Thử nghiệm bảo quản trứng bò và heo bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (Microdrop Vitrification)

Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 45 THỬ NGHIỆM BẢO QUẢN TRỨNG BÒ VÀ HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA TRONG VI GIỌT (MICRODROP VITRIFICATION) Đỗ Hoàng Hùng Sinh viên năm 3, Khoa Sinh học GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thương Huyền 1. Mở đầu 1.1. Lý do chọn đề tài Đông lạnh trứng là một chiến lược hấp dẫn cho bảo tồn sinh sản. Công nghệ này ngày càng được ứng dụng nhiều trong y học, nông nghiệp và nhiều lĩnh vực khác. Các ngân hàng trứng người đông lạnh được lập ra để hỗ trợ bệnh nhân không có noãn. Điều này sẽ mang lại hi vọng cho nhiều cặp vợ chồng bị chứng vô sinh. Trong lĩnh vực nông nghiệp, việc trao đổi, mua bán trứng đông lạnh của các loài gia súc ngày càng dễ, nhất là những loài có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, chúng ta có thể chủ động hơn về thời điểm thụ tinh trong ống nghiệm tạo phôi, chuyển phôi, chuyển gentạo ra giống vật nuôi có năng suất, chất lượng cao, góp phần lớn trong cải thiện nguồn gen. Công nghệ đông lạnh trứng cũng đang tỏ ra hiệu quả trong việc bảo tồn nguồn gen của các loài động vật quý hiếm, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Ngoài ra, các ngân hàng trứng đông lạnh còn là nguồn cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu cơ bản, tạo phôi để tách tế bào gốc Tuy nhiên, các nghiên cứu trên lĩnh vực đông lạnh trứng tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Do vậy, việc nghiên cứu và phát triển quy trình đông lạnh trứng hiệu quả là rất cần thiết. Trên cơ sở đó, tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm bảo quản trứng bò và heo bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt”. 1.2. Mục tiêu đề tài Trong đề tài này, mục tiêu nhắm tới là những kĩ thuật động lạnh trứng bò và heo theo phương pháp mới. Nội dung cụ thể như sau:  Thu và tuyển chọn trứng bò từ nguồn trứng của bò bị giết mổ tại lò mổ.  Đánh giá và tuyển chọn trứng heo chín từ nguồn trứng đã được IVM (In Vtro Maturation). Năm học 2008 – 2009 46  Tiến hành đông lạnh trứng thu được bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt.  Đánh giá sự sống chết của trứng sau giải đông. 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu Những nghiên cứu về đông lạnh trứng mang tính chuyên sâu chỉ thực sự phát triển từ những năm 1970. Các công trình nghiên cứu liên tục được công bố của Parkening và cs (1976) trên đối tượng trứng chuột với tỷ lệ sống 18%; Papis và cs (1999); Martin và cs (2005) trên đối tượng trứng bò chưa trưởng thành sử dụng pp thủy tinh hóa với tỷ lệ sống 80%. Trong nước, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về đông lạnh trứng bò và heo được công bố. 2.2. Đông lạnh trứng (Cryopreservation of oocytes) Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng sinh học bình thường của trứng khi tiến hành giảm nhiệt độ từ nhiệt độ sinh lý (37oC) xuống nhiệt độ không xảy ra các phản ứng sinh lý (-196oC). Thủy tinh hóa (Vitrification) Kỹ thuật đông lạnh ứng dụng hiện tượng đông đặc hoàn toàn của dung dịch khi thực hiện quá trình giảm nhiệt với tốc độ cực nhanh (2.000 – 30.000oC/phút). Khi đó, nước không có sự hình thành tinh thể đá mà hình thành dạng giống như thủy tinh (glass - like), tế bào trứng tránh được các tổn thương do tinh thể đá gây ra trong quá trình bảo quản. Trong phương pháp này, trứng được đặt cân bằng trong chất bảo quản với thời gian ngắn trước khi làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc với chất bảo quản cua trứng tùy thuộc vào nhiệt độ, tính thấm của tế bào và tính độc của chất bảo quản. Tế bào được đặt trong dung dịch huyền phù chất bảo quản nồng độ cao ở nhiệt độ phòng. Vì tác dụng gây độc của chất bảo quản nên thời gian đặt trứng trong dung dịch cân bằng ngắn. Các biện pháp cải tiến phương pháp thủy tinh hóa thường chú trọng vào vào việc làm tăng tốc độ làm lạnh và giải đông, nhờ đó làm giảm ảnh hưởng độc tính của chất bảo quản và tổn thương lên tế bào. 2.3. Vật liệu – Phương pháp Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 47 Trứng bò thu được từ lò mổ sẽ được mang về phòng thí nghiệm tế bào gốc – Trường Đại học KHTN Tp. HCM để tiến hành chọc-hút, thu nhận và phân loại. Sau đó, chọn những trứng loại A và B đem đông lạnh. Trứng heo đã nuôi chín (trứng trưởng thành) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Tế bào gốc. Trứng này được đánh giá và chọn lọc, chỉ những trứng có xuất hiện thể cực thứ nhất mới được chọn cho đông lạnh. Hình 1 : Cryotube chứa vi giọt đông lạnh Cả 2 loại trứng này sau đó được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (microdrop vitrification). Trứng được cho vào lần lượt các môi trường VS1 với thành phần TCM-199 + 10% FBS + 20% EG trong 45 giây; và VS2 với thành phần TCM-199 + 10% FBS + 40% EG +1M sucrose trong 25 giây. Sau đó nhỏ trực tiếp vi giọt VS2 và trứng vào nitơ lỏng. Trứng sau đông lạnh sẽ được giải đông bằng cách đặt trứng lần lượt vào các môi trường RĐI (TCM 199 + 10% FBS + 0,25M sucrose) trong 1,5 phút; RĐII (TCM 199 + 10% FBS + 0,15M sucrose) trong 1,5 phút; RĐIII (TCM 199 + 10% FBS) trong 5 phút. Sau đó đem đánh giá dựa vào hình thái (đối với trứng bò) và đánh giá hình dựa vào thái kết hợp nhuộm trypan blue (đối với trứng heo). Các số liệu trong nghiên cứu được xử lý bằng Excel 2003 ở độ tin cậy 95%. 2.4. Kết quả Năm học 2008 – 2009 48 2.4.1. Kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành Tiến hành với 8 lô thí nghiệm, tổng số trứng đem đông lạnh là 477. Kết quả đông lạnh và giải đông như sau: Bảng 1. Kết quả rã đông trứng bò trong vi giọt Trứng thu được sau rã đông Trứng sống sau rã đông Đợt TN Trứng được đông lạnh n % n % 1 50 37 74,00 28 75,68 2 71 55 77,46 41 74,55 3 65 43 66,15 27 62,79 4 60 41 68,33 28 68,29 5 55 40 72,73 27 67,50 6 66 50 75,76 34 68,00 7 48 39 81,25 30 76,92 8 62 49 79,03 40 81,63 Tổng 477 354 255 Trung bình (%) 74,34 ± 5,13a 71,92 ± 6,23a (a: độ lệch chuẩn với mức nghĩa α < 0,05) 71,92% 28,08% Tỷ lệ trứng sống Tỷ lệ trứng chết Biểu đồ 1. Tỷ lệ trứng bò sống – chết sau rã đông ở phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 49 Các trứng ở đây được đánh giá sống hay chết là dựa vào hình thái. Trứng sống sau giải đông (255/354) đạt tỷ lệ 71,92% ± 6,23. 