Thành phần và tác dụng xua muỗi Aedes Aegypti của tinh dầu lá khuynh diệp

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  261 THÀNH PHẦN VÀ TÁC DỤNG XUA MUỖI AEDES AEGYPTI  CỦA TINH DẦU LÁ KHUYNH DIỆP  Huỳnh Kha Thảo Hiền*, Dương Phước An**, Lê Thành Đồng*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Sử dụng các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật và thân thiện với môi trường trong  công tác phòng chống vector truyền bệnh đã và đang nhận được sự quan tâm rất lớn, đặc biệt là các chất  xua côn trùng. Các chất xua côn trùng đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm sự tiếp xúc của vector  truyền bệnh với con người. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các chất xua côn trùng có nguồn gốc từ  thực vật vì chúng có mùi hương đặc trưng, dễ chịu, không gây độc qua đường tiếp xúc và dễ dàng phân hủy  trong môi trường tự nhiên.   Mục tiêu: Khảo sát thành phần và đánh giá tác dụng xua muỗi Aedes aegypti của tinh dầu chiết từ lá  khuynh diệp.  Phương pháp nghiên cứu: Chưng cất tinh dầu bằng phương pháp cất lôi cuốn theo hơi nước. Thành  phần hóa học của mẫu tinh dầu được được phân tích bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC‐MS).  Đánh giá tác dụng xua muỗi theo qui trình “Khảo nghiệm hóa chất, chế phẩm diệt côn trùng, diệt khuẩn  dùng trong lĩnh vực gia dụng và y tế” ‐ Bộ Y Tế.  Kết quả: Tinh dầu Khuynh diệp chưng cất bằng phương pháp cất lôi cuốn theo hơi nước có màu vàng  nhạt, mùi thơm đặc trưng, tỉ trọng 0,9150, năng suất quay cực +60 đến +15º, chỉ số chiết quang 1,457 –  1,469. Thành phần  tinh dầu phân  tích bằng GC‐MS  thu  được 21 hợp chất  trong  đó có các hợp chất  đặc  trưng: 1R‐ alpha pinene, Beta – pinene, Eucalyptol, Borneol, Terpineol... Đánh giá tác dụng xua muỗi Aedes  aegypti cho thấy hệ số bảo vệ của tinh dầu khuynh diệp trong ethanol ở các nồng độ 20%, 25% và 30% là  trên 80% sau 30 phút với lượng dùng là 1ml trên 25 cm2 diện tích da từ cổ tay đến khuỷu tay hoặc từ ống  cổ chân đến gối.  Kết luận: Tính chất lý – hóa và thành phần tinh dầu thu được từ lá khuynh diệp (Eucalyptus globulus)  phù hợp với công bố thành phần trong Dược điển Việt Nam. Đánh giá tác dụng xua muỗi Aedes aegypti của  tinh dầu  khuynh diệp với nồng  độ  tinh dầu 30%  tương  ứng 0,857  (l/  cm2)  có hệ  số  bảo vệ  là 93,65 ±  0,728% (sau 30 phút).  Từ khóa: Tinh dầu, lá khuynh diệp, muỗi, eucalyptol.  ABSTRACT  CHEMICAL COMPOSITIONS AND EFFECT OF ESSENTIAL OIL FROM EUCALYPTUS LEAVES  AGAINST AEDES AEGYPTI  Huynh Kha Thao Hien, Duong Phuoc An, Le Thanh Dong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 261 ‐ 265  Background:  Products  that  have  plant‐derived  to  control  transmission  vectors  friendly  with  environment have  been  considered,  especially mosquito  repellents. They play  an  important  role  to  reduce  disease transmission. In the past, people used substances of plant‐derived to repelled mosquitoes, because it  had pleasant odor, non – hazard, easy degradation in environment.  