Thu nhận và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ rong đỏ Hydropuntia Eucheumoides

Như vậy, từ kết quả bảng 1 và hình 9 cho thấy lectin từ rong H.eucheumoides không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh sử dụng trong nghiên cứu gồm Staphylococcus areus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae ở nồng độ lectin trong dịch thử khoảng 0,4 mg/mL. Hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh là một trong những hoạt tính sinh học đã được chứng minh ở lectin thu nhận từ nhiều loài rong đỏ. Như lectin từ rong Solieria filiformis đã được chứng minh có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người như Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Samonella typhi hay Pseudomonas aeruginosa. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn này của lectin này được giải thích là do khả năng liên kết được với các gốc đường hiện diện trên bề mặt màng tế bào, các thụ thể của các vi khuẩn đó như glucose, galactose, mannose, ribose, rhamnose, glucosamine, galactosamine. Tuy nhiên, lectin từ rong H.eucheumoides lại không phát hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn sử dụng, điều này có thể giải thích là do sự thiếu các gốc đường cho sự nhận diện của lectin trên bề mặt tế bào các chủng vi khuẩn này hoặc do ở nồng độ này chưa đủ để ức chế được sự phát triển của các chủng vi khuẩn (Holanda et al. 2005). Ngoài các chủng gây bệnh trên người, lectin từ rong đỏ ũng đã được chứng minh có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản hiện nay như khả năng kháng vi khuẩn V.parahaemolyticus của lectin từ loài Gracilaria fisheri, hay một số chủng Vibrio khác như Vibrio pelagius, Vibrio neresis và Vibrio vulnific của lectin từ loài Galaxaura marginata, Eucheuma serra (Liao et al. 2003; Boonsri et al. 2017).

9 trang | Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 7 | Lượt tải: 0

Bạn đang xem nội dung tài liệu Thu nhận và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ rong đỏ Hydropuntia Eucheumoides, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

29 THU NHẬNVÀĐÁNHGIÁHOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA LECTIN TỪ RONGĐỎ HYDROPUNTIA EUCHEUMOIDES ĐinhThànhTrung Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Tómtắt: LectintừrongđỏHydropuntiaeucheumoidesđượcthunhậnquacácbướcgồmtáchchiếtbằng ethanol20%,kếttủabằngethanolnồngđộ80%,tinhsạchbằngkỹthuậtsắckýtraođổiionDEAE-Sepharose vàsắckýlọcgelSephacrylS-200.Trọnglượngphântửcủalectinđượcxácđịnhvàokhoảng17kDvàởdạng monomer.Lectinkhôngthểhiệnkhảnăngkhángcácchủngvikhuẩnsửdụngtrongnghiêncứuởnồngđộ0,4 mg/mL. Từkhóa:lectin,rongđỏHydropuntiaeucheumoides. 