và giải trình tự gene 28s rDNA. Nguyên tắc của giải pháp này là sử dụng bộ NKFUNGI-DNAPREP do đơn vị R&D của công ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết DNA toàn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử chứa vi nấm cần định danh, sau đó sử dụng PCR với một cặp mồi được đặt tên là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn DNA dài khoảng 260 bps có chứa các trình tự đặc hiệu giống và loài của vi nấm trên gene 26s rDNA, và sau cùng là giải trình tự trực tiếp và 2 chiều sản phẩm PCR để định danh vi nấm qua blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Ứng dụng giải pháp kỹ thuật này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam khoa đang thực hiện rất thành công hai dịch vụ, đó là: 105 Cand ida orthopsilosis 1 (2%) M alassezia rest rict a 2 (3%) Rhinocladiella at rovirens 3 (5%) Penicit rium cit rinum 3 (5%) X ylaria curta 1 (2%) Schizophyllum cominune 1 (2%) Pichia guilliermondii 1 (2%) Pseudallescheria boydi 4 (7%) A spergillus f lavus 2 (3%) A spergillus oryzae 11 (19%) Aspergillus fumigatus 23 (40%) Aspergillus niger 4 (7%) Neosartorya f ischeri 2 (3%) Biểu đồ 12: Tổng kết các kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 28s rDNA trong các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân a. Phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm lấy ra từ phẫu thuật bệnh nhân viêm xoang Trước đây, các bệnh phẩm bi nấm (fungus ball) thường được các bác sĩ tai mũi họng gửi đến phòng thí nghiệm giải phẩu bệnh và kết quả thường được nhận về sau 1 tuần là nhìn thấy vi thể các sợi tơ nấm nghi Aspergillus. Hiện nay với xét nghiệm PCR và giải trình tự được thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-biotek thì các nhà lâm sàng sẽ có kết quả sau 2 ngày với định danh vi nấm đến loài. Biểu đồ 12 tổng kết các kết quả phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm được bệnh viện Tai Mũi Họng TP.Hồ Chí Minh gửi đến trong thời gian gần đây. Có tổng cộng 58 mẫu được gửi đến làm xét nghiệm, và cả 58 đều phát hiện và định danh được vi nấm là tác nhân gây bệnh. b. Dịch vụ định danh vi nấm Trên cơ sở của kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 28s rDNA, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa triển khai được xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm với các nguồn mẫu là từ các công ty, nhà máy trong lĩnh vực công nông nghiệp, hay là từ các phòng thí nghiệm của các trường đại học hay của các trung tâm nghiên cứu. Có thể nói là cho đến nay, hầu như không có mẫu vi nấm nào gửi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek là không có kết quả định danh. Hình 52 và hình 53 minh họa hai kết quả định danh nấm trong xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm của NK- Biotek. 106 3. Ứng dụng PCR và giải trình tự để phát hiện, định lượng và xác định genotype HCV Phát hiện, định lượng và xác định genotype HCV là các thông số mà bác sĩ cần phải biết trước khi cho chỉ định điều trị đặc hiệu bằng interferon phối hợp với ribavirin là phát đồ điều trị chuẩn cho bệnh nhân có antiHCV [+]. Phát hiện HCV-RNA để xác định là bệnh nhân đang nhiễm HCV, định lượng HCV-RNA là để xác định lượng virus trước khi bắt đầu điều trị và làm cơ sở để theo dõi hiệu quả điều trị, còn xác định genotype HCV là để giúp bác sĩ điều trị quyết định được thời gian điều trị cho bệnh nhân. Thông thường các phòng thí nghiệm lâm sàng sẽ phải thực hiện các yêu cầu này riêng lẽ, nghĩa là họ phải phát hiện HCV-RNA trước, rồi mới định lượng, và cuối cùng Hình 52: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99%. Hình 53: Vi nấm có hình dạng vi thể hình que dài như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Rhinocladiella atrovirens với độ tương đồng 99%. 