Objectives: To  determine  chemical  compositions  and  evaluate  the  effectiveness  of  essential  oil  from  * Viện Sốt rét ‐ Ký sinh trùng – côn trùng TP. Hồ Chí Minh  ** Khoa Dược – ĐH Y Dược TP.HCM  Tác giả liên lạc: Huỳnh Kha Thảo Hiền      ĐT: 0909 317936    Email: thaohienhuynh@gmail.com  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 262  eucalyptus leaves against aedes aegypti.  Methods:  Essential  oil  from  eucalyptus  leaves  was  extracted  by  heat  hydro  distillation.  Chemical  compositions were  identified by GC‐MS. Protocol “Testing of chemicals,  insecticides, bactericidal apply  in  household and health sectorʺ of Ministry of Health was used to evaluate the effectiveness of essential oil from  eucalyptus leaves against Aedes aegypti.  Result: Essential oil  from eucalyptus  leaves had yellowish, specific odor, d = 0.9150, Optical rotation  from +60 to +15º, index of refraction: 1.457 – 1.469, a total of twenty‐one compounds were identified from  essential  oil  by  GC‐MS  analyses  which  specific  constituent  such  as  1R‐  alpha  pinene,  Beta  –  pinene,  Eucalyptol, Borneol, Terpineol. Essential  oil  from  eucalyptus  leaves  at  concentration 20%, 25%, 30%  in  ethanol had protection coefficient over 80% times effect 30 minutes, with dosage was 1ml in 25 cm2 of skin  from wrist to elbow or from ankle to knee   Conclusion:  Physicochemical  properties  and  essential  oil  composition  from  eucalyptus  leaves  (Eucalyptus  globulus)  matched  essential  oil  composition  published  in  the  Vietnamese  Pharmacopoeia.  Evaluating the effectiveness of essential oil from eucalyptus leaves against Aedes aegypti showed that the oil  had 30%  concentration  corresponding  to 0.857  (l/  cm2) would provide protective  factor 93.65 ± 0728%  (after 30 minutes).  Key words: Essential oil, eucalyptus leaves, mosquitoes, eucalyptol.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Để  phòng  tránh  các  bệnh  do  muỗi  lây  truyền: sốt rét, sốt xuất huyết... ngoài biện pháp  phun tồn  lưu và  tẩm màn thì biện pháp phòng  tránh cá nhân vẫn là chủ yếu. Một trong những  biện pháp đơn giản và  tiện  lợi nhất  là sử dụng  kem  xoa  hoặc  dung  dịch  xua  muỗi.  Trên  thị  trường  trong nước hiện nay  cũng  có  rất nhiều  loại  sản  phẩm  ở  dạng  kem  xua muỗi  như  là  Soffell, Off ! Remos mà thành phần chủ yếu là  hợp chất DEET, một hóa chất tổng hợp.  Trong  những  năm  qua,  các  công  trình  nghiên cứu về các chế phẩm dịch chiết diệt hoặc  xua  côn  trùng  có nguồn gốc  thực vật  đã  được  công bố và kết quả cho thấy hiệu quả bảo vệ của  chúng  khá  cao,  tiêu  biểu  các  sản  phẩm  tinh  dầu(5,1,4,2,6). Tinh dầu khuynh diệp từ lâu đã được  sử  dụng  như một  tác  nhân  xua muỗi. Nguồn  nguyên  liệu  thực vật này  tương đối dễ  tìm, giá  thành không cao và dễ dàng phân hủy trong môi  trường  tự nhiên. Đây sẽ  là một  triển vọng mới  cho  công  tác  nghiên  cứu  và  sản  xuất  các  sản  phẩm xua côn  trùng  truyền bệnh nói chung và  muỗi nói riêng.  Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành  nghiên cứu “Thành phần và tác dụng xua muỗi  Aedes aegypti của tinh dầu lá khuynh diệp”.  