thu thập dịch tiết từ fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán

1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.2 Đặt vấn đề Bệnh do sán lá lớn ở gan là bệnh phổ biến ở trâu bò và các động vật khác như dê, cừu. Bệnh có khả năng lây truyền qua người do ăn rau sống mọc dưới nước có chứa nang trùng. Có hai loại sán lá lớn ở gan là Fasciola gigantica và Fasciola hepatica. Fasciola gigantica phổ biến ở những vùng nhiệt đới như Đông Nam Á, Châu Phi, Hawaii, Pakistan và Thái Lan; còn Fasciola hepatica phổ biến ở Châu Âu, vùng Đông Nam Châu Phi, Mỹ, Châu Úc và Nhật Bản. Các công trình nghiên cứu của những tác giả trong nước cho thấy động vật ăn cỏ ở Việt Nam nhất là trâu bò bị nhiễm sán lá gan cao và đa số là do F. gigantica. Bệnh sán lá gan làm giảm trọng lượng con vật rõ rệt, giảm phẩm chất của thịt (thịt bị thấm ướt), giảm sức chống đỡ với các bệnh khác, làm giảm lượng sữa ở trâu bò nuôi lấy sữa. Ở Việt Nam, trước đây bệnh do Fasciola sp ở người chưa được phát hiện. Tuy nhiên, tỉ lệ người mắc bệnh này đang có chiều hướng gia tăng được xác định với kỹ thuật chẩn đoán bệnh này ngày càng chính xác hơn. Theo các công trình nghiên cứu khoa học trên thế giới, khi ký sinh trong cơ thể vật chủ, sán lá gan lớn sẽ tiết ra các chất có đặc tính sinh học và là kháng nguyên (nên còn gọi là kháng nguyên tiết) đối với thể chủ. Loại kháng nguyên này được đánh giá là có mức độ đặc hiệu cao hơn kháng nguyên thân và kháng nguyên bề mặt, do đó việc chẩn đoán bệnh sán lá gan sẽ chính xác hơn nếu sử dụng loại kháng nguyên này. Ngoài ra, trong dịch tiết này còn có thành phần cysteine-protease được biết như là một enzyme thiết yếu cho cầu ký sinh giữa ký sinh vật và thể chủ. Enzyme tinh chế đã được dùng làm vaccine tiêm chủng trên cừu cho thấy, mặc dù không loại trừ được hoàn toàn sự phát triển của sán lá gan nhưng kết quả thí nghiệm đã chứng minh có sự giảm hoặc làm mất hẳn sự xuất hiện của trứng sán trong phân. Điều này cũng góp phần hạn chế sự lây lan của dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế. 2 Những nhận định trên đã được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – trường Đại Học Nông Lâm TPHCM và Viện Pasteur TPHCM. Dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS. Nguyễn Lê Trang, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán” để xây dựng quy trình tạo kháng thể cho mục đích chẩn đoán y học và nghiên cứu cơ chế ký sinh của sán lá gan. 1.2 Mục đích của đề tài Khảo sát hoạt động kháng nguyên của các thành phần trong dịch tiết. Xây dựng quy trình tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết. Dùng kháng thể của bệnh nhân đặc hiệu với kháng nguyên tiết tạo kỹ thuật chẩn đoán. Khảo sát hoạt tính của cystein-protease trong dịch tiết. 1.3 Yêu cầu Thực hiện các kỹ thuật miễn dịch liên quan đến bệnh do sán lá lớn ở gan: Thu thập sán và dịch tiết. Xác định nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn (Fasciola gigantica) bằng phương pháp Bradford. Xác định thành phần protein trong dịch tiết bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 12%. Kiểm tra phản ứng giữa kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp và kháng nguyên tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony. Tạo cột sắc ký ái lực Sepharose 4B - kháng nguyên tiết để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn. Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn, dùng sắc ký ái lực miễn dịch. Chế tạo hệ thống miễn dịch men để phát hiện kháng nguyên Fasciola sp. Tìm hoạt tính protease trong dịch tiết của sán lá gan lớn với phương pháp điện di SDS-PAGE, 12% và gelatine 0,1% trong thạch. 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên [4] Loài sán lá gan Fasciola gigantica đã được Cobbold phát hiện từ năm 1855. Bệnh do sán lá gan F. gigantica gây ra gọi là bệnh sán lá gan, bệnh phổ biến ở vùng Á Châu và Phi Châu. Theo E. Brumpt, dê, cừu, trâu, bò và cả người cũng nhiễm F. gigantica. Năm 1879, Brie là người đầu tiên đã công bố và mô tả về bệnh sán lá gan ở cừu. Năm 1881, Thomas và Leuckart là hai người đầu tiên đã phát hiện được trong vòng đời (chu trình phát triển) của sán lá gan phải có ốc (ký chủ trung gian) tham gia và hai năm sau vào năm 1883, Thomas đã thực nghiệm và bổ sung thêm về chu trình: phát hiện trứng sán lá gan phát triển phải có nước, nước là yêu cầu cấp bách nhất của ngoại cảnh. Việc nghiên cứu chu trình phát triển của sán lá gan sau này vẫn do Thomas chủ trì, cuối cùng đã nghiên cứu thành công vòng đời của F. hepatica. 2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (từ 28-300C), có ốc ký chủ trung gian Lymnaea swinhoei hoặc Lymnaea viridis và có vật chủ cuối cùng (dê, cừu, trâu, bò nhiễm kén gây bệnh Adolescaria) thì vòng đời phát triển của sán lá gan nước ta được xác định với các khoảng thời gian như sau: Ở môi trường nước (ao, hồ, rãnh…): Trứng sán lá gan nở thành miracidium sau 14-16 ngày. Ở trong ốc ký chủ trung gian: Miracidium phát triển thành sporocyst trong 7 ngày. Sporocyst thành redia trong 8-21 ngày. Redia thành cercaria non trong 7-14 ngày. 4 Cercaria non thành cercaria trưởng thành trong 13-14 ngày. Ở trong nước (ao, hồ, rãnh…): Cercaria rụng đuôi thành adolescaria gây bệnh sau 2 giờ. Ở trong vật chủ cuối cùng: Thời gian sán phát triển thành sán trưởng thành là 79-88 ngày. . Hình 2.1 – Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn (Fasciola sp)[13] 5 Như vậy điều kiện nóng ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự gây nhiễm bệnh cũng như nhiễm bệnh trong tự nhiên. Gia súc nhai lại rất dễ cảm nhiễm kén gây bệnh. Ở những vùng có mầm bệnh (trứng sán), có nhiệt độ thích hợp để trứng nở thành miracidium, có ốc ký chủ trung gian, có dê, cừu, trâu, bò nuốt phải kén gây bệnh thì cứ bình quân ba tháng lại tạo ra một đời sán mới. Con vật trong khi vẫn mang sán lại nhiễm tiếp mầm bệnh mới, gây ra sự bội nhiễm làm cho mức độ bệnh trở