1. Mởđầu Dosựbiếnđổi liên tụccủacác tácnhângây bệnhvàảnhhƣởngcủacácloạibệnhtrêncảngƣời vàthủysản,nênviệcchẩnđoánnhằmpháthiệnsớm haytìmracácphƣơngthứcgópphầnlàmtănghiệu quả điều trị là vấn đề cấp thiết. Một trong những phƣơng pháp đang đƣợc quan tâm là sử dụng các phântửcónguồngốcthiênnhiênhoặctáitổhợpcó khả năng nhận diện sinh học. Đây cũng là hƣớng nghiên cứu của công nghệ sinh học hiện đại trong lĩnhvựcy sinh, dƣợc hay thủy sản.Nhờ khả năng nhận diện và liên kết đƣợc với nhiều loại carbohydratekhácnhau,lectinđanglàphântửđƣợc quantâmtrongnhiềunghiêncứu. Trongsốcáclectin,lectintừrongbiểnlàmột trongnhữngphân tử tiềmnăngcủacácnghiêncứu trong lĩnh vực y sinh, dƣợc và thủy sản. Lectin từ rongbiểncómộtsốƣu thếvềđặc tínhlýhóa, cấu trúcsovớilectinthunhậntừthựcvậttrêncạnhoặc từđộngvậtnhƣhoạttínhcủaphầnlớnlectintừrong biểnkhôngphụthuộcvàoionhóatrị2,sựhiệndiện củacầunốidisulphidetrongcấutrúcgiúphoạttính củalectintừrongbiểnbềnvàổnđịnhtrongcácđiều kiệnmôi trƣờngkhắcnghiệt,hay trọnglƣợngphân tử thấp,cấutrúcnhỏđặcbiệtcũng làmộtƣuđiểm giúp lectin từ rong biển có khả năng sử dụng nhƣ một công cụ chẩn đoán hay dùng làm chất dẫn truyềnthuốc.Ngoàiđặcđiểmcấutrúc,sởhữunhiều hoạttínhsinhhọcđãđƣợcchứngminhcũnglàmột trong những ƣu điểm của lectin từ rong biển nhƣ hoạttínhkhángungthƣ,khángvisinhvậtgâybệnh, kháng virus bao gồm cả virus HIV và HCV trên ngƣời,quađómột lầnnữachothấytiềmnăngứng dụng của phân tử này trong lĩnh vực y sinh, dƣợc (Boyd et al. 1966; Singh and Walia 2017). Chođếnnay, cókhôngdƣới100côngbốvề sự hiện diện của lectin ở hơn 800 loài rong khác nhau,tuynhiênsốlƣợngnghiêncứunàyvẫnnhỏvà còn ít so với số lƣợng các loài rong biển.Và theo nghiêncứucủaRamSarupSinghvàcộngsự(2013) đã chỉ ra rằng các lectin có hoạt tính sinh học tốt đƣợcthunhậnởcácloàirongđỏchiếmƣuthếhơn sovớilectinthunhậntừtảolamvàronglục(61%ở rongđỏ sovới 17%ở tảo lamvà22%ở rong lục) (Singh and Walia 2017).Cũngdựatrênkếtquảsàng lọcsựhiệndiệncủalectintrên80loàirongbiểntại Việt Nam của tác giả Hung LD và cộng sự năm 2009và2012cũngchỉralectintừcácloàirongđỏ thểhiệnhoạttínhngƣngkếthồngcầucaohơnsovới cácloàirong thuộcrongnâuhayrong lục (Dinh et al. 2009; Hung et al. 2012). ViệtNamcóđƣờngbờbiểndàitrên3260Km với hệ sinh vật biển phong phú, trong đó số lƣợng cácloàirongbiểnlênđếntrên827loàivớihơn412 loàirongđỏ.Đâylà mộtđiềukiệnvôcùngthuậnlợi về nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tìm ra nhữnglectincóhoạttínhtốttừrongbiển.Từkếtquả nghiêncứusựhiệndiệncủalectintrên80loàirong biển tạiViệtNamcho thấy, lectin thunhận từ loài rong đỏ Hydropuntia eucheumoides là một trong những lectin hoạt tính cao (hoạt độ gây ngƣng kết hồngcầuthỏthửnghiệmlênđến4096HU)(Dinh et al. 2009; Hung et al. 2012).Dođó,cầntiếnhànhthu nhậnvànghiêncứucáctínhchấtcơbảncủalectintừ 30 loài rongđỏH.eucheumoides, từđóđịnhhƣớng sử dụng lectin này trong lĩnh vực y sinh, dƣợc hoặc thủysảntạiViệtNam. 