107 mới định genotype HCV và thường thì do yêu cầu kỹ thuật nên các xét nghiệm này đều phải bắt đầu từ mẫu huyết thanh của bệnh nhân. Công ty Nam Khoa lại sử dụng một tiếp cận khác rất mới mẽ, tiện lợi, và ít tốn kém hơn để phát triển một giải pháp toàn diện thực hiện được các yêu cầu này của bác sĩ cùng một lúc. Đó là giải pháp sử dụng RT real-time PCR để phát hiện và định lượng HCV-RNA trong mẫu huyết thanh bệnh nhân và sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm real-time PCR để xác định genotype HCV bằng cách so chuỗi trình tự giải được với ngân hàng dữ liệu genotype HCV trên thư viện NCBI và thư viện Los Alamos. Để xác định genotype HCV, ngoài lý do là một mắt xích của giải pháp toàn diện như đã nêu ở trên, công ty Nam Khoa chọn tiếp cận giải trình tự vì còn có nhiều lý do: (1) Nếu sử dụng kit InoLIPA của Siemen (Bayer) là kit được các nhà y học thừa nhận thì sẽ là một lựa chọn khá tốn kém vì giá thành của kit này khá cao, kết quả có đôi khi không phân biệt được subtype, và với version cũ thì có sự nhầm lẫn giữa 6a và 1b; (2) Nếu sử dụng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC của HCV bằng hệ thống giải trình tự kín Trugene của Siemen (Bayer) dù rất được nhiều nhà y học thừa nhận, nhưng cũng sẽ là một lựa chọn tốn kém vì giá Yêu cầu xác định genotype HCV Định lượng HCV-RNA bằng xét nghiệm RT-qPCR sử dụng kit NKRT-HCVqPCR Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp trên vùng 5’NC) ABI 3130XL (16 capillaries) CEQ8000 (8 capillaries) KẾT QUẢ 24 giờ sau khi nhận mẫu Định lượng 37.017 copies/ml Kiểu gene 1c Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và giải trình tự vùng 5’NC để phát hiện, định lượng và định genotype HCV 108 Biểu đồ 13: Phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek trong năm 2008 thành của các vật liệu tiêu hao đi kèm theo hệ thống này rất cao; (3) Sử dụng phương pháp real-time PCR với các probe đặc hiệu là một tiếp cận đơn giản và rẻ tiền nhưng không đủ nhạy cảm cho chẩn đoán vì vùng khuếch đại không phải là vùng 5’ NC (là vùng được công nhận là nhạy cảm nhất cho chẩn đoán), không có khả năng phân biệt cao các subtype thường gặp vì khó thiết kế được các probe đặc hiệu đến subtype, và nguy cơ phát hiện chéo không đặc hiệu mà vẫn được lầm tưởng là có khả năng phát hiện đồng nhiễm. Chính vì các lý do trên, Phòng thí Nghiệm Y Khoa NK-BIOTEK và công ty Nam Khoa đã nghiên cứu và xây dựng được phương pháp xét nghiệm xác định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC của HCV nhưng thay vì sử dụng hệ thống giải trình tự kín của Trugene, sử dụng hệ thống giải trình tự mở của ABI (máy ABI 3130XL có 16 mao quản) hay của Beckman Coulter (máy CEQ8000 có 8 mao quản). Tiếp cận này đã mang đến cho bệnh nhân và các nhà lâm sàng nhiều lợi điểm: (1) Nhờ giải trình tự trực tiếp được sản phẩm PCR từ real-time PCR sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC nên kết quả xét nghiệm xác định genotype luôn đi kèm với kết quả định lượng HCV-RNA. Do vậy các nhà lâm sàng trước khi quyết định điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân chỉ cần cho một chỉ định xét nghiệm xác định genotype HCV là đủ mà không cần cho thêm xét nghiệm định lượng. (2) Đạt được độ nhạy cho chẩn đoán nhờ sản phẩm đích để giải trình tự xác định genotype HCV chính là sản phẩm PCR dựa trên vùng đích 5’NC là vùng duy nhất trên genome HCV được thừa nhận là đủ nhạy cảm để làm chẩn đoán xác định và định lượng HCV. (3) Đạt được độ chính xác trong xác định genotype HCV không khác biệt với hệ thống giải trình tự kín Trugene nhờ giải trình tự đúng ngay đoạn đích mà hệ thống Trugene sử dụng trên vùng 5’-NC của genome HCV. (4) Nhà lâm sàng hay nghiên cứu còn được cung cấp thông tin về trình 109 tự vùng 5’NC đã giải được và các thông tin này rất quí giá trong các nghiên cứu về phylogenetic để góp phần trong nghiên cứu nguồn gốc nhiễm trùng hay nghiên cứu đồng nhiễm HIV/HCV. Hình 54 tóm tắt qui trình phát hiện, định lượng và định genotype HCV bằng kỹ thuật RT real-time PCR trên đích là vùng 5’ NC của bộ gene HCV rồi sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định genotype HCV. Trong năm 2008, tổng kết 2000 mẫu xét nghiệm định genotype HCV thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-Biotek, chúng tôi nhận thấy đa số genotype của HCV nhiễm trên bệnh nhân là 1b (58%), kế đó là 6a (17%). Biểu đồ 13 tổng kết sự phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek trong năm 2008. 