nên nặng hơn. 2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan có hệ sinh dục lưỡng tính (có cả bộ phận sinh dục đực và cái trên một cá thể). Sán có hai giác bám, giác miệng ở phía đầu sán, giác bụng tròn và ở gần giác miệng. Sán lá gan không có hệ tuần hoàn và hô hấp. Hệ bài tiết gồm nhiều ống nhỏ, phân nhánh và thông với hai ống chính. Hai ống này hợp lại ở cuối thân rồi thông ra ngoài qua lỗ bài tiết. Thực quản tương đối ngắn, ống tiêu hóa khá dài ra tận phần cuối thân sau, phân thành nhiều nhánh. Dịch hoàn nằm sau buồng trứng và cũng phân nhánh. PGS. TS. Phan Địch Lân (1994), đã phân biệt khái quát hai loài sán lá gan như sau: Một loài có chiều dài thân gấp ba lần chiều rộng, vai sán không có hoặc nhìn không rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa ra nhiều nhánh ngang, loài này là F. gigantica. Loài kia có thân hình như cái lá, thân rộng, phía đầu lồi hẳn ra phía trước làm cho sán có “vai đặc biệt”, nhánh ruột chia ít và nhỏ, loài này là F. hepatica. 6 Hình 2.2 – Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp)[15] 2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan 2.4.1 Ở gia súc [4] Đây là bệnh khá phổ biến đối với trâu bò ở đồng bằng sông Cửu Long và các địa phương khác trong cả nước. Sán dinh dưỡng bằng cách ăn các hồng cầu, các tế bào thượng bì của niêm mạc ống dẫn mật. Bệnh sán lá gan trâu bò rất phổ biến ở những vùng trũng nước ngọt, vì có nhiều điều kiện thuận lợi cho trứng phát triển và có sự hiện diện của ký chủ trung gian. Do sán non di hành trong nhu mô gan làm thương tổn gan, vật bệnh sốt, kém ăn, mệt mỏi. Triệu chứng lâm sàng thường gặp là gầy rạc, suy nhược cơ thể, ỉa phân nhão không thành khuôn; về sau con vật lúc táo bón, lúc tiêu chảy, niêm mạc mắt nhợt nhạt; lông xù, mốc, dễ nhổ. Phân có mùi khắm, đen, hốc mắt sau, có con có nhèm; có thủy thủng ở nách, ức, chướng hơi dạ cỏ, hơi thở hôi, vùng gan sưng lên. Khi sờ vào vùng này con vật có cảm giác đau đớn và chết dễ dàng vì viêm gan nặng hoặc vì suy kiệt. 7 2.4.2 Ở ngƣời [3] Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn: Giai đoạn gan (xâm nhập): Các triệu chứng xuất hiện khoảng 6-12 tuần sau khi ăn phải các nang ấu trùng vào kéo dài 2 - 4 tháng. Trong giai đoạn này, một số lượng lớn ấu trùng di chuyển qua thành ruột, qua khoang phúc mạc, bao gan. Các triệu chứng hay gặp nhất là đau bụng, sốt cơn, sút cân, nổi mề đay, ho, khó thở, đau ngực, rối loạn đại tiện, chán ăn và buồn nôn. Có khi đau khắp bụng nhưng thường khu trú ở vùng hạ sườn phải. Bạch cầu ái toan tăng rất cao (70% - 80%). Giai đoạn mật (trưởng thành): Có thể kéo dài nhiều năm do Fasciola sp có xu hướng di chuyển đến lòng ống mật chủ và phát triển thành sán trưởng thành ở đó. Trên đường đi sán ăn mô gan ký chủ gây ra các triệu chứng nặng. Gan to, vàng da, thiếu máu (một con sán trưởng thành hút 0,2 ml máu /ngày). Đôi khi sán non có thể lọt vào tĩnh mạch về đại tuần hoàn và định vị ở những nơi xa như mô dưới da, phổi, mắt… (trường hợp ký sinh trùng lạc chỗ). Sau ba tháng, sán đã định vị trong ống mật. Người bệnh sẽ có những triệu chứng viêm gan mật mãn, tiếp tục bị mệt mỏi, sụt cân, biếng ăn… Giai đoạn này, số bạch cầu ái toan lại giảm nhiều. Trong phân cũng như dịch mật người bệnh bắt đầu có thể tìm thấy những trứng sán. Nhưng thực tế số trứng rất ít và cũng ít khi xét nghiệm này được chỉ định. Bệnh tiếp tục kéo dài trong nhiều năm, nếu để tồn lưu lâu ngày sẽ bị các bệnh mãn tính của đường mật và có thể dẫn đến biến chứng xơ gan, vỡ gan, suy gan, đau bụng dai dẳng, mất sức lao động và cuối cùng có thể dẫn đến tử vong. 8 2.5 Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá lớn ở gan 2.5.1 Ở gia súc [4] Chẩn đoán: Chú ý đến tính chất vùng có đủ điều kiện thích hợp cho sán phát triển. Trâu bò ở thể mãn tính gầy ốm, suy nhược và tiêu chảy kéo dài (viêm ruột mãn). Để tìm trứng sán trong phân ta có thể sử dụng phương pháp gạn rửa sa lắng phân: lấy 4-8 viên phân, nếu phân nhão thì lấy một lượng phân bằng quả táo ta, hòa trong nước sạch rồi lọc qua lưới thép bỏ bớt cặn bã. Nước lọc được để lắng cặn và gạn rửa nhiều lần rồi gạn nước trong ở trên bỏ đi, lấy cặn phân soi kính hiển vi tìm trứng sán lá gan ở độ phóng đại 100 lần. Trứng sán lá gan hình bầu dục, một đầu hơi nhỏ hơn, màu vàng nâu, trong có phôi bào xếp sát đến vỏ trứng. Theo Enigh, một con sán lá gan một năm có thể thải theo phân khoảng 6000 trứng và sán có thể sống trong cơ thể gia súc tới 11 năm. Trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ thích hợp, chỉ một phần số trứng phát triển, một miracidium phát triển thành chừng 180 – 200 cercaria trưởng thành. Sự khô ráo và tác động trực tiếp của ánh nắng mặt trời làm trứng chết. Trong phân ướt trứng sống được 8 tháng. Trứng sán ngừng phát triển ở 10-12 0 C. Ở nhiệt độ dưới 500C trứng sống được 2 ngày. Trong cỏ phơi chưa khô, adolescaria gây bệnh duy trì được sức sống 3-5 tháng. Phòng bệnh: + Chống phát tán mầm bệnh: Ủ phân diệt trứng sán, làm tinh sạch “tinh khiết” ốc ký chủ trung gian. Áp dụng biện pháp Hình 2.5.1 – Trứng sán lá gan lớn (Fasciola sp)[17] 9 chia lô chăn thả, qui hoạch bãi chăn gia súc không bị nhiễm sán, kiểm tra gia súc để phân loại tẩy sán trước khi thả vào bãi. + Diệt mầm bệnh: Tẩy sán lá gan trong cơ thể gia súc theo lịch dựa vào chu trình sinh học của sán. Những cơ sở giống 3 tháng tẩy 1 lần; các cơ sở ô nhiễm nặng tẩy 2 lần/năm; cơ sở ô nhiễm nhẹ tẩy 1 lần/1 năm; cơ sở nhiễm dưới 20% tổng đàn thì phát hiện con nào có sán tẩy con đó và cần tăng cường sức khỏe của đàn gia súc bằng chế độ ăn uống và quản lý tốt sức cày kéo của trâu bò, định kỳ kiểm tra sức khỏe. Điều trị: + Dertyl – B cho uống liều 6 – 9 mg/ kg thể trọng. + Dovenix: Chích bắp 1 ml/ 25 kg thể trọng. Khi điều trị nên kết hợp bồi dưỡng cho con vật và quản lý tốt về môi trường. 