2. Vậtliệuvàphƣơngphápnghiêncứu 2.1.Vậtliệu Rong H.eucheumoides thunhậntạivùngbiển NinhThuậnvàđƣợcđịnhdanhbởiphòngVật liệu hữucơtừtàinguyênbiển– ViệnnghiêncứuvàỨng dụng Công nghệ Nha Trang. Các chủng vi khuẩn bệnh đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur Nha Trang. Máu thỏdoViệnVaccine vàSinh phẩmY tếNha Trang cung cấp. Cột và các loại nhựa trao đổi ion DEAE-Sepharose fast flow, nhựa sắc ký lọc gel Sephacryl S-200củahãngGEHelthcare(Mỹ). Các hóachấtthôngthƣờngcónguồngốcTrungQuốc. 2.2. Phương pháp thu, bảo quản và xử lý mẫu Rong H.eucheumoides sau khi thu đƣợc rửa bằngnƣớcbiển,tiếpđếnlànƣớccấtđểloạibỏdịvật nhƣ cát hay các sinh vật cộng sinh. Tiếp đó, rong đƣợcchovàocáctúinyloncókhóakéo,kíhiệumẫu vàđểtrongtrongcácthùngnhựachứamẫucótúiđá khônhằmduytrìnhiệtđộlạnh,bảođảmmẫukhông hƣ hỏng trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.Mẫurongđƣợcxaynhỏbằngcốixaytrong Nitơ lỏngvà sauđóbảoquảnở -20 oC đến khi sử dụng. Hình1.Rongđỏ Hydropuntia eucheumoides. 2.3. Phươngpháp bốtríthínghiệm 2.3.1. Khảosátảnhhưởngcủaloạidungmôi đến quá trình tách chiết lectin từ rong H.eucheumoides Chuẩn bị cácmẫu bột rong sau khi xay với khối lƣợngbằngnhau trongcáccốcthủytinh.Cho cácdungmôikhảosátvàovớitỉlệbằngnhaulà1:6 (w//v), quá trình chiết đƣợc thựchiện ởnhiệt độ4 oC, sau 12giờ, lọc,lytâm 6000 vòng/phút trong 15 phút thudịchchiếtlectin.Tiếnhànhxácđịnhgiátrị HĐTS,HĐRcủa lectin trong cácmẫu dịchchiết,so sánhvàchọnradungmôichiếtthíchhợp– là dung môimàởđógiátrị hoạtđộtổngsố (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR) của lectin trong dịch chiết là cao nhất. 2.3.2. Khảosátnồngđộethanolthíchhợpđể kếttủalectintừdịchchiếtrongH.eucheumoides Ethanolđƣợclàmlạnhởnhiệtđộ-20 oCtrƣớc khi sửdụngđểkết tủa.Mẫu dịchchiết lectinđƣợc chuẩnbịbằngcáchchiếtrong trong dung môi thích hợp sau khảo sát, sau đó lọc, ly tâm loại bỏ cặn. Chiadịchchiếtthànhcácmẫunhỏcóthểtíchbằng nhau,tiếpđóethanolđƣợcchotừtừ vàocácmẫuđể đạtnồngđộ ethanol cuốicùng trongdungdịchlà50, 60, 70 và 80%. Sau6giờ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút thu tủa và hòa tan lại các mẫu tủa trong đệmPBS0,02M,pH7vớithểtíchbằngnhau. XácđịnhHĐTSvàHĐRcủacácdịchtủa,từđóso sánhvàchọnranồngđộethanolthíchhợp đểkếttủa – lànồngđộethanolmàởđógiátrịHĐRvàHĐTS củadịchtủalectinlàcaonhất. 2.4. Phươngphápxửlýsốliệu Sốliệuthựcnghiệmđƣợctínhtoántìmgiátrị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị bằng phần mềm Mirosoft Exel 2007 (Microsoft Corporation, US).. Xử lý số liệubằngphầnmềmSPSS16.0để đánhgiásựkhácbiệtgiữacácyếutố(cácchữcáiin thƣờng khác nhau thể hiện sự sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hoạt độ riêng (p < 0,05) và các chữcáiinhoakhácnhauthểhiệnsựkhácbiệtcóý nghĩathốngkêvềhoạtđộtổngsố(p<0,05)) 2.5. Chuẩnbịdịchhồngcầu2%dạngxửlý enzyme trypsine Máuthỏđƣợcrửa3đến5lầnbằngdungdịch NaCl 150mM, sau đó bổ sung đệm phosphate 20 mMchứa150mMNaCl (pH:7) đểcódịchhuyền phù hồng cầu 2% (v/v) dạng tự nhiên. Tiếp theo, dung dịch enzyme nồng độ 0,5% (w/v) đƣợc bổ sung,hỗnhợpsaukhiđƣợcủở37oC trong 60 phút tiếptụcđƣợcrửalạitừ3đến5lầnvàphaloãngvề nồngđộhồngcầu2%(v/v)nhƣtrên.Kếtthúcbƣớc này thu đƣợc dịch hồng cầu đã qua xử lý enzyme trypsine. 