Mục tiêu nghiên cứu  Chiết xuất tinh dầu từ lá khuynh diệp bằng  phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước.  Khảo  sát  thành phần và  đánh giá  tác dụng  xua muỗi Aedes aegypti của  tinh dầu chiết  từ  lá  khuynh diệp.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Nguyên liệu  Lá  khuynh  diệp  được  thu  hái  tại  khu  vực  Hóc Môn – TPHCM.  Muỗi thử nghiệm  Muỗi cái Aedes aegypti 2  ‐ 5 ngày  tuổi, được  cung cấp bởi phòng nuôi của Viện Sốt rét  ‐ Ký  sinh trùng ‐ Côn trùng TP. HCM, đủ tiêu chuẩn  thử nghiệm, chưa hút máu và nuôi bằng dung  dịch glucose 10%.  Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp chưng cất tinh dầu  Chưng  cất  tinh  dầu  bằng  phương  pháp  chưng cất lôi cuốn hơi nước.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  263 Xác  định  thành phần hóa học  tinh dầu bằng  phương pháp GC‐MS.  Tinh dầu Khuynh diệp sau chiết xuất được  xác định thành phần hóa học bằng phương pháp  sắc kí khí ghép khối phổ (GC‐MS) tại Phân Viện  Khoa Học Vật Liệu TP.HCM với hệ  thống máy  Agilent 6890N, cột TR‐5MS (30 m, 0,25 mm, 0,25  m  film). Sử dụng Helium  làm khí mang  ở áp  suất 7,05 bar, thể tích bơm 1 l. Chu trình nhiệt:  bắt đầu 600C, tăng 30C/ phút đến 2400C. Sử dụng  thư  viện  phổ NIST  để  nhận  danh  thành  phần  tinh dầu.  Phương pháp  đánh giá  tác dụng xua  của  tinh  dầu Khuynh diệp  Theo qui  trình “Khảo nghiệm hóa chất, chế  phẩm diệt côn trùng, diệt khuẩn dùng trong lĩnh  vực gia dụng và y tế” ‐ Bộ Y Tế.  Tinh  dầu  được  pha  loãng  trong  dung môi  thích hợp (ethanol) điều chế thành các nồng độ  (4 mức nồng độ) khác nhau.  Mô hình lồng thử nghiệm, gồm 2 loại có kích  thước như sau:  Lồng 1: Kích thước 40 x 40 x 40 (cm)  Lồng 2: Kích thước 2 x 2 x 2 (m)  Kỹ thuật thử nghiệm  Thả 50 con muỗi vào lồng có kích thước 40 x  40  x  40  cm  và  100  con muỗi  vào  lồng  có  kích  thước 2 x 2 x 2 m.  Trước khi  tiến hành  thử nghiệm, người  thử  nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng không mùi,  sau đó lau khô.  Xoa đều 1ml dung dịch  tinh dầu pha  trong  ethanol lên bề mặt da có diện tích 25 cm2, từ cổ  tay đến khuỷu  tay cho vào  lồng 1 hoặc  từ đầu  gối đến bàn chân của người thử nghiệm rồi cho  vào lồng 2.  Cho  tay,  chân  vào  lồng muỗi  3  phút  và  nghỉ 30 phút. Lặp lại cho đến khi số muỗi đốt  bằng  10 %  tổng  số muỗi  trong  lồng  thì  thử  nghiệm kết thúc (nếu muỗi đậu  lên da nhưng  không  đốt  thì người  thử nghiệm  lắc nhẹ  tay,  chân cho muỗi bay).  Ở  lồng  đối  chứng,  tay hoặc  chân  được xoa  bằng dung môi pha tinh dầu ở trên.  Đếm số  lượng muỗi đậu  trên  tay và chân ở  lồng thử nghiệm và lồng đối chứng.  Đánh giá hiệu  lực xua theo công thức hệ số  bảo vệ (HSBV).  100(%) x K KX    X: hệ số bảo vệ.  K: số lần muỗi đậu vào tay (chân) ở lồng đối chứng  : số lần muỗi đậu vào tay (chân) ở lồng thử nghiệm  Phương pháp xử lý kết quả nghiên cứu  Kết  quả hệ  số  bảo  vệ  được  trình  bày dưới  dạng Mean ± SEM.  So sánh kết quả trung bình của các HSBV sử  dụng phép kiểm “t – test”.  So sánh phương sai của các HSBV trung bình  sử dụng Anova 1 yếu tố hoặc “F – test”.  