2.5.2 Ở ngƣời [2,3] Ở người, việc chẩn đoán sán lá gan vẫn gặp rất nhiều khó khăn do có nhiều triệu chứng lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng. Hai trường hợp đầu tiên nhiễm sán lá gan lớn trên người ở Việt Nam đã được Đỗ Dương Thái và Trịnh Văn Thịnh báo cáo vào năm 1978. Ca tiếp theo được ghi nhận vào năm 1991 và từ năm 1997 đến nay khi Trần Vinh Hiển và Trần Thị Kim Dung sử dụng phương pháp huyết thanh miễn dịch men nhằm chẩn đoán bệnh do sán lá lớn ở gan trên người thì các ca bệnh được phát hiện ngày một nhiều hơn. Theo phương pháp này, đã phát hiện trên 500 ca ở người chỉ trong vòng có 3 năm. Đa số bệnh nhân đến từ các tỉnh ven biển miền Trung như Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa. Tất cả bệnh nhân đều có hình ảnh tổn thương gan trên siêu âm, tổn thương dễ nhầm với abces gan do amibe; abces gan do vi khuẩn, ung thư gan. Bên cạnh đó xét nghiệm máu cho thấy bạch cầu toan tính tăng cao từ 16 – 70% và tất cả có hiệu giá kháng thể là 1/1600 – 1/12800 với kháng nguyên là Fasciola gigantica. 10 Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán lá gan lớn [Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh] Hình 2.5.2.2 - Hình chụp siêu âm của bệnh nhân nhiễm sán lá lớn ở gan [Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh] Về điều trị dùng Dehydro – Emetine hoặc Chlorhydrate Emetine, mặc dầu thuốc này có nhiều tác dụng phụ (gây liệt cơ, suy tim…); bệnh nhân phải nằm viện tối thiểu 10 ngày nhưng vẫn phải sử dụng vì thị trường 11 trong nước chưa có thuốc nào thuận tiện hơn. Hiện nay, có xu hướng sử dụng triclabendazole. Theo dõi bệnh nhân sau điều trị thì thấy tỷ lệ bạch cầu toan tính trong máu và hình ảnh siêu âm gan có xu hướng trở lại bình thường sớm hơn hiệu giá huyết thanh miễn dịch. Đến tháng 9, tỷ lệ bạch cầu toan tính trong máu của 70% bệnh nhân trở lại mức bình thường sớm hơn hiệu giá huyết thanh miễn dịch. Sau một năm điều trị, hiệu giá kháng thể vẫn còn cao (trên 91,96%) nên không thuận lợi để theo dõi hiệu quả của điều trị. Do tập quán ăn rau sống, bối cảnh sinh thái môi trường, chăn nuôi gia súc gần nơi trồng rau, số người mắc bệnh chắc chắn phải rất cao trên thực tế, vì vậy dùng Emetine chưa phải là một giải pháp tốt cho việc điều trị hàng loạt cần phải có sự phối hợp giữa nhiều ngành chức năng: thú y, canh nông, môi trường, sinh thái, y học để giải quyết tốt vấn đề này ở nước ta. 2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học 2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được tiết ra ở các giai đoạn phát triển khác nhau của sán lá gan trong cơ thể của ký chủ. Loại protein này được xem như một sự nhiễm bệnh đối với Fasciola sp. Do đó, nó có thể được dùng để chẩn đoán sớm bệnh sán lá gan lớn ở người khi kháng thể đặc hiệu chống lại sán chưa được xuất hiện (từ 1 – 3 tuần sau nhiễm). Bệnh thường có những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng và biến động nên đa số các bệnh nhân nhập viện đều cho kết quả kháng thể kháng Fasciola sp cao. Lúc này, lượng protein tiết đánh giá qua xét nghiệm sẽ giảm dần và có xu hướng mất hẳn. Do đó, việc phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân cũng gặp nhiều khó khăn. Sán ký sinh ở ống dẫn mật nên lượng protein tiết sẽ lưu thông xuống ruột và được bài tiết theo phân. Vì thế, việc tìm protein tiết trong phân có nhiều thuận lợi hơn. Xét nghiệm huyết thanh học qua phương pháp miễn dịch men đã được Trần Vinh Hiển và Trần Thị Kim Dung dùng để phát hiện kháng thể của người bệnh mang 12 lại hiệu quả cao. Nhưng do sử dụng kháng nguyên thân của F. gigantica nên có thể có những phản ứng chéo không mong muốn và không thể đánh giá được hiệu quả điều trị bệnh vì lượng kháng thể vẫn còn tồn tại rất lâu trong cơ thể bệnh nhân sau khi đã khỏi bệnh. Thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được đánh giá là có tính đặc hiệu hơn so với kháng nguyên thân của F. gigantica (còn gọi là kháng nguyên tiết – excretory/ secretory antigens) nên có thể sử dụng để cải tiến phương pháp huyết thanh miễn dịch men để phát hiện kháng thể nhạy hơn và để tránh các phản ứng chéo. Ngoài ra, kháng nguyên tiết còn được dùng để đánh giá hiệu quả điều trị vì các nghiên cứu khoa học cho thấy sau khi được điều trị thì lượng kháng nguyên tiết sẽ được giảm một cách từ từ trong cơ thể ký chủ. Do đó hiệu quả điều trị sẽ được đánh giá nhanh chóng hơn [6, 5, 11,12]. 2.6.2 Hoạt động protease Thành phần chủ yếu của dịch tiết là cysteine-protease trong thời gian ký sinh đóng vai trò chủ chốt trong việc xâm nhập bệnh vào cơ thể ký chủ. Các enzyme này giúp phân giải thành phần protein của ký chủ để cung cấp dinh dưỡng cho sán phát triển và để tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của ký sinh trùng qua ruột non và gan. Chúng phân cắt những protein của màng ruột như fibronectin, laminin và collagen. Mặt khác, chúng còn bất hoạt hàng rào bảo vệ miễn dịch của tế bào chủ bằng sự phân cắt các immunoglobulins. [8,10] Do đó, việc xác định và tinh chế thành phần protease này có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và gia súc. Các thử nghiệm tạo vaccine từ các loại protease trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn ở giai đoạn non và trưởng thành đã được thực hiện cho thấy có kết quả tốt tác động lên sự dinh dưỡng và phát triển của ký sinh trùng cũng như hạn chế số lượng trứng trong phân. Từ đó kiểm soát được sự lan nhiễm của bệnh và hạn chế mức thiệt hại về kinh tế [10]. 13 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 3/2005 đến tháng 6/2005. Địa điểm: phòng Hóa Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Sán trưởng thành từ gan trâu, bò bị nhiễm sán lá gan được lấy từ công ty Vissan. Sử dụng sán chết được giữ trong môi trường PBS. Bảo quản ở -200C. Nuôi sán còn sống trong môi trường được pha chế bên ngoài vật chủ để thu lấy dịch tiết. Bảo quản ở -200C. 