2.6. Thửnghiệmhoạt tínhngưng kết hồng cầu Hoạttínhngƣngkếthồngcầuđƣợctiếnhành trên đĩa 96 giếng đáy chữ V (Hori et al. 1986). Trƣớctiên,25µlnƣớcmuốisinhlýđƣợcchovàotất cảcácgiếng,sauđó25µldịchlectinđƣợcchovào giếngđầu tiên và tiếnhànhpha loãng liên tiếpđến giếngcuối, tiếp theothêm25µldịchhồngcầuvào cácgiếng,lắcnhẹ,giữởnhiệtđộphòngvàđọckết quảsau1giờ.Kếtquảdƣơngtínhnếuhồngcầutạo thànhmột lớpđồngnhất tronggiếng,ngƣợc lạikết quả âm tính nếu hồng cầu lắng xuống tạo thành chấmnhỏ dƣới đáy giếng.Hoạt độ lectin là giá trị nghịchđảogiátrịphaloãnglớnnhấtmàtạiđóhồng 31 cầuvẫnbị ngƣng kết. Thửnghiệmđƣợc thực hiện vớimẫukép. Hình 2. Kết quả thử nghiệm hoạttínhngƣngkết hồng cầu. 2.7. Khảosáthoạttínhkhángkhuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của lectin đƣợc đánh giátheophƣơngphápđụclỗthạchcủaBauer (Bauer et al. 1966),cóđiềuchỉnhchophùhợpvớiđiềukiện củaphòngthínghiệm.Chuẩnbịdịchhuyềnphùcủa vi khuẩn đã đƣợc nuôi cấy qua 24 giờ vớimật độ khoảng108 tếbào/mL.Trảidịchhuyềnphùvikhuẩn lên môi trƣờng thạch MHA (Muller Hinton Agar) trongđĩapetri.Sửdụngthanhkimloạivôtrùngđể tạothànhnhữnggiếngnhỏcóđƣờngkínhkhoảng5 mmtrênbềmặtmôitrƣờngthạch.Nhỏ200μldịch lectinvàomỗigiếngcủađĩathạch.Hoạtchất lectin sẽkhuếchtántrênmôitrƣờngthạch.Ủđĩaở37 °C. Sau24giờ,kiểmtrasựtạothànhvòngvôkhuẩnvà đo đƣờng kính vòng vô khuẩn. Khả năng kháng khuẩnmạnhhayyếutùythuộcvàođƣờngkínhvòng vôkhuẩnlớnhaynhỏ. 3.Kếtquảvàthảoluận 3.1. Ảnhhưởngcủadungmôichiếtđếnquá trìnhchiếtlectin Sử dụng các dung môi gồm ethanol ở các nồngđộkhácnhau 10, 20, 30, 40, 50% (tƣơngứng E10, E20, E30, E40 và E50) và đệmphosphate20 mM,pH:7.0+150mMNaCl(PBS)đểkhảosátảnh hƣởng củadungmôi chiết đếnHĐTSvàHĐR của lectin.Kếtquảnghiêncứuthểhiệntronghình3. Hình 3. Ảnhhƣởngcủadungmôichiếtđếnhoạtđộtổngsốvàhoạtđộriêng củalectintừrongHydropuntia eucheumoides. Kết quả hình 3 cho thấy ảnh hƣởng của các dung môi khác nhau đếnHĐTSvàHĐRcủa lectin trongdịchchiết.Theokếtquảthuđƣợc,HĐTScủa lectinkhiđƣợcchiếtbằng3loạidungmôigồmE10, E20 và đệmPBS là cao nhất và không có sự khác biệt (26624 HU). Tuy nhiên, lectin khi chiết bằng Dươngtính Âmtính 32 E20 có HĐR cao hơn so với E10 và PBS (2128 HU/mgsovới1927và2041HUmg)(p<0,05).Ởcác dịch chiết bằng E30, E40 và E50, do nồng độ ethanolcàngtăngthìđộhòatancủacácproteinbao gồmcả lectin cànggiảm, dođócảHĐTSvàHĐR đều giảmmạnh (lần lƣợt là 6656, 832, 104HUvà 517, 76, 9 HU/mg). Từ kết quả nghiên cứu trên, ethanol ở nồng độ 20% đƣợc chọn làm dung môi thíchhợp đểchiếtlectintừrongH.eucheumoides. 