4. Áp dụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV Hiện nay tại Việt Nam, nhờ các tiến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử định lượng được HBV để làm cơ sở đánh giá hiệu quả điều trị; và phát đồ cũng như các thuốc có khả năng điều trị bệnh viêm gan virus B mạn tính luôn có sẵn trên thị trường để bác sĩ dễ dàng lựa chọn, nên việc điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính đã phổ biến hơn. Tuy nhiên, điều trị đặc hiệu bệnh lý viêm gan virus B mạn tính bằng các thuốc kháng virus là một điều trị lâu dài. Chính vì vậy nên HBV (virus viêm gan B, hepatitis B virus) có cơ hội tiếp xúc lâu dài với các thuốc kháng virus và tạo được các đột biến kháng thuốc, và từ đấy nảy sinh ra yêu cầu phải có xét nghiệm phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV, đặc biệt đối với các thuốc như lamivudine, adefovir và entecavir là các thuốc thường được sử dụng hiện nay. Để phát hiện đầy đủ các đột biến kháng các thuốc nêu trên, nếu chọn tiếp cận real- time PCR hay PCR-RFLP thì chỉ có thể phát hiện được rất ít đột biến kháng thuốc của HBV vì có quá nhiều các biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát hiện đột biến hay thiết kế các vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất nhiều. Hơn nữa cho đến hiện nay, y văn chỉ mới báo cáo có real-time PCR và PCR- RFLP phát hiện đột biến kháng lamivudine ở hai vị trí 180 và 204 trong khi đó còn nhiều đột biến nữa không chỉ tạo cho virus kháng lamivudine, mà cả adefovir và entecavir nữa. Chọn tiếp cận như vậy chắc chắn sẽ không đáp ứng được thực tế. 110 Do vậy phòng thí nghiệm NK- BIOTEK và công ty Nam Khoa đã chọn một tiếp cận khác dựa trên phương tiện và trang thiết bị hiện đại đang có ở công ty, đó chính là tiếp cận PCR và giải trình tự một đoạn DNA dài 550 bps trên vùng gene preS để làm xét nghiệm phát hiện các đột biến kháng Lamivudine, Adefovir và Entecavir. Xét nghiệm dựa trên tiếp cận này hiện nay đang được nhiều nhà lâm sàng và nghiên cứu y học tin cậy nhờ các ưu điểm sau: (1) Phát hiện được hầu hết các vị trí đột biến có thể xảy ra để gây ra kháng 3 loại thuốc trên; (2) Với độ nhạy cảm của thiết bị giải trình tự hiện nay (sequencer ABI 3130XL, giải hai chiều), không chỉ tất cả các điểm đột biến kể trên đều được giải đến, mà cả tình trạng heterozygote của đột biến/hoang dại vẫn được phát hiện; (3) Với trình tự giải được, kết quả xét nghiệm còn cung cấp thông tin một cách chính xác về genotype của HBV mà không cần phải có chỉ định xét nghiệm này từ lâm sàng. Hình 55 mô tả qui trình xét nghiệm PCR và giải trình tự gene preS để phát hiện các đột biến kháng thuốc và xác định genotype HBV, trong đó kết quả phát hiện đột biến được trình bày trong một bảng liệt kê các vị trí đột biến đột biến kháng Yêu cầu tìm đột biến kháng thuốc của HBV PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 550bps trên vùng gene preS của HBV Tìm đột biến kháng thuốc: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 550bps từ vùng gene preS ABI 3130XL (16 capillaries) KEÁT QUAÛ (24 giôø sau khi nhaän maãu) Genotype Genotype C Phát hiện đột biến TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATC AACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGG AAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA GTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAAC ATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT Kháng Lamivudine KQ Kháng Adefovir KQ Kháng Entecavir KQ I169T K L80V/I K T184G K V173L K S85A K S202I K L180M Coù V84M K M250V K A181T K A181V/T K T184S K V214A K M204I Coù Q215S K V207M/I K N236T K Q215S K Hình 55: Qui trình xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc và xác định genotype của HBV bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự một đọan DNA 550 bps trên gene PreS của HBV 111 lamivudine, adefovir và entecavir đã được các nhà nghiên cứu ghi nhận và tất cả các vị trí đột biến này đều nằm trong trình tự được giải. Trong năm 2008, phòng thí nghiệm NK-Biotek của công ty Nam Khoa đã thực hiện được 455 xét nghiệm PCR và giải trình tự vùng gene PreS của HBV, kết quả cho thấy có đến 69% các trường hợp là thuộc genotype B và 31% là genotype C, không có các genotype khác. Có 46% phát hiện có đột biến kháng lamivudine với 30% ở vị trí 204, 9% ở hai vị trí 204 và 207, 6.5% ở 204 và 180, và 0.5% đột biến cả 204, 180 và 207. Kết quả này được trình bày trong biểu đồ 14. 5. Áp dụng PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype HBV Trong quá trình phản ứng với các đáp ứng miễn dịch từ bệnh nhân, HBV có thể bị đột biến precore và đột biến core promoter. Đột biến precore là đột biến tại vị trí nucleotide 1896 từ G thành A (G1896A) làm cho codon TGG trở thành TAG là một stop codon. Đột biến này đã làm cho HBV không thể tổng hợp được HBeAg. Do vậy, khi thử máu bệnh nhân, không phát hiện được HBeAg mà HBV-DNA vẫn tồn lại cùng với HBeAb [+]. Đây là một đột biến rất quan trọng cần phải được phát hiện vì bệnh nhân sẽ có nguy cơ cao vào xơ gan hay ung thư gan, đặc biệt khi phát hiện được thêm đột biến core promoter tại hai vị trí nucleotide 1762 và 1764 (A1762T, G1764A). Khi bệnh nhân bị phát hiện mang HBV có các đột biến này thì phải được điều trị bằng thuốc kháng virus suốt đời. Chính vì tầm quan trọng đối với lâm sàng như vậy nên trong thời gian qua phòng thí nghiệm NK-BIOTEK & công ty Nam Khoa đã xây dựng được kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng gene core để làm xét nghiệm phát hiện đột biến precore và đột biến core promoter và không chỉ vậy, còn cho biết thêm về genotype HBV. Hình 56 minh họa qui trình này. Xét nghiệm này hiện nay đang được nhiều nhà lâm sàng và nghiên cứu y học quan tâm và tin cậy. Trong năm 2008, phòng thí nghiệm NK-Biotek và công ty Nam Khoa 29.89 8.79 6.59 0.45 54.28 0 10 20 30 40 50 60 204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB Biểu đồ 14: Sự phân bố tỷ lệ các vị trí đột biến kháng lamivudine phát hiện được 112 đã thực hiện 134 mẫu xét nghiệm đột biến precore và core promoter của HBV trên các bệnh nhân bị bác sĩ điều trị nghi ngờ có đột biến precore/core promoter. Kết quả cho thấy có đến 73% phát hiện đột biến với nhiều kiểu đột biến khác nhau, có thể chỉ đột biến precore, có thể chỉ đột biến core promoter, có thể đột biến cả promoter và core promoter. Các thông tin này sẽ rất hữu dụng để các nhà y học có thể nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ với lâm sàng, bệnh học và sinh bệnh học. Biểu đồ 15 trình bày tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến phát hiện được. 6. PCR và giải trình tự phát hiện đột biến kháng rifampicine và INH của M. tuberculosis Từ năm 1996, chúng tôi đã bắt đầu triển khai kỹ thuật PCR phát hiện M. tuberculosis và cho đến hiện nay xét nghiệm PCR phát hiện M. tuberculosis do chúng tôi phát triển này đã được các nhà y học trong nước chấp nhận nhờ độ nhạy cảm rất cao so với khảo sát trực tiếp và nuôi cấy. Với PCR, kết quả phát hiện M. tuberculosis có thể đến tay nhà lâm sàng chỉ 24 giờ sau khi gửi mẫu đi xét nghiệm. Nhờ ưu điểm nhanh chóng và nhạy cảm nên có thể nói công cụ PCR đã mang đến một lợi ích