Đánh  giá  tính  an  toàn  của  tinh  dầu Khuynh  diệp.  Tính an toàn của tinh dầu khuynh diệp được  đánh giá dựa trên bảng câu hỏi phỏng vấn về tác  dụng phụ của 1 loại hóa chất, chế phẩm.  KẾT QUẢ   Chiết xuất tinh dầu Khuynh diệp  Bảng 1: Hiệu suất chưng cất bằng phương pháp cất  lôi cuốn theo hơi nước  Nguyên liệu Khối lượng (kg) Độ ẩm (%) Lượng tinh dầu (ml) Hiệu suất(%) Lá khuynh diệp 10 30 91 1,3 Bảng 2: Tính chất lý – hóa của tinh dầu lá khuynh  diệp  Tính chất Tinh dầu khuynh diệp Màu sắc, mùi Màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng Tỉ trọng ở 25º C 0,9150 Năng suất quay cực Từ +6º đến +15º Chỉ số chiết quang ở 25oC 1,457 – 1,469 Tính tan Tan tốt trong dung môi kém phân cực và Ethanol Nhận xét: Tinh dầu thu được có đặc điểm và  hiệu  suất phù hợp  với  các  tài  liệu  đã  công  bố  trước đây(3,7).   Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 264  Phân tích thành phần hóa học tinh dầu  Bảng 3: Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu lá khuynh diệp  STT Thành phần CT phân tử RT(phút) Hàm lượng % 1. 1R- alpha pinene C10H16 9,719 26,066 2. 1R-2,2-dimethyl-3-methylene-bicyclo [2,2,1] heptane C10H16 10,221 0,895 3. Beta – pinene C10H16 11,507 18,434 4. Eucalyptol C10H18O 14,100 25,262 5. 1-methyl-4-(1-methylethyl)-1,4-cyclohexadien C10H16 15,491 1,948 6. 1-methyl-4-(1-methylethylidene)-cyclohexadien C10H16 16,913 0,954 7. 1,3,3-trimethyl-bicyclo[2,2,1]heptan-2-ol C10H18O 17,948 0,643 8. Trans-pinocarveol C10H16O 19,130 0,640 9. Borneol C10H18O 20,416 1,060 10. 4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol C10H18O 21,085 2,286 11. Terpineol C10H18O 21,744 7,347 12. Terpinyl acetate C12H20O2 28,844 2,301 13. Alpha – Gurjunene C15H24 31,187 0,306 14. Beta – caryophyllene C15H24 31,574 0,473 15. Decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene- 1H-cycloprop [e] azulene C15H24 32,410 3,121 16. Aromadendrene C15H24 33,278 1,024 17. Gamma- Elemene C15H24 34,753 1,680 18. Globulol C15H26O 38,214 2,449 19. Gamma - Eudesmol C15H26O 40,044 0,796 20. Beta – Eudesmol C15H26O 40,713 0,620 21. Alpha – Eudesmol C15H26O 40,839 1,694 Nhận  xét:  Kết  quả  phân  tích  tinh  dầu  khuynh  diệp  (Eucalyptus  globulus)  cho  thấy  thành phần hóa học có trong tinh dầu phù hợp  với  công  bố  thành phần  trong Dược  điển Việt  Nam(3). Tuy nhiên không phát hiện PMD (para‐  menthane‐3,8‐diol), một thành phần có tác dụng  xua côn trùng mạnh đã được chứng minh(2).  Kết quả thử nghiệm hệ số bảo vệ của tinh dầu khuynh diệp  Thử nghiệm hệ số bảo vệ trong lồng 40 x 40 x 40 cm  Bảng 4: Kết quả thử nghiệm hệ số bảo vệ của tinh dầu khuynh diệp   Số lần thử Hệ số bảo vệ (%) Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Nồng độ 30 % 1 60,75 96,95 88,42 95,95 2 61,37 62,50 90,96 93,58 3 53,89 78,05 57,91 92,91 4 65,11 89,63 91,81 94,26 5 55,14 84,45 92,09 91,55 Trung bình 59,25 ± 2,081 82,32 ± 5.845 84,24 ± 6.614 93,65 ± 0.728 Nhận xét: Hệ số bảo vệ sau 30 phút của tinh  dầu khuynh diệp nồng độ 30% cao nhất (93,65 ±  0,728%) nhưng so với nồng độ 20% và 25% thì sự  khác nhau này không có ý nghĩa về mặt  thống  kê (p > 0,05). Tiếp tục theo dõi sau 60 phút tất cả  các nồng độ tinh dầu khuynh diệp không có tác  dụng bảo vệ theo qui ước.  