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quátrìnhkếttủalectin Khảosátquátrình tủa lectin trongdịchchiết rong H.eucheumoides bằngethanolởcácnồngđộ50 đến 80% theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.3.2.Kếtquảnghiêncứuđƣợcthểhiệntronghình 4. Hình 4. Ảnhhƣởng của nồngđộ Ethanolđến hoạtđộ tổng số và hoạtđộ riêng dịch tủa lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides. Kếtquảhình4chothấy,ởnồngđộethanollà 50%HĐTScũngnhƣHĐRcủadịchtủathuđƣợclà thấpnhất(2048HUvà2298HU/mg),doởnồngđộ nàychƣađủđểkếttủalectin.Khităngdầnnồngđộ ethanollên60hay70%thìhàmlƣợngcácproteinbị kết tủabaogồmcảlectintănglên,dođóHĐTSvà HĐRđềutăngmạnh(4096HUvà3624HU/mglên 16384 HU và 9544 HU/mg). HĐTS và HĐR của lectin trong đạt giá trị cao nhất ở nồng độ ethanol 80%(32768HUvà10002HU/mg),dolƣợnglectin cótrongdịchchiếtđãbịkếttủagầnnhƣhoàntoànở nồng độ này. Thêm vào đó, việc sử dụng ethanol làm tácnhânkết tủa sẽ giúprútngắn thờigiankết tủacũngnhƣdễloạibỏethanolsaukhikếtthúcquá trìnhnày.Dođó,chọn80%lànồngđộethanolthích hợpđểkếttủahoàntoànlectintrongdịchchiết. 3.3. TinhchếlectinbằngkỹthuậtsắckýtraođổiionDEAE-Sepharose Hình 5. Đồ thị biểu diễnđộ hấp thụ (λ=280nm)vàhoạtđộ ngƣngkết hồng cầu củacácphânđoạn trong quá trình sắckýtraođổi ion DEAE – Sepharose. Ởkỹthuậtsắckýtraođổiion,cácproteinliên kết với nhựa dựa trên lực liên kết ionvà đƣợc rửa giải khỏicộtở nhữngnồngđộkhácnhau.Kết quả sắc ký đồ hình 5 cho thấy, khi thay đổi nồng độ muối trong đệm rửa giải thì các protein đƣợc rửa giảirakhỏicột(thểhiệnquasựthayđổicủagiátrị 33 A280).Hàmlƣợngproteincaonhấtởnồngđộmuối 0,18 và 0,25M.Toàn bộ các protein đƣợc rửa giải khỏi cột từ nồng độ muối từ 0,38M đến nồng độ muốicuốicùngkhảo sát là0,5M(giá trịA280 bằng 0). Cũngdựa trênkết quả sắckýđồ hình 5, khi kiểmtrahoạt tínhNKHCcủa tất cảcácphânđoạn chothấychỉcóởcác phânđoạntừ13đến31(tƣơng ứngvớinồngđộmuốitừ0,13Mđến0,31M)thểhiện kếtquảdƣơngtính,nghĩalàlectinđãđƣợcrửagiải ra khỏi cột trong các phân đoạn này. Vì vậy, các phânđoạnnàyđƣợcthunhậnđểtiếnhànhcácbƣớc tinhsạchtiếptheo. 3.4. KếtquảtínhsạchbằngkỹthuậtsắckýlọcgelSephacrylS-200 Hình 6. Đồ thị biểu diễnđộ hấp thụ (λ=280nm)vàhoạtđộ ngƣngkết hồng cầu củacácphânđoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200. Từkếtquảhình 6 ghinhậnđƣợc2peakcóđộ hấp thụA280 cao,nhƣvậy,cóthểdựđoánhỗnhợp proteinquasắckýlọcgelchủyếugồm2loạiprotein cótrọnglƣợngphântửkhácnhau.Cũngdựatrênkết quảsắckýđồhình 6, khikiểmtrahoạttínhNKHC của tất cả cácphânđoạn thunhận thì chỉ cóở các phânđoạnthuộcpeakIImớithểhiệnkếtquảdƣơng tính. Từđócóthểkếtluậnrằnglectinđƣợcrửagiải chủyếutậptrungởpeakII.Dođó,tiếnhànhthucác phânđoạntrongpeakII, côđặcbằngmàngsiêulọc kích cỡ 10 kDa, sau đó tiến hành kiểm tra độ tinh sạchvàxácđịnhtrọnglƣợngphântửcủalectinbằng kỹthuậtđiệndiSDS-PAGE. 3.5. Xác định trọng lƣợng phân tử của lectinbằngkỹthuậtđiệndiSDS-PAGE Cácphânđoạncóhoạttínhsaukhitiếnhành kỹ thuật sắcký lọc gel đƣợc sửdụngđể tiến hành điện di nhằm xác định độ tinh sạch cũng nhƣ xác định trọng lƣợng phân tử