không Yêu cầu tìm đột biến precore/promoter của HBV PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 250bps trên vùng gene core của HBV Tìm đột biến precore/promoter: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 250bps từ vùng gene core ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries) KẾT QUẢ (24 giờ sau khi nhận mẫu) Bệnh nhân có HBeAg- HBeAb+, HBVDNA+, ALT ­¯ bất thường Hình 56: Qui trình PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/promoter 36 26% 38 28% 28 20% 27 19% 2 1% 9 6% G1896A A1762T, G1764A G1896A A1762T, G1764A Không đột biến A1762T G1896A A1762T Biểu đồ 15: Tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến precore/core promoter phát hiện được trong 134 mẫu xét nghiệm 113 chối cãi trong lĩnh vực chẩn đoán lao, vượt qua các công cụ vi sinh kinh điển. Một vấn đề hiện nay đang được các nhà y học quan tâm là làm thế nào có thể có được kết quả kháng sinh đồ vi khuẩn M. tuberculosis với thời gian ngắn hơn, vì với phương pháp vi sinh kinh điển thì kết quả kháng sinh đồ chỉ có thể có được sau hơn 2 tháng với 1 tháng để có được vi khuẩn mọc được trên môi trường nuôi cấy và 1 tháng để có kết quả kháng sinh đồ. Thông tin về kháng sinh đồ mà bác sĩ cần biết nhất là liệu vi khuẩn phân lập trên bệnh nhân có đề kháng với thuốc kháng lao rifampicin, được coi là hiệu quả nhất cho đến hiện nay hay không để có thể tiếp tục duy trì hay chỉ định cho bệnh nhân công thức kháng lao có rifampicine. Trước thực tế đòi hỏi này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D công ty Nam 405 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG Pro CCG Leu CTA Val GTC /..../ Dele Leu TTG Tyr TAC Asp GAC Gln CAG Asn AAC Arg CGC Pro CCC Leu TTG Gln CAG Trp TGG Pro CCG (3%) (3%) (9%) (1%) (1%) (1%) (28%) (52%) Hình 57: Vùng nóng với các đột biến trên rpoB gene và tỷ lệ thường xãy ra Yêu cầu PCR phát hiện MTB Tìm đột biến kháng Rifampicine và INH PCR phát hiện MTB dựa trên khuếch đại trình tự 249bp trên IS6110 PCR khuếch đại trình tự đặc hiệu chứa các đột biến trên rpoB, katG, và inhA Kết quả phát hiện MTB trong vòng 24giờ Giải trình tự phát hiện đột biến rpoB, katG và inhA Đột biến rpoB L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V Đột biến katG S315T Đột biến inhA C-15T Kết quả kháng sinh đồ MTB 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm Hình 58: Mô tả qui trình PCR và giải trình tự để phát hiện các đột biến kháng rifampicin và INH của vi khuẩn M. tuberculosis trực tiếp từ mẫu đàm mà không phải qua nuôi cấy. Kết quả đến tay các nhà lâm sàng chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm 114 Khoa đã nghiên cứu và thử nghiệm một qui trình PCR và giải trình tự để khuếch đại một vùng nóng của gene rpoB của M. tuberculosis để có thể phát hiện được tất cả các đột biến thường xảy ra tạo cho vi khuẩn kháng được rifampicine (hình 57). Ngoài vùng nóng này, chúng tôi cũng đã thành công trong xây dựng một qui trình phát hiện đề kháng INH bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gene katG để phát hiện vị trí đột biến thường gặp là S315T và gene inhA để xác định vị trí đột biến C-15T. Hiện nay qui trình này đã được chúng tôi áp dụng để phát hiện trực tiếp các đột biến kháng thuốc này từ bệnh phẩm mà không cần thiết phải qua nuôi cấy. Hình 58 minh họa tóm tắt qui trình được phòng thí nghiệm NK-Biotek thực hiện để phát hiện MTB và cho luôn kết quả kháng sinh đồ chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm từ bệnh nhân. Hiện nay chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu để có thể có thêm các kết quả kháng sinh đồ phát hiện các đột biến kháng các thuốc kháng lao khác như ethambutol, PAS, PZA, Ofloxacin...để có thể đáp ứng được một cách đầy đủ các yêu cầu đến từ các nhà lâm sàng trong cuộc chiến đấu chống lại tình hình lao đa kháng ngày càng trầm trọng hiện nay.