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 3.2.2.1 Thiết bị Cân phân tích E14130, OHAUS, Switzerland. Máy lọc nước Titertek (Microtitration). Tủ hút khí (pha hóa chất) Kottermann. Máy đo pH METTLER TODEDO MP220. Máy sấy tiệt trùng. Tủ cấy vô trùng. Lọc vô trùng 0,22 μm. Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments. Máy ly tâm nhỏ Micro centrifuge. Máy khuấy từ CATM6/1. Tủ lạnh Vestfrost REETECH, DOSAI, SANYO. Máy vortex Minishaker MS1. Máy lắc thường LAB-ROTATOR, LAB-LINE. Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan). 14 Bộ điện di protein SNEW. Máy đọc ELISA Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur. Máy nghiền tế bào bằng sóng siêu âm Sonicator (Merck) Máy chụp ảnh. Máy vi tính. 3.2.2.2 Dụng cụ Van kẹp; ống nghiệm thủy tinh; bông gòn không thấm nước; các loại ống nhựa 5 ml, 15ml, 50 ml; bộ kính điện di đứng; kim bơm butanol 100 μl, kim bơm mẫu 50 μl; eppendorf; đầu cone; bình tia đựng cồn, nước cất; ống hút nhựa; ống đong; giấy lọc; cóng đo bằng nhựa; pipetman và típ các loại. 3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch Nước cất 2 lần. Dung dịch PBS 1X. Môi trường RPMI 1640 1X để nuôi sán (hãng Gibco BRL Code 51800 – 035). Kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Penicillin. Dung dịch màu (Bradford 4X) dùng để xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford: + Comassie blue G (Serva Blue G – N0 35050) 85 mg + Ethanol (EtOH) 50ml + H3PO4 85% 100ml + H2O cất hai lần 100ml Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) Các dung dịch dùng trong điện di: 1. Dung dịch 40% T: Acrylamide (38,93g); N, N’-Methylene-bis- acrylamide (1,07g). Hòa tan trong khoảng 80 ml + 1 ít MB1 và xoay với máy khuấy từ trong 30 phút. Chỉnh đúng 100 ml. Lọc qua Whatman số 1 cho vào chai nâu và bảo quản ở 40C. 15 2. Dung dịch 9,5% T: Acrylamide (6,3g); N, N’-Methylene-bis- acrylamide (3,2g). Làm theo như với dung dịch 1. 3. Đệm phân giải (1,5M Tris): Tris base (18,15g). Trộn với khoảng 70 ml H2O. Dùng HCl hòa tan và chỉnh pH xuống 8,8. Chỉnh đúng 100 ml và bảo quản ở 40C. 4. Đệm tập trung: Tris base (3g). Trộn với khoảng 35 ml H2O. Dùng HCl, hòa tan và chỉnh pH xuống 6,8. Chỉnh đúng 50 ml và bảo quản ở 40C. 5. Dung dịch SDS 10%: 10g/100 ml. Giữ ở nhiệt độ phòng. 6. Dung dịch đệm bình điện di: Tris base (12g); glycine (57,6g). Hòa tan và chỉnh đúng 1000 ml. Bảo quản ở 40C. Khi dùng pha loãng ¼ và cộng 1% dung dịch 5 (4 ml/400ml). 7. Dung dịch cố định: Sulfosalicylic acid (4g) + 100 ml Trichloroacetic acid 12,5%. 8. Dung dịch nhuộm: Coomassie R250 (2,5g); Methanol (600 ml); Acid acetic (90ml). Trộn đều bột màu với hai dung môi hữu cơ này để hòa tan trước khi cho nước vào, 300 ml nước. (Có một số bột màu có giá bột thủy tinh, không tan được phải lọc qua Whatman số 1). 9. Dung dịch tẩy: Methanol (50ml); Acid acetic (75ml); nước cho đến 1000 ml. 10. Dung dịch glycerol (d=1,25g/ml) 1g=0,8 ml (nếu không dùng 1g glycerol dùng 0,8 ml H2O) 11. Dung dịch xanh-glycerol dùng để pha mẫu: glycerol (2 ml); SDS 10% (2,5 ml); đệm 4 (2 ml); màu bromphenol (80 μl); nước cất vừa đủ 10 ml. Bảo quản ở 40C. Dung dịch TEMED (2μl/4ml) khi còn mới. Khi lực xúc tác bị yếu đi tăng lên cao hơn. Dung dịch APS/KPS (A/K persulfate) (100 mg/ml) pha trước khi dùng ở 40C. Chỉ dùng dung dịch mới pha (15 μl/ 4 ml) khi còn mới. 16 Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng lên cao hơn. Để hãm tốc độ polymer hóa, các dung dịch monomer cần cho xuống 40C trước khi thực hiện gradient. Dung dịch Triton 2,5%. Dung dịch EDTA 1mM; glycine 0,1M; L-Cystein 10mM; pH = 8. Các dung dịch dùng trong miễn dịch khuếch tán kép: Dung dịch gel agarose 1% pha trong đệm PBS 1X để làm phản ứng miễn dịch khuếch tán kép trên thạch. Dung dịch nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Các dung dịch dùng trong sắc ký ái lực: Gel CN-Br activated Sepharose 4B (Pharmacia, Thụy Điển). Dung dịch NaN3 0,05% (dd1). Dung dịch HCl 1mM, pH = 3. Dung dịch đệm carbonate: NaHCO3 0,1M; NaCl 0,5M; thimerosal 0,01%; pH = 8,7 (dd3). Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaCl 0,5M; pH = 8 (dd4). Dung dịch NaCl 0,5M; CH3COONa 0,1M; pH = 4 (dd5). Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaN3 0,05%; NaCl 0,5M; pH = 7,4 (dd6). Dung dịch glycine 0,1M, pH = 2,5. Các dung dịch dùng trong kỹ thuật ELISA: Đệm carbonate Na2CO3; pH = 9,6: NaHCO3 0,075M (pH = 8; 1,26g/ 200 ml); Na2CO3 0,075 M (pH = 10,9; 159 g/200 ml); NaN3 0,003% (0,04 g/200 ml). Dung dịch rửa: PBS thimerosal 0,01%; Tween 0,05%. Dung dịch bão hòa pH = 8 (HCl): Tris 0,1M; NaCl 0,15 M; EDTA 1mM, NaN3 0,05%; Tween 20 0,05%; Gelatin 0,5%. NHS-LC-Biotin (21336, Pierce). OPD – cơ chất cho peroxydase (Sigma, USA). Streptavidin - peroxydase (Sigma, USA). Chất hiện màu. 17 Dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 1,5 N. 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Quy trình lấy mẫu [6] Sán trưởng thành từ gan trâu hoặc bò bị nhiễm sán lá gan được rửa 4 lần với PBS 1X cho sạch máu và mật, sau đó cho vào ống chứa PBS và bảo quản ở -200C. Đối với sán sống cho vào môi trường nuôi RPMI 1640 (1 con/5 ml/1 ống nghiệm), ủ ở 370C/24h. Sau đó ly tâm (3000 vòng/phút/40C/30phút) thu lấy dịch nổi, bảo quản ở -200C. 3.3.2 Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD280 [9] Phương pháp này sử dụng một máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – VIS). Cấu tạo gồm nguồn sáng, một khe hở cho ánh sáng đi vào, các lăng kính và cách tử để tạo thành các ánh sáng đơn sắc, ngăn chứa mẫu và đầu dò để đo lượng ánh sáng sau khi qua mẫu. Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát qua hệ thống các lăng kính và cách tử sẽ chỉ tạo ánh sáng đơn sắc với bước sóng nhất định. Khi đi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử. Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 280 nm, sự hấp thụ này có được chủ yếu là do các amino acid có nhân thơm như phenylalanine, tyrosine, tryptophan. Tuy nhiên, mỗi protein có thành phần và số lượng các amino acid trên khác nhau nên mỗi protein sẽ có một hệ số tắt (extinction) tương ứng. Hệ số tắt này là tỉ số giữa độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm (OD280) trên nồng độ (mg/ml) của protein. Ví dụ, protein BSA có hệ số tắt là 0,66; như vậy nếu BSA giá trị OD280 = 0,66 thì nồng độ của BSA là 1 mg/ml. 18 Hình 3.3.2 – Biểu đồ quang học máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – Vis)[9] 3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phƣơng pháp Bradford [7,18] Bradford là một phương pháp định lượng protein rất phổ biến bởi vì nó đơn giản, nhanh, không đắt và nhạy. Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Coommassie Briliant Blue G-250 (CBBG). Thuốc nhuộm này liên kết chuyên biệt với protein ở vị trí các nhóm amino acid arginine, tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine trong đó chủ yếu là liên kết với arginine (nhiều hơn 8 lần so với nhóm khác). CBBG liên kết với các nhóm này dưới dạng amin, mà ở dạng này nó hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 595 nm (màu xanh); Thuốc nhuộm ở dạng tự do là cation, mà ở dạng này nó hấp phụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 470 nm (màu đỏ). Phương pháp này được đo ở bước sóng 595 nm bởi một máy quang phổ kế, và vì vậy đo phức hợp CBBG với protein. 19 Hình 3.3.3 – Cấu trúc hóa học của Coommassie Brilliant Blue G-250 Sự lựa chọn protein chuẩn cho phương pháp này cũng ảnh hưởng nhiều đến kết quả. Đối với mỗi protein được định lượng nên có một protein chuẩn thích hợp. BSA là một protein chuẩn thường được lựa chọn và kết quả là tương đối với BSA.  Cách thực hành: Xác định đường chuẩn theo nồng độ protein chuẩn (BSA). Dung dịch BSA có nồng độ 200 µg/ ml. Thực hiện đường chuẩn độ protein tương đối với BSA. Chuẩn bị mẫu protein tinh chế. Pha loãng mẫu sao cho sự quan sát có đựơc nằm trong giới hạn cho phép của đường chuẩn. Thứ tự các chất cho vào giếng: nước cất, BSA chuẩn (hoặc mẫu protein), dung dịch Bradford 4X. Trộn đều các chất trong giếng (tránh tạo bọt), để phản ứng trong 5 phút. Đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 595 nm. Xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 và Microsoft Excel 2003. 20 Bảng 3.3.3 – Tổ chức thực hiện đƣờng chuẩn protein theo nồng độ BSA. Giếng Lƣợng BSA(µg) V ( BSA) (200µg/ml)(µl) Nƣớc cất hai lần (µl) Dung dịch Bradford 4X (µl) A1 0 0 180 60 A2 0 0 180 60 B1 1 5 175 - B2 1 5 175 - C1 2 10 170 - C2 2 10 170 - D1 4 20 160 - D2 4 20 160 - E1 6 30 150 - E2 6 30 150 - F1 8 40 140 - F2 8 40 140 - 21 3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn [9,16] Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein- Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di; xác định thành phần và độ sạch của chế phẩm protein trong quá trình được tinh chế (Davis E.Garfin 1995) [16]. Trong kỹ thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfide là mercaptoethanol hoặc dithiolthretol (DTT). Với các tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein đều được tích điện âm. Tỷ lệ lượng SDS bám được vào protein là không thay đổi: SDS/ protein (g/g) =1,4 Tổ chức của phức hợp protein-SDS cấu tạo thành một hình bầu dục dài (ellipsoid) với các cực âm của các nhóm sulfate ở phía ngoài. Protein càng lớn, bầu dục càng dài. Do đó, có sự liên quan giữa trọng lượng phân tử của protein với tốc độ di chuyển của các protein trong môi trường có SDS cho đường biễu diễn tuyến tính log.(M.W.) = ax + b (chiều dài đường di). Công thức này cho thấy trọng lượng phân tử (M.W) càng lớn, đường đi càng ngắn, tức a < 0 và cắt các cầu nối S-S là cần thiết để đảm bảo quy luật trên. Tốc độ di chuyển của một protein trong phương pháp điện di dựa trên sự khác nhau về điện tích, kích thước lỗ gel, trọng lượng phân tử, cường độ điện trường, thời gian điện di, nhiệt độ… Các thành phần được sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là acrylamide, N,N’-methylene-bis (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate. 22 Hình 3.3.4.1 – Các thành phần đƣợc sử dụng để tạo gel polyacrylamide Khi ammonium persulfate bị phân ly trong nước, nó hình thành nên các gốc tự do: S2O8 2- → 2SO4 2- Nếu các gốc tự do này được tiếp xúc với acrylamide, gốc tự do trong phân tử acrylamide được hình thành. Sau đó acrylamide được hoạt hóa này sẽ phản ứng với các phân tử acrylamide khác để tạo ra một chuỗi đa phân dài. Hình 3.3.4.2 – Phản ứng chuỗi đa phân hóa acrylamide 23 Sự hình thành gel đòi hỏi các chuỗi đa phân này liên kết chéo với nhau. Hợp chất N,N’-methylene-bis (acrylamide) sẽ giúp tạo phản ứng đa phân hóa các chuỗi acrylamide. Hình 3.3.4.3 – Phản ứng tạo liên kết chéo nối hai sợi đa phân acrylamide Kích thước lỗ gel được xác định bởi hai thông số: (1) nồng độ acrylmide( C%) ; (2) mức độ liên kết chéo (T%). C%= Nồng độ Bis, (g) / Nồng độ acrylamide, (g) T%= Nồng độ acrylamide (g)– Bis, (g) / Thể tích, (ml) Thông thường C% ít được quan tâm, người ta quan tâm đến thông số T% nhiều hơn. Sự thay đổi T% làm cho khoảng trống của gel thay đổi, T% càng tăng lưới sàng lọc phân tử càng dày đặc, các phân tử lớn khó hoặc không chuyển qua được. Sự có mặt của SDS sẽ làm cho các phân tử protein khi đi qua gel được bọc bởi một lớp điện tích âm. Khi điện di các phân tử protein được di chuyển từ cực âm sang cực dương và đồng thời cũng là di chuyển từ lớp gel có khoảng trống của lưới phân tử to đến lớp có khoảng trống của lưới phân tử nhỏ. Những phân tử có kích thước lớn sẽ di 24 chuyển chậm hơn phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Với sự di chuyển này, các phân tử protein sẽ được phân tách trên băng điện di hoàn toàn theo trọng lượng phân tử. Trong thực tế để xác định trọng lượng phân tử của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã được biết. Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di gel không liên tục. Ở phương pháp này, gel thường có hai lớp: lớp trên (gel tập trung), lớp dưới (gel phân tách). Hai lớp gel này khác nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide.  