của lectin thu nhận. Kết quảđƣợcthểhiệntronghình Hình 7. Kết quả điện di SDS-PAGE. Trongđó: Lane1:ThangchuẩnProtein Lane2:Dịchchiết Lane3:Dịchtủalectin Lane 4: Dịchchứa lectin sau sắcký traođổi ion Lane5:Dịchlectinsausắckýlọcgel Lane6: dịch lectin sau sắcký lọcgel+chất khử2-mercaptoethanol 34 Từkết quảđiệndi hình 7 cho thấy số lƣợng các protein đã đƣợc loại bỏmột cách đáng kể sau từngbƣớc.Mẫu sausắcký lọcgel(lane5)chỉcòn lại 1 band ở vị trí trọng lƣợng phân tử khoảng 17 kDavàtrùngvớibandproteinnàyởlane3vàlane 4.Nhƣvậy,cóthểkếtluậnđâylàbandcủaprotein lectincầnthunhận.Ởlane6làdịchlectinsausắcký lọc gel nhƣng đƣợc bổ sung chất khử 2- mercaptoethanol.Kếtquảđiệndichothấyởlane5 và6đềuchỉxuấthiện1bandduynhấtởcùngmột vịtrí(17kDa).Dođó,cóthểkếtluậnlectintừrong H.eucheumoides có trọng lƣợngphân tửkhoảng17 kDavàởdạngmonomer. Trọng lƣợng phân tử của lectin này tƣơng đồngvớinhiềulectinkháctừrongbiểnvàcũngphù hợpvớiđặcđiểmchungcủalectintừrongbiển,theo đó trọng lƣợngphântửcủa lectin thunhậntừphần lớn các loài rong đỏ là tƣơng đối thấp dao động trong khoảng vài chục kDa và cấu tạo dạng monomer nhƣ lectin từ rong Georgiella confluens (21,5 kDa), Griffithsia sp. (13 kDa),K.striatum (28 kDa), S. filiformis (28 kDa), Pterocladiella capillacea (5,8 kDa) (Oliveira et al. 2002; Mori et al. 2005; Souza et al. 2010; Hung et al. 2011; Chaves et al. 2017) Tuy nhiên, vẫn có một số lectin từrongđỏtồntạiởdạngdimer,trimervàcả tetramer nhƣ lectin từ rong G. tikvahiae (dimer - 29,7 và 24,9 kDa), Palmaria palmata (dimer – 20kDa), Vidalia obtusiloba (dimer – 59,6 và 15,2 kDa), Ptilota filicina (trimer – 19,3 kDa), P. plumosa (trimer – 17,4 kDa), P. serrata (trimer – 18,3 kDa), G. verrucosa (tetrameric – 12,12,10,5 và 10,5 kDa) (Singh and Walia 2017), tuy nhiên số lƣợngnàylàrấtít. 3.6. Quy trình thu nhận lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides Từcáckếtquảnghiêncứuđạtđƣợc,quytrình thu nhận lectin từ rong H.eucheumoides đƣợc đề xuấtnhƣsau Hình 8. Quy trình thu nhận lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides. 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides 200 μldịchlectinsautinhsachcónồngđộ2 mg/mLđƣợcsửdụngđểtesthoạttínhkhángkhuẩn theophƣơngphápđãđƣợctrìnhbàyởmục2.7.Kết quảđƣợcthểhiện trongbảng1vàhình9. Bảng 1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides. 35 Vikhuẩn Đƣờngkínhvòngvôkhuẩn(mm) Bacillus cereus - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus - Streptococcus pneumoniae - Klebsiella pneumoniae - Hình 9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩncủa lectin từ rong Hydropuntia eucheumoides. Nhƣvậy,từkếtquảbảng1 và hình 9 chothấy lectin từ rongH.eucheumoides không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh sử dụng trong nghiên cứu gồm Staphylococcus areus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae ở nồng độ lectin