Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng qui trình elisa phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus Aureus

TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT NHÓM A CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS Nguyễn Đỗ Phúc1, Nguyễn Thị Kê1, Trần Linh Thước2 và Cs TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ngộ độc thực phẩm hiện nay liên quan nhiều rất sự ô nhiễm Staphylococcus aureus và độc tố của chúng gây ra trong những năm gần đây. Do đó thiết lập qui trình ELISA để phát hiện độc tố là một nhu cầu cần thiết hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu: Tạo kháng thể đa dòng và khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình ELISA sandwich xây dựng bộ kít phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ thu nhận kháng thể, kỹ thuật tinh chế kháng thể và cộng hợp kháng thể để làm nguyên vật liệu cho nghiên cứu qui trình kỹ thuật ELISA sandwich phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu: Kháng thể sau khi gây miễn dịch trên thỏ được tinh chế và thu được 700µl, với nồng độ 16860 µg/ml. Kháng thể này được cộng hợp với enzym HRP, và sử dụng để thực hiện quy trình ELISA sandwich với độ pha loãng là 3.200 lần trong PBS buffer. Các thông số của qui trình ELISA sandwich đối với độc tố ruột nhóm A là: - Quá trình phủ giếng + Dung dịch phủ giếng là Carbonate buffer pH 9,5. + Nồng độ kháng thể kháng độc tố A phủ giếng là 5 µg/ ml. + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. - Quá trình khóa giếng. + Khóa giếng bằng sữa gầy 1%. + Ủ ở 4oC trong 30 phút. - Quá trình ủ với độc tố + Độc tố được pha loãng trong PBS buffer. + Ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Quá trình ủ với kháng thể thứ cấp. + Kháng thể đánh dấu HRP được pha loãng 1/3.200 trong PBS buffer. + Ủ ở 25oC trong 1 giờ. - Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng dung dịch phát màu 2,2’-azino-di (3- ethyl-benzonthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) ở bước sóng 405nm. - Đánh giá các thông số kỹ thuật của phương pháp mới so với phương pháp tham chiếu với kết quả: độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 93%, tỷ lệ âm tính giả 0%, tỷ lệ dương tính giả 6,25% và độ tương đồng của thử nghiệm là 95,5% Kết luận: Bộ kit có thể dùng để phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus.. ABSTRACT PRODUCTION OF POLYCLONAL ANTIBODIES AND SET UP THE ELISA PROCEDURE TO DETECT STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN A Nguyen Do Phuc, Trần Linh Thước, et al * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 272 - 277 Background: Enterotoxins produced by Staphylococcus aureus are responsible for staphylococcal food – poisoning outbreaks in recently. Establishing the ELISA procedure is needed to detect staphylococcal enterotoxin A in controlling poisoning outbreaks in Viet Nam. Objectives: Production polyclonal antibodies and surveying the technical parameters of the sandwich ELISA procedure to detect staphylococcal enterotoxin A. Method: Antiserum to staphylococcal enterotoxin A (SEA) is colected from immunized rabbit and purification of polyclonal IgG antibodies from this serum by using a staphylococcal protein A column. This 1. Viện Vệ sinh - Y tế Công Cộng thành phố Hồ Chí Minh 2. Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh purified antibodies is used for sandwich ELISA procedure. Results: Polyclonal antibody after immunization in Rabbit was purified with antibody titer 16860 µg/ml (700µl). The antibody was conjugated with HRP enzyme Which used for surveying the technical parameters of ELISA procedure with results following: Coating plate + Coating solution is Carbonate buffer pH 9.5. + Antibody titer coating is 5 µg/ ml. + Room temperature in 3 h. - Bloking plate Bloking solution is skim milk 1% + Keep at 4oC in 30 minutes. - Incubation with enterotoxin + Room temperature in 2 h. - Incubation with HRP-antibody + HRP-antibody was diluted 1/3,200 in PBS buffer. + Keep at 25oC in 1 h. - Read result: at λ= 405nm with ABTS. - When compared to the reference method, the criteria of new mehtod meet: sensitivity 100%, specificity 93%, false negative 0%, false positive 6.25% and test Efficacy 95.5%. Conclusion: ELISA kit can use to detect staphylococcal enterotoxin A. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong các chỉ tiêu về vi sinh thực phẩm, Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn thường gây ra ô nhiễm thực phẩm và là nguyên nhân của những vụ ngộ độc thực phẩm. Ðể có thể kết luận nguyên nhân vụ ngộ độc do Staphylococcus aureus bên cạnh việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn, cần phải xác định sự hiện diện của độc tố ruột mới là nguyên nhân chính, đến nay vẫn chưa được triển khai áp dụng. Chính vì điều đó chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu qui trình sản xuất và tinh tế kháng thể đa dòng được gây miễn dịch trên thỏ nhằm tạo các nguyên vật liệu ban đầu để khảo sát và hòan thiện các thông số của qui trình ELISA dùng để phát hiện độc tố ruột nhóm A và nhằm góp phần trong công tác kiểm tra, giám sát ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột (enterotoxin) của Staphylococcus aureus gây ra Mục tiêu nghiên cứu - Gây đáp ứng miễn dịch độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus trên thỏ. - Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng độc tố ruột nhóm A trước và sau khi gây miễn dịch. - Tinh chế và kiểm tra nồng độ kháng thể. - Cộng hợp kháng thể và kiểm tra phản ứng chéo của kháng thể kháng độc tố A. - Khảo sát các thông số kỹ thuật của quy trình ELISA sandwich phát hiện độc tố ruột nhóm A. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu(3) - Thỏ 2 - 3 kg (Viện Pasteur cung cấp). - Độc tố Staphylococcal enterotoxin A, nồng độ 0,5 mg/ml - Hóa chất gây miễn dịch thỏ: Tá chất CFA và IFA - Sigma USA - Hóa chất dùng cho thử nghiệm khuếch tán trên gel: Gel agarose 1,5% - Thuốc nhuộm gel và thuốc giải nhuộm gel - Hóa chất dùng cho tinh chế kháng thể: Amonium sulfate bão hòa (SAS), Wash buffer 1X, dung dịch PBS 1X, dung dịch PBS 5X, dung dịch elution, Tris-HCl 1 M pH 9,0, Ethanol tuyệt đối 20% - Hóa chất dùng cho SDS-PAGE: Gel polyacrylamide, dung dịch nạp mẫu (Sample buffer) 5X, dung dịch điện di protein 5X. - Hóa chất dùng cho đánh dấu kháng thể: Glutaraldehyde (GA) 0,1%, dung dịch đệm carbonate, dung dịch đệm photphate, NaCl 0,9%, lysine 1M pH 7, glycerol 20% - Hóa chất cho ELISA: + Dung dịch phủ giếng: PBS pH 7,2, Carbonate pH 7, Carbonate pH 9,5 + Dung dịch dùng khóa giếng: Sữa gầy 5% và 1%, Gelatin 1% và 0,5%, Casein 1% và 0,5% + Dung dịch rửa (Wash buffer): + Dung dịch ABTS: Pha 40 mg ABTS trong 100 ml phosphate - citrate buffer 100 mM, pH 4,0. Trước khi sử dụng cho thêm H2O2 với nồng độ 0,003%. + Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution): H2SO4 2N - Thang phân tử lượng thấp (Low Molecular Weigh – LMW). Hình 2.1. Thang phân tử lượng thấp Phương pháp nghiên cứu Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ(3). Đối tượng Thỏ 2 - 3 kg, biết rõ nguồn gốc, sạch bệnh được sử dụng cho các thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch. Trước khi gây miễn dịch cần thu máu nền để xác định thỏ đã có kháng thể kháng độc tố SEA hay chưa. Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ Thỏ 2-3 kg Miễn dịch lần 1 Tiêm dưới da, liều tiêm 150 ng SE (mỗi loại) /100 µl PBS+10 µg tá chất Freund hoàn toàn (CFA) Miễn dịch lần 2 Sau 4 tuần, tiêm bắp, liều tiêm 150 ng SE (mỗi loại) /100 µl PBS+10 µg tá chất Freund không hoàn toàn (IFA) Miễn dịch lần 3 Sau 2 tuần, tiêm dưới da, liều tiêm 200 ng SE/100 µlPBS Lấy máu tách huyết tương Máu ủ 37oC/30 phút, ly tâm 3.000 v/15phút Lấy huyết thanh sau khi kiểm tra hiệu giá kháng thể nếu nồng độ huyết thanh pha loãng đạt 1/4 ngưng kết với độc tố ruột A 2 µg/ml là đạt yêu cầu và tiến hành lấy máu để tinh chế và bảo quản -30 oC, có bổ sung thêm 0,02% natri azid. - Kiểm tra hiệu giá huyết thanh kháng độc tố ruột A sau miễn dịch: bằng phương pháp khuếch tán trên gel. - Tinh chế kháng thể: bằng phương pháp sắc ký ái lực qua cột protein A(2,6). - Kiểm tra độ tinh sạch kháng thể bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE (các mẫu kiểm bao gồm: mẫu thu được trước khi cột protein A, đang qua cột, nước rửa wash, elute). - Xác định nồng độ kháng thể sau khi tinh chế bằng phương pháp đo Bradford. - Đánh dấu kháng thể: với enzyme HRP - Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình ELISA sandwich(5,0). Khảo sát dung dịch đệm dùng để phủ giếng tối ưu: dùng kháng thể A với nồng độ 20 µg/ml trong các dung dịch khảo sát như PBS pH 7,2; Carbonate buffer pH 7,2; Tris pH 8,5; Carbonate buffer pH 9,5 để phủ giếng và lựa chọn dung dịch phủ giếng tối ưu. Khảo sát tác chất khóa giếng tối ưu: sử dụng các tác chất khóa giếng khác nhau bao gồm sữa gầy 1%, 5%, Casein 0,5%, 1% và Gelatin 0,5% và 1% để khóa giếng, lựa chọn tác chất tối ưu. Khảo sát nồng độ kháng thể A thích hợp để cố định lên giếng: kháng thể A được pha loãng lần lượt với các nồng độ 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 1 µg/ml trong dung dịch phủ giếng đã chọn với các thể tích 100 µl, chọn nồng độ kháng thể tối ưu để gắn vào giếng. Khảo sát thời gian kháng thể phủ giếng tối ưu: ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 giờ, 2 giờ và ủ ở 4oC qua đêm; chọn thời gian kháng thể ủ tối ưu. Khảo sát thời gian ủ với kháng nguyên (độc tố): khảo sát thời gian ủ của kháng nguyên để gắn lên kháng thể là 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ; chọn thời gian ủ tối ưu. Khảo sát thời gian ủ với kháng thể thứ cấp (kháng thể gắn với enzyme HRP): khảo sát ba thời gian ủ là 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút; chọn được thời gian ủ kháng thể thứ cấp tối ưu. Cách tính kết quả của phản ứng: Nếu OD > 0,2: kết quả dương tính Nếu OD ≤ 0,2 kết quả âm tính - Đánh giá các thông số qui trình ELISA sandwich (sử dụng bộ kit nước ngoài: hảng Tecra làm phương pháp tham chiếu)(1,4). Các thông số kỹ thuật khi so sánh với phương pháp tham chiếu phải bằng hoặc lớn hơn các chỉ số sau: độ nhạy (Se) ≥98%, độ đặc hiệu (Sp) ≥90,4%, độ phù hợp của phương pháp (TE) ≥94%,, tỷ lệ dương tính giả (FP)<9,6%, tỷ lệ âm tính giả (FN)<2%. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết quả hiệu giá kháng thể sau miễn dịch Bảng 1. Hiệu giá kháng thể kháng độc tố ruột A được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên gel (với độc tố A nồng độ 2 µg/ml) Hiệu giá kháng thể (-) không xuất hiện đường tủa; (+) xuất hiện đường tủa Thời gian lấy máu 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 máu nền - - - - - - 2 tuần + + - - - - 4 tuần + + + + + - 5 tuần + + + + + + Hình 1. Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh A với độc tố A trước khi gây miễn dịch (pre A) và sau 2, 4, 5 tuần sau khi gây miễn dịch Nhận xét: - Kết quả phản ứng của máu nền với độc tố A cho ta thấy không có xuất hiện đường tủa, điều đó chứng tỏ rằng thỏ chưa bị phơi nhiễm với độc tố ruột nhóm A. - Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch với độc tố A sau 5 tuần ta thấy đã xuất hiện đường tủa giữa kháng nguyên (độc tố ruột nhóm A) và huyết thanh pha loãng ở nồng độ 1/32. Như vậy sau 5 tuần thì nồng độ kháng thể A đã đạt yêu cầu (huyết thanh pha loãng lớn hơn 1/4 khi ngưng kết với 2 µg/ml độc tố ruột nhóm A) và có thể tiến hành lấy máu thỏ để tinh chế kháng thể. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể A sau khi tinh chế Kháng thể thu nhận được từ bước tủa phân đoạn bằng amonium sulfate bão hòa, tiến hành loại muối và tinh chế qua cột protein A được kiểm tra bằng SDS - PAGE nhằm kiểm tra ái lực của protein A đối với kháng thể cũng như độ tinh sạch của kháng thể sau khi tinh chế. Kết quả được trình bày trong hình sau: Hình 2. Kết quả điện di SDS-PAGE kháng thể kháng độc tố A Giếng 1: thang protein chuẩn Giếng 2: mẫu sau khi tủa phân đọan bằng amonisulfate bão hòa (qua cột PD10) Giếng 3: mẫu đang qua cột Giếng 4: mẫu nước rửa sau khi kháng thể gắn lên cột. Giếng 5: mẫu sau khi tinh chế. Nhận xét: - Kháng thể kháng độc tố A thu nhận được ở bước tủa phân đoạn bằng amonisulfate bão hòa vẫn còn rất nhiều protein tạp trong kháng huyết thanh (giếng 2). - Kháng thể kháng độc tố A sau khi hấp thụ bởi cột không thấy xuất hiện vạch 54 kDa và 27 kDa (kích thước chuỗi nặng, chỗi nhẹ của kháng thể) chứng tỏ toàn bộ kháng thể đã được hấp thu bởi cột protein A (giếng 3). - Kháng thể kháng độc tố A sau khi tinh chế qua cột protein A đã loại bỏ hầu như hoàn toàn các protein không mong muốn (giếng 4). - Khi có sự hiện diện của β – mercaptoethanol (β – MeSH) kháng thể tách thành hai vạch: một chuỗi nặng, một chuỗi nhẹ có kích thước tương ứng là ~ 54 kDa và ~ 27 kDa (giếng 5). Nồng độ kháng thể A sau tinh chế được đo bằng phương pháp Bradford có nồng độ 16.860 µg/ml, số lượng 700 µl. Kết quả khảo sát các thông số kỹ thuật qui trình ELISA sandwich Kết quả khảo sát các thông số qui trình ELISA sandwich - Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật liên quan để thiết lập qui trình ELISA sandwich đối với độc tố ruột nhóm A là: Quá trình phủ giếng + Dung dịch phủ giếng là Carbonate buffer pH 9,5. + Nồng độ kháng thể kháng độc tố A phủ giếng là 5 µg/ ml. + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Quá trình khóa giếng + Khóa giếng bằng sữa gầy 1% ~ 54 kDa ~ 27 kDa kDa 97,0 66,0 45,0 30,0 20,1 14,4 1 2 3 4 5 + Ủ ở 4oC trong 30 phút. Quá trình ủ với độc tố + Độc tố được pha loãng trong PBS buffer. + Ủ ở 37oC trong 2 giờ. Quá trình ủ với kháng thể thứ cấp + Kháng thể đánh dấu HRP được pha loãng 1/3.200 trong PBS buffer. + Ủ ở 25oC trong 1 giờ. Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng dung dịch ABTS ở bước sóng λ=405nm. Hình 3. Kết quả đo OD Đánh giá các thông số qui trình ELISA. Bảng 2. Kết quả phân tích 4 nhóm mẫu thực phẩm, với 45 lần thử nghiệm phát hiện độc tố ruột nhóm A của hai bộ kít ELISA Tecra và bộ kit tự sản xuất Bộ kít tham chiếu Tecra(+) Tecra(-) SEA(+) 13/13 2/0 Bộ kít phát hiện độc tố nhóm A SEA(-) 0/0 30/30 Độ phù hợp của thử nghiệm (TE%) 95,5% Độ khác biệt giữa hai phương pháp (t) 1,14 Qua bảng 2. cho thấy, kết quả tương đồng (+) của hai phương pháp là 13/13, chiếm tỷ lệ 100%., kết quả tương đồng (-): 33/33/, chiếm tỷ lệ 100% và kết quả không tương đồng Kit SEA (+) và Tecra A (-): 2/0 mẫu. Như vậy bột kít SEA phát hiện độc tố ruột nhóm A cho kết quả tương đồng với kít của Tecra là 43/45 mẫu, độ phù hợp của thử nghiệm là 95,5%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 1,14 (<3,84), chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả giữa hai phương pháp ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A. Căn cứ kết quả phân tích ở bảng 2 ta có thể đánh giá các thông số của bột kít ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả đánh giá qui trình ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A Chỉ số Các thông số qui trình ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A Tiêu chuẩn các thông số cần đánh giá Độ nhạy-SE (%) 100% ≥ 98% Độ đặc hiệu-SP (%) 93% ≥ 90,4% Tỷ lệ âm tính giả- FN(%) 0% < 2% Tỷ lệ dương tính giả- PN(%) 6,25% < 9,6% KẾT LUẬN - Đã thành công trong việc gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ với độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus và thu nhận kháng huyết thanh đặc hiệu, kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng độc tố ruột nhóm A với nồng độ pha loãng kháng thể 1/32 ngưng kết với độc tố A nồng độ 2 µg/ml bằng phương pháp khuếch tán trên gel. - Đã tinh chế thành công kháng thể kháng độc tố ruột nhóm A từ kháng huyết thanh thu nhận được từ thỏ là khoảng 700 µl với nồng độ khoảng 16860 µg/ml. Như vậy lượng kháng thể kháng độc tố A là khoảng 11 mg. - Đã cộng hợp thành công kháng thể kháng độc tố ruột nhóm A với enzym HRP, số lượng là khoảng 200 µl và dùng để thực hiện quy trình ELISA sandwich với độ pha loãng là 3.200 lần trong PBS buffer. - Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật liên quan để thiết lập qui trình ELISA sandwich đối với độc tố ruột nhóm A với kết quả Độ nhạy : 100% Độ đặc hiệu : 93% Tỷ lệ dương tính giả : 0% Tỷ lệ âm tính giả : 6,25% Độ phù hợp của thử nghiệm: 95,5% KIếN NGHị Tiếp tục nghiên cứu và thiết lập các thông số kỹ thuật của qui trình ELISA dùng để phát hiện các độc tố nhóm B, C, D và E trên cơ sở các số liệu của nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ngô Như Hòa, (1982), Thống kê trong nghiên cứu Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Antibody purification, Handbook, Amersham Biosciences. 3. Burns, R. (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol 295, 3rd ed, Humana Press. 4. Development of methods (2005), Procedure of the development and management of food microbiological methods, SirFrederick G. Banting Research Center, Ottawa, Ontario, K1A0L2, CANADA. 5. Kemeny D.M., and SChallacombe S.J., (1988), ELISA and Other Solid Phase Immunoassays Theoretical and Practical Aspects, United Medical and Dental Schools of Guy’ s and St Thomas’s Hospitals London SE1 9RT UK. 6. Tereza Cristina R.M. de Oliveira; Elisa Yoko Hirooka, (1999), Low cost production and purification of polyclonal antibodies to staphyloccal enterotoxin A. Tijssen, (1985), Practice and theory of enzyme immunoassays, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology 4th. 15: 242 – 246.