2.4.2. Kết quả đông lạnh trứng heo đã trưởng thành Sử dụng trứng qua nuôi chín có xuất hiện thể cực. Tiến hành đông lạnh và giải đông theo quy trình. Sau 8 đợt thí nghiệm, tỷ lệ trứng sống sau giải đông 46,15 ± 15,91% (qua đánh giá hình thái). Kết quả nhộm, tỷ lệ trứng sống 26,07 ± 10,42%. Kết quả cụ thể được thống kê lại như sau: Bảng 2 .Kết quả trứng heo thu được sau đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt Trứng sau giải đông Số lần TN Trứng đông lạnh n % 1 58 32 55,17 2 53 46 86,79 3 73 57 78,08 4 32 32 100,00 5 21 14 66,67 6 20 12 60,00 7 28 11 39,29 8 20 12 60,00 Tổng cộng 305 216 Trung bình 68,25 ± 19,26% Hình 2:. Trứng sống (A) và chết (B) sau rã đông (X10) Năm học 2008 – 2009 50 68,25% 31,75% Tỷ lệ thu nhận trứng heo sau giải đông Tỷ lệ trứng mất sau giải đông Biểu đồ 2. Trứng heo thu được trung bình sau giải đông qua các lần thí nghiệm Bảng 3. Kết quả trứng sống chết sau quá trình giải đông qua các lần TN Trứng sống về mặt hình thái Trứng sống sau khi nhuộm Số lần TN n % n % 1 15 46,88 9 28,13 2 18 39,13 12 26,09 3 21 36,84 18 31,58 4 11 34,38 10 31,25 5 9 64,29 2 14,29 6 6 50,00 5 41,67 7 8 72,73 3 27,27 8 25,00 1 8,33 Tổng cộng 91 60 Trung bình 46,15 ± 15,91% 26,07 ± 10,42% Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 51 Trứng chết Trứng sống Hình 3. Hình thái trứng sống và chết 46,88 39,13 36,84 34,38 64,29 50 72,73 2528,13 26,09 31,58 31,25 14,29 41,67 27,27 8,33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 6 7 8 Đợt thí nghiệm (% ) Tỷ lệ trứng sống theo hình thái Trứng sống theo nhuộm Biểu đồ 3. Tỷ lệ trứng heo sống sau giải đông qua các lần thí nghiệm Năm học 2008 – 2009 52 Hình 4. Trứng sống và chết khi nhuộm bằng trypan blue (X10) (1) Trứng chết bắt màu xanh của thuốc nhuộm. (2) Trứng sống không bắt màu xanh của thuốc nhuộm. 3. Kết luận Các kết quả trứng đông lạnh thành công trong đề tài này là những bước đầu cho thấy khả năng bảo quản trứng theo phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt đạt kết quả cao hơn hẳn các phương pháp khác. Đây là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực đông lạnh trứng. Cung cấp nguồn trứng cho việc thành lập ngân hàng trứng, nuôi chín trứng và tiến hành thụ tinh theo các phương pháp IVF (In Vitro Fertilization) hay ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) để tạo phôi trong ống nghiệm, chuyển gen, khai thác tế bào gốc (1) (2) Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Tường Anh. Sinh học đại cương, sự đa dạng, sự sinh sản và phát triển của động vật. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [2]. Phan Kin Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học động vật. NXB Giáo dục. [3]. Andreas Mavrides, David Morroll (2002), Cryopreservation of bovine oocytes: is cryoloop vitrification the future to preserving the female gamete?. © INRA, EDP Sciences. Reprod. Nutr. Dev. 42: 73–80. [4]. Dong-Hoon Kim và cs. (2007), Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The Microdrop Method. Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4 . [5]. B. A. Didion, D. Pomp, M. J. Martin, G. E. Homanics and C. l. Markert (1990),. Observations on the cooling and cryopreservation of pig oocytes at the germinal vesicle stage. J. Anim.Sci. 68:2803-2810. [6]. Steven Francis Mullen (2007), Advances In The Fundamental Cryobiology Of Mammalian Oocytes. © Copyright by Steven Francis Mullen 2007 All Rights Reserved. [7]. R. D. Martins, E. P. Costa1, J. S. C. Chagas1, F. S. Ignácio, C. A. A. Torres, C. McManus (2005), Effects of vitrification of immature bovine oocytes on in vitro maturation. Anim. Reprod., v.2, n.2, p.128-134.