trong dịch thửkhoảng0,4mg/mL. Hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh làmột trongnhữnghoạttínhsinhhọcđãđƣợcchứngminh ởlectinthunhậntừnhiềuloàirongđỏ.Nhƣlectintừ rong Solieria filiformis đãđƣợcchứngminhcókhả năngứcchếcácchủngvikhuẩngâybệnhchongƣời nhƣKlebsiella pneumoniae, Proteus spp, Samonella typhi hay Pseudomonas aeruginosa. Khả năng khángcácchủngvikhuẩnnàycủalectinnàyđƣợc giải thíchlàdokhảnăng liênkếtđƣợcvớicácgốc đƣờnghiệndiệntrênbềmặtmàngtếbào,cácthụthể của các vi khuẩn đó nhƣ glucose, galactose, mannose, ribose, rhamnose, glucosamine, galactosamine. Tuy nhiên, lectin từ rong H.eucheumoides lạikhôngpháthiệnkhảnăngkháng các chủng vi khuẩn sử dụng, điều này có thể giải thíchlàdosựthiếucácgốcđƣờngchosựnhậndiện củalectintrênbềmặttếbàocácchủngvikhuẩnnày hoặcdoởnồngđộnàychƣa đủđể ứcchếđƣợcsự phát triển của các chủng vi khuẩn (Holanda et al. 2005).Ngoàicácchủnggâybệnhtrênngƣời, lectin từ rong đỏ ũng đã đƣợc chứng minh có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản hiện nay nhƣ khả năng kháng vi khuẩn V.parahaemolyticus của lectin từ loài Gracilaria fisheri, hay một số chủng Vibrio khác nhƣ Vibrio pelagius, Vibrio neresis và Vibrio vulnific củalectin từ loài Galaxaura marginata, Eucheuma serra (Liao et al. 2003; Boonsri et al. 2017). 4. Kếtluận Dung môi thích hợp để tách chiết lectin từ rongđỏHydropuntia eucheumoides làEthanolnồng độ20%và80%lànồngđộethanolthíchhợpđểkết tủalectintừdịchchiết.Lectinđƣợctinhsạchsaucác bƣớctiếnhànhkỹthuậtsắckýtraođổi ionDEAE- Sepharosevàsắckýlọcgel trênnhựaSephacrylS- 200. Trọng lƣợng phân tử của lectin đã đƣợc xác địnhvàokhoảng17kDavàởdạngmonomerbằng kỹ thuật điệndiSDS-PAGE.Lectin thunhậnđƣợc khôngthểhiệnhoạttínhkhángkhuẩnởnồngđộ0,4 mg/mL đối với 6 chủng vi khuẩn sử dụng gồm Staphylococcus areus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC & Turck M 1966, 'Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method', Am J Clin Pathol vol. 45 (4), pp. 493-496. 2. Boonsri Nantavadee, Rudtanatip Tawut, Withyachumnarnkul Boonsirm & Wongprasert Kanokpan 2017, 'Protein extract from red seaweed Gracilaria fisheri prevents acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) infection in shrimp', J Appl Phycol vol. 29, pp. 1597–1608. 3. Boyd William C., Almodóvar Luis R. & Boyd Lyle G. 1966, 'Some common properties of lectins from marine algae', Transfusion (Philadelphia), vol. 6, pp. 82-83. 4. Chaves RP, Silva SR da, Neto LG Nascimento, Carneiro RF, Silva AL Coelho da, Sampaio AH, et al. 2017, 'Structural characterization of two isolectins from the marine red alga Solieria filiformis (Kützing) P.W.Gabrielson and their anticancer effect on MCF-7 breast cancer cells', Int J Biol Macromol, vol., pp. 5. Dinh HL, Hori & Quang NH 2009, 'Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae', J Appl Phycol, vol. 21, pp. 89-97. 