Thử nghiệm hệ số bảo vệ trong lồng 2 x 2 x 2 m  Kết quả thử nghiệm cho thấy, thời gian bảo  vệ  của  tinh  dầu  khuynh  diệp  ngắn  (dưới  30  phút) và sự khác biệt của các hệ số bảo vệ ở các  nồng  độ không ý nghĩa  thống kê nên chỉ chọn  nồng độ cao nhất để thử nghiệm kiểm chứng.   Kết  quả  cho  thấy  không  có  sự  bảo  vệ  của  tinh dầu khuynh diệp trong thử nghiệm lồng 2 x  2 x 2 m.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  265 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ  Kết luận  Chất lượng tinh dầu thu được bằng phương  pháp chưng cất  lôi cuốn hơi nước đạt  tính chất  lý – hóa.  Về hiệu suất thu được tương đối cao so với  các tài liệu công bố.  Thành phần hóa học tinh dầu  Phù hợp với hầu hết các tài liệu đã công bố  trước đây.  Mẫu  tinh  dầu  khuynh  diệp  không  thấy  thành phần PMD (para‐menthane ‐3,8‐diol) một  thành phần có tác dụng xua côn trùng mạnh.  Đánh  giá  tác  dụng  xua  của  tinh dầu khuynh  diệp trên Aedes aegypti  Trên mô hình thử nghiệm lồng 40 x 40 x 40 cm  Nồng độ tinh dầu 30% tương ứng 0,857 (l/  cm2) có hệ số bảo vệ  là 93,65 ± 0.728% (sau 30  phút).   Trên mô hình thử nghiệm lồng 2 x 2 x 2 m  Kết quả chưa thể hiện sự bảo vệ của tinh dầu  khuynh diệp trong thử nghiệm lồng 2 x 2 x 2 m.  Kiến nghị  Nghiên cứu điều chế sản phẩm để tăng tính  ổn định của tinh dầu và kéo dài thời gian bảo vệ.  Tiếp  tục  khảo  sát  các  loài  khác  của  chi  Eucalyptus  để  tìm  thành  phần  có  giá  trị  xua  muỗi PMD.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Barnard DR, Xue RD. (2004). Laboratory Evaluation of Mosquito  Repellents  Against  Aedes  albopictus,  Culex  nigripalpus,  and  Ochlerotatus  triseriatus  (Diptera: Culicidae).  J. Med. Entomol.  41 (4) 726‐730.  2. Debboun M, Frances S, Strickman D (2006). Insect repellents:  Principle, methods and uses. CRC Press. Pp. 114‐116.  3. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam.NXB Y  học Hà Nội Tr. 742‐744.  4. Ibrahim  J,  Zaki  ZM  (1998).  Development  Of  Environment  ‐  Friendly  Insect  Repellents  From  The  Leaf  Oils  Of  Selected  Malaysian  Plants.  ASEAN  Review  of  Biodiversity  and  Environmental Conversation. 3‐5.  5. Masetti A, Maini S (2006). Arm in cage tests to compare skin  repellents  against  bites  of  Aedes  albopictus.  Bulletin  Insectology. 59 (2) 157‐160.  6. Rajkumar S, Jebanesan A (2007). Repellent activity of selected  plant  essential  oils  against  the  malarial  fever  mosquito  Anopheles stephensi. Tropical Biomedicine. 24 (2)71–75.  7. Văn Đình Đề  (2002). Sản xuất chất thơm thiên nhiên tổng hợp.  NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. 7‐22.  8. WHO/HTM/NTD/WHOPES  (2009).  Guidelines  for  efficacy  testing of mosquito to repellents for human skin.Geneva. Pp 4‐10.  Ngày nhận bài báo:       10/5/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   12/6/2014  Ngày bài báo được đăng:     14/11/2014