Cách tiến hành: Chuẩn bị tấm kính để đổ gel Chuẩn bị một gel polyacrylamide có nồng độ acrylamide là 12 % theo bảng sau: Bảng 3.3.4 – Cách chuẩn bị một gel polyacrylamide 12%T Separating gel Stacking gel 2,64 ml H2O 1,5 ml dung dịch 3 60µl dung dịch 5 1,8 dung dịch 1 TEMED 100 µl APS 130 µl 2 ml dung dịch 2 1 ml dung dịch 4 40 µl dung dịch 5 0,96 ml H2O 50 µl TEMED 100 µl APS Bề mặt gel phân giải: + Isobutanol hoặc 0,5 ml dung dịch 3 + 20 µl dung dịch 5 + 1,48 ml H2O 25 Sau khi đổ gel phân tách (separating gel) trước, ta cho bultanol vào để nén bằng mặt gel. Lưu ý không để tạo bọt khí. Sau khi gel đông, ta rửa lớp butanol bằng nước cất. Sau đó tiếp tục đổ gel tụ chùm (stacking gel). Các giếng được đặt ở lớp gel tụ chùm nhờ lược. Sau khi gel trùng ngưng xong, tiến hành lấy lược ra và lắp gel vào bình điện di. Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử sau khi xác định được nồng độ sẽ được trộn với dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1:1 và xử lý mẫu bằng cách đun cách thủy trong vòng năm phút. Chuẩn bị máy điện di: pha dung dịch đệm bình điện di. Mẫu được nạp vào giếng, tiến hành chạy điện di (80V; 40 mA; 2giờ 45 phút). Sau khi điện di, nhuộm Coomassive trong 10 phút. Sau đó tiến hành tẩy bằng cách ngâm gel trong dung dịch tẩy cho đến khi nền gel trở nên trong suốt. Thay mới dung dịch thuốc tẩy khi dung dịch này có màu tương đương với màu trong nền gel. Xem kết quả.  Trường hợp điện di để xác định hoạt tính protease trong dịch tiết của sán lá gan ta tiến hành tương tự chỉ khác là thêm cơ chất gelatine 0,1% vào gel phân tách và không có xử lý mẫu để tránh làm biến tính protease trong mẫu. Sau khi điện di ngâm trong Triton 2,5% hai lần mỗi lần 30 phút. Ngâm trong dung dịch hoạt hóa EDTA 1mM, glycine 0,1 M, L-cystein 10mM pH = 8 trong 30 phút. Thay nước ngâm tiếp bằng dung dịch trên để qua đêm. Sau đó tiến hành nhuộm và tẩy tương tự như điện di thường. 26 3.3.5 Phƣơng pháp miễn dịch khuếch tán kép (Immunodiffusion) Đây là kỹ thuật đơn giản nhất nhằm phát hiện khả năng ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Ta sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Sau đó so sánh với kháng nguyên thân của F. gigantica xem loại kháng nguyên nào đặc hiệu hơn với kháng thể của Fasciola sp. Kháng nguyên thân của F. gigantica được chuẩn bị như sau: 1,288 g sán cho vào thêm 2 ml đệm PBS 1X rồi dùng máy sonicator nghiền. Sán sau khi nghiền, ta đem ly tâm 3500 vòng/50 phút/ 40C. Rồi thu lấy dịch nổi được xem như kháng nguyên thân. Kỹ thuật thường được thực hiện trên đĩa thạch agar hoặc trên phiến kính chứa agar, trong đó kháng nguyên và kháng thể khuếch tán tự do về phía nhau và tạo ra các đường cong kết tủa: Nếu chỉ có một đường kết tủa xuất hiện sẽ cho biết các loại kháng nguyên giống nhau hoặc đồng nhất. Nếu có hai đường kết tủa xuất hiện bắt chéo nhau và cách biệt, chỉ rõ không có phản ứng chéo, hai kháng nguyên khác nhau. Nếu tạo thành một đường kết tủa dạng “cựa gà” cho thấy hai loại kháng nguyên có chung một quyết định kháng nguyên nhưng cũng có những quyết định kháng nguyên khác nhau, nghĩa là giống nhau chỉ một phần. Hình 3.3.5 – Phân tích kết quả từ các miễn dịch khuếch tán kép trên thạch agarose (Ouchterlony) [9] 27  Cách tiến hành: 1g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, pH = 7,2. Đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Sau đó cho kháng nguyên và kháng thể vào giếng tương ứng. Đặt thạch vào buồng ẩm ở 40C. Khoảng 24 – 48 giờ sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. 3.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc hiệu với protein tiết của sán lá gan lớn  Chuẩn bị kháng thể (IgG): Kháng thể kháng Fasciola sp dưới dạng tủa trong (NH4 )2 SO4 45%S được thẩm tích trong dung dịch NaN3 0,05% một lần và trong dung dịch đệm PBS hai lần nhằm loại hết ammonium sunfate. Đo OD280 để xác định nồng độ kháng thể thu được.  Chuẩn bị gel: CN-Br activated Sepharose 4B ( 1g gel khô trương nở thành 3,5 ml gel) được rửa trong dung dịch HCl 1 mM, pH = 3 (200 ml/ g gel) nhằm làm tan dextran, lactose bảo vệ nhóm –CN+.  Cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B: Cho dung dịch kháng nguyên tiết pha trong đệm carbonate vào gel đã trương nở (theo thể tích là 1: 1), lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng để qua đêm, tiến hành ly tâm thu dịch nổi đem đo OD280 nhằm kiểm tra hiệu suất gắn vào gel của kháng nguyên tiết. Rửa tủa với đệm carbonate (dd3) ba lần, sau đó rửa với Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M (đệm Tris – dd4) và NaCl 0,5M, CH3COONa 0,1 M (dd5) ba lần để loại bỏ hết các kháng nguyên tiết không bám vào gel và loại các amin của Tris phản ứng với –CN+ còn thừa trong gel, rửa lại lần cuối với Tris-HCl 0,1 M, NaN3 0,05%, NaCl 0,5M (dd6).  Nén cột: Xử lý cột: Cho đệm Tris vào đầy cột. Xử lý frit với ethanol 100% trong 2 – 3 phút, nén frit vào cột, rửa lại cột đã có frit nhiều lần bằng đệm Tris. Nén cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B vào cột: Cho hỗn dịch gel vào becher sạch, khuấy đều hỗn dịch rồi dùng pipet hút lên cho vào 28 cột có chứa sẵn đệm Tris. Cho đệm Tris vào đầy cột, đặt frit còn lại vào cột và rửa lại một lần nữa bằng đệm Tris.  Giải hấp: Sau khi nén cột ta cho kháng thể đã tinh chế vào cột rồi cũng cân bằng lại cột bằng đệm Tris. Giải hấp kháng thể kháng kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn bằng glycine 0,1M, pH=2.5. Sau khi giải hấp cũng rửa cột với đệm Tris để cân bằng lại cột. 3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc trong phân bệnh nhân Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (Sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Sự liên kết đó biểu hiện hợp thức liên kết hóa học cho phép định lượng sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – Streptavidin – enzyme sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp. Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên OPD B B Streptavidin - PO Polystyrene Giai đoạn gắn bản Giai đoạn phản ứng 29  Gắn IgG kháng nguyên tiết vào giếng nhựa polystyrene Phủ protein lên giếng nhựa: IgG kháng nguyên tiết pha trong đệm NaHCO3 - Na2CO3 0,1 M, pH = 9,6 thu được dung dịch kháng thể có nồng độ 5 µg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch trên. Ủ qua đêm ở 4 0 C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm PBS -thimerosal 0,01%, Tween 20 0,05%, gelatine 0,5% (đệm 1). Dung dịch bão hòa: Bão hòa các vị trí kháng thể không gắn vào giếng bằng dung dịch Tris 0,1 M; NaCl 0,15M; EDTA 1mM; Tween 20 0,05%; gelatine 0,5%; pH = 8 (375 µl/ giếng) trong 60 phút ở 39 0 C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm 1.  Thực hiện phản ứng trên giá rắn: Pha kháng nguyên tiết trong huyết thanh âm thành các dung dịch có nồng độ kháng nguyên tiết lần lượt 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 (ng/ml). Cho các dung dịch vừa pha vào giếng (100 µl/giếng) theo bảng sau: Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân Giếng 1 2 A Huyết thanh âm Huyết thanh âm B 31,25 ng kháng nguyên tiết C 62,5 x D 125 x E 250 x F 500 x G 1000 x H Huyết thanh dương Huyết thanh dương Ủ 390C, 60 phút. Sau đó, rửa ba lần với đệm 1. Cho IgGkháng nguyên tiết-biotin vào (100 µl/giếng). Ủ 39 0 C trong 30 phút. Sau đó rửa ba lần với đệm 1. 30 Cho Streptavidin – peroxydase vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó cho OPD vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó chờ khoảng 15 phút để hiện màu. Rồi cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch H2SO4 1,5N. Sau đó đem đi đọc kết quả bằng máy đọc ELISA Sanofi Pr 2100 ở 1 = 490 nm và 2 = 620 nm. 31 Albumin Papain Mẫu Lysozyme PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta tính được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Nồng độ protein đo được = mlmg /38,1 3 4433,12806,14258,1 4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Hình 4.2.1 – Kết quả điện di để xác định trọng lƣợng phân tử của các protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Giếng 1, 2, 3, 5, 7: Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn với các nồng độ khác nhau. Giếng 4,6 : Protein chuẩn - Albumin ( MW = 66 kDa; Nồng độ 1,53 mg/ml) - Papain (MW = 23 kDa; Nồng độ 2,8 mg/ml) - Lysozyme (MW = 14 kDa; Nồng độ 4,3 mg/ml) 32 Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính giữa đƣờng di chuyển của các protein chuẩn và trọng lƣợng phân tử Nhận xét: Dựa theo hình điện di và đồ thị trên ta thấy trong dịch tiết của sán lá gan lớn có một thành phần protein trội có trọng lượng phân tử xấp xỉ trong khoảng từ 27 – 29 kDa. 4.3 Kết quả miễn dịch khuếch tán kép kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó Kháng nguyên tiết và kháng nguyên thân của sán lá gan lớn được pha loãng bậc hai nồng độ bắt đầu từ ½ với PBS. Cho mẫu vào giếng tương ứng. Ta có kết quả như sau: 33 Kháng nguyên tiết Kháng nguyên thân Hình 4.3 – Kết quả miễn dịch khuếch tán kép phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân Kết quả cho thấy đường tủa giữa kháng nguyên tiết và kháng thể của bệnh nhân bị nhiễm bệnh rõ nét hơn. Cho thấy độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết cao hơn kháng nguyên thân so với kháng thể của Fasciola sp. 4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân Từ 4ml huyết thanh ban đầu của bệnh nhân bị nhiễm Fasciola sp qua giai đoạn tủa kháng thể. Sau khi đo OD280 ta thu được nồng độ kháng thể 21 mg/ml. Bảo quản kháng thể thu được trong dung dịch đệm PBS 1X. 34 4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết IgG kháng nguyên tiết 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 10 20 30 Đoạn 1ml O D 28 0n m Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký ái lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp với protein tiết từ Fasciola gigantica. Sau khi giải hấp với glycine pH = 2.5, các đoạn số 1 đến số 27 được gom lại và hấp phụ quang trung bình đo được là: [IgG kháng nguyên tiết] = 0,293 mg/ml 35 0 0.5 1 1.5 2 0 125 250 375 500 625 750 875 1000 Nồng độ kháng nguyên tiết (ng/ml) Abs 490 n m 4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng phƣơng pháp ELISA Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta có kết quả như sau: Bảng 4.6 – Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng hệ thống ELISA ] Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân Giếng 1 2 A 0.014 0.016 HT - B 0.728 0.726 31.25ng C 1.099 1.124 62.5 D 1.312 1.418 125 E 1.506 1.367 250 F 1.558 1.339 500 G 1.495 1.406 1000 H 0.013 0.012 HT + 36 Kết quả cho thấy hệ thống hoạt động tốt phát hiện được hàm lượng kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân ở giá trị 125 ng/ml. Tuy nhiên ở huyết thanh bệnh nhân dương tính không cho thấy có kháng nguyên tiết có thể đây là trường hợp nhiễm Fasciola sp mãn tính nên lượng kháng nguyên tiết sẽ được bài tiết ra trong phân. Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu hiện sự biến động của kháng nguyên tuần hoàn trong máu và trong phân bệnh nhân nhiễm Fasciola sp [11] 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau khi thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và xác định nồng độ protein trong dịch tiết bằng phương pháp Bradford, ta thu được xấp xỉ 6,5 mg protein tiết/ 1 con sán/ 24 giờ. Dịch tiết của sán lá gan lớn chứa những thành phần protein trội có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 27-29 kDa. Đặc tính kháng nguyên tiết trong thành phần protein này đặc hiệu hơn so với kháng nguyên thân của Fasciola sp nên có thể sử dụng để chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn ở người chính xác hơn. Với protein tiết, một giá sắc ký ái lực đã được thực hiện. Giá sắc ký này đã cho phép tinh chế từ huyết thanh bệnh nhân kháng thể (IgG), đặc hiệu với protein tiết của sán. Các kháng thể này đã được sử dụng để thực hiện một hệ thống thử nghiệm miễn dịch cộng hợp enzyme (ELISA) để sử dụng trong chẩn đoán. 5.2 Đề nghị Gia tăng độ nhạy của phản ứng ELISA. Sử dụng kháng nguyên tiết để phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp. Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên tiết trong phân bệnh nhân. Xác định lại hoạt tính và tinh chế enzyme cystein-protease trong dịch tiết của sán lá gan lớn. Trên cơ sở đó ứng dụng những kỹ thuật phân tử để nghiên cứu những đặc tính của enzyme trong mục đích chẩn đoán và điều chế vaccine chống sán lá gan lớn. 38 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt 1. Trần Thị Kim Dung. Chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch men. Chuyên ngành Ký Sinh Trùng học. Luận án Tiến sĩ khoa học Y Dược. Trường đại học Y Dược TP HCM, 1995. 2. Trần Thị Kim Dung, Trần Vinh Hiển, và Phan Anh Tuấn. Chẩn đoán bệnh sán lá lớn ở gan Fasciola gigantica bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch ELISA và huỳnh quang. Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Công trình nghiên cứu khoa học, trang 201-204, 1994. 3. Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung, Nguyễn Hữu Chí, Phan Hữu Danh, Phạm Thị Hạnh. Bệnh do sán lá lớn ở gan Fasciola sp trên người tại Việt Nam. Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Số đặc biệt chuyên đề Ký Sinh Trùng. Phụ bản của tập 5, số 1, trang 75-78, 2001. 4. Phan Địch Lân. Bệnh sán lá gan trâu bò do Fasciola gigantica ở phía Bắc Việt Nam. Luận án Phó tiến sĩ thú y. H. Bộ Nông Nghiệp, 1980. Phần tiếng nƣớc ngoài 5. A.Y. SHEHAB et al, 1999. Serogiagnosis and assessment of antigens in the sera of patients with fascioliasis by IELISA.Tropical Medicine and International Health Volume 4, N 0 10; pp 686 – 690. Medical Research Institute, University of Alexandria, Egypt. 6. B. GÖNEç. H. O. SARIMEHMETOĞLU. M. KARA. F. KIRCALI, 2003. Comparison of Crude and Excretory/Secretory Antigens for the Diagnosis of Fasciola hepatica in Sheep by Western Blotting. Turk J Vet Anim Sci. 28 (2004) 943-949, Turkey. 39 7. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. A ral. Biochem. 72: 248-254. 8. Peter R.Collins, Colin M. Stack et al, 2004. Cathepsin L1, the Major Protease Involved in Live Fluke (Fasciola hepatica) Virulence. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, N o . 17, Issue of April 23, pp 17038-17046, USA. 9. Cooper, Terrance G.(1977). The tools of Biochemistry. John Willey and Sons, Interscience publication, United State of America. pp 36-307. 10. John P. Dalton, Sharon J. Andrew. Induction of protective immunity in cattle against infection with Fasciola hepatica by vaccination with cathepsin L proteinase and with Hemoglobin. Infection and Immunity, Dec. 1996, pp 5066- 5074. United Kingdom. 11. ESPINO et al. Dynamics of Antigenemia and Coproantigens during a human Fasciola hepatica Outbreak. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 1998, pp 2723 – 2726. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, Ciudad de La Habana, Cuba. 12. ESPINO et al, 1990. Detection of Circulating Excretory Secretory Antigens in Human Fascioliasis by Sandwich Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. Jounal of clinical microbiology, pp 2637-2640. Instituto Medicina Tropical “Pedor Kouri” Apartado 601 Zona 13, Havana, Cuba.. 13. Louis Nguyen Anh Van (1985). Essai d’enseignement des cycles parasitaires par le graphisme. Thèse pour le Doctorat en Médecine. Université de Paris. Sud. p28. 14. Ortiz, P.L. Claxton. J. R Clarkson, M.J. Mc Garry, J. Williams, D.J. L . The specificity of antibody responses in cattle naturally exposed to Fasciola hepatica. Vet. Parasit 2000:93:121:124. 40 Internet 15. 16. 17. 18. 41 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi sán lá gan Fasciola gigantica để thu đƣợc kháng nguyên tiết Môi trường RPMI 1640 1X (104,3 g/10 lít) bổ sung 2g NaHCO3/1lít Thành phần Đơn vị (mg/l) Ca(NO3)2.4H2O KCl MgSO4 (anhydrid) NaCl Na2HPO4(anhydrid) D-Glucose Glutathione Rouge de Phénol L-Arginine HCl L-Asparagine Acide L-Aspartique L-Cystine. 2HCl Acide L-Glutamique L-Glutamine Glycine L-Histidine L-Hydroxyproline L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Méthionine L-Phénylalanine 100,00 400,00 48,84 6000,00 800,00 2000,00 1,00 5,00 241,86 50,00 20,00 65,15 20,00 300,00 10,00 15,00 20,00 50,00 50,00 40,00 15,00 15,00 42 L-Proline L-Sérine L-Thréonine L-Tryptophane L-Tyrosine L-Valine D-Biotine Pantothénate de Calcium D Chlorure de Choline Acide Folique i-Inositol Nicotinamide Acid Para-aminobenzoique Pyridoxal HCl Riboflavine Thiamine HCl Vitamine B12 20,00 30,00 20,00 5,00 20,00 20,00 0,20 0,25 3,00 1,00 35,00 1,00 1,00 1,00 0,20 1,00 0,005 (Theo Catalogue 1996-97 Culture Cellulaire – Hãng Gibco BRL. Code 51800 – 035. Produced in U. K by life Technologies LTD, P. O. Box 35 PAISLEY). Pha 500 ml môi trường RPMI 1640 1X (m = 5,215g + 1g NaHCO3). Chỉnh pH = 7,3 bằng HCl đặc. Bổ sung 300 µl Penicillin 1000000U (nồng độ 200 000 U / 1 ml). Thêm vào 300 µl Streptomycin 1000000 µg (nồng độ 200 mg / 1 ml). Cho dung dịch qua lọc vô trùng 0,22 µm để khử trùng. Phân phối đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml giữ trong 40C. Tất cả các thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng. 43 Hình - Các ống nghiệm chứa môi trƣờng RPMI 1640 dùng để nuôi sán bên ngoài vật chủ Phụ lục 2: Hình cột sắc ký ái lực để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn 44 Phụ lục 3: Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan) Phụ lục 4: Máy đọc Elisa Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur 45 Phụ lục 5: Các giếng thực hiện phản ứng ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh của bệnh nhân