6. Holanda ML, Melo VMM, Silva LMCM, Amorim RCN, Pereira MG & Benevides NMB 2005, 'Differential activity of a lectin from Solieria filiformis against human pathogenic bacteria', Braz J Med Biol Res, vol. 38, pp. 1769-1773. 7. Hori K, Miyazawa K & Ito K 1986, 'Isolation and Characterization of Glycoconjugate-specific Isoagglutinins from a Marine Green Alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni', Botanica Marina, vol. 29, pp. 323-338. 8. Hung LD, Sato Y & Hori K 2011, 'High-mannose N-glycan-specific lectin from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte)', Phytochemistry, vol. 72, pp. 855–861. 9. Hung Le Dinh, Ly Bui Minh, Trang Vo Thi Dieu, Ngoc Ngo Thi Duy, Hoa Le Thi & Trinh Phan Thi Hoai 2012, 'A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae', J Appl Phycol, vol. 24, pp. 227-235. 10. Liao WR, Lin JY, Shieh WY, Jeng WL & Huang R 2003, 'Antibiotic activity of lectins from marine algae against marine vibrios', J Ind Microbiol Biotechnol, vol. 30, pp. 433-439. 11. Mori T, O’Keefe BR, Sowder RC, Bringans S, Gardella R, Berg S, et al. 2005, 'Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIVinactivating protein, from the red alga Griffithsia spp', J Biol Chem, vol. 280, pp. 9345–9353. 12. Nguyen Tu Van, Le Nhu Hau, Lin Showe-Mei, Steen Frederique & Clerck Olivier De 2013, 'Checklist of the marine macroalgae of Vietnam', Botanica Marina, vol. 56, pp. 207-227. 13. Oliveira SRM, Nascimento AE, Lima MEP, Leite YFMM & Benevides NMB 2002, 'Purification and characterisation of a lectin from the red marine alga Pterocladiella capillacea (SG Gmel) Santel & Hommers', Rev Brasil Bot, vol. 25, pp. 397–403. 14. Singh Ram Sarup & Walia Amandeep Kaur 2017, 'Lectins from red algae and their biomedical potential', J Appl Phycol, vol., pp. 15. Souza BWS, Andrade FK, Teixeira DIA, Mansilla A & Freitas ALP 2010, 'Haemagglutinin of the Antartic seaweed Georgiella confluens (Reinsch) Kylin: isolation and partial characterization', Polar Biol, vol. 33, pp. 1311–1318. 37 ISOLATION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF LECTIN FROM RED SEAWEED HYDROPUNTIA EUCHEUMOIDES ĐinhThanh Trung Nha Trang Institue of Technology Research and Application Abstract: Lectin from the red marine algae Hydropuntia eucheumoides was purified by a procedure, including extraction with ethanol 20%, pricipatation with ethanol 80%, ion-exchange using DEAE-Sepharose and gel filtration using Sephacryl S-200 chromatography. The lectin had a estimated molecular mass of 17 kDa, and existed in monomeric form. The lectin exhibited non bactericidal activity at concentration of 0,4 mg/mL. Keywords: lectin, the red algae Hydropuntia eucheumoides.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

thu_nhan_va_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_cua_lectin_tu_ron.pdf