Tiểu luận PCR (polymerase chain reaction)

gian g¾n måi vµ viÖc thiÕt kÕ måi. ChiÒu dµi vµ tr×nh tù måi lµ mét tham sè cã ý nghÜa v« cïng quan träng ®¶m b¶o sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i. NhiÖt ®é nãng ch¶y cña mét acide nucleic m¹ch kÐp t¨ng lªn theo chiÒu dµi cña nã còng nh­ lµ sè l­îng (G+C). C«ng thøc ®¬n gi¶n ®Ó tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (temperature melting-Tm) cña mét ®o¹n DNA kÐp lµ: Tm (oC) = 4(G + C) + 2(A + T) Do ®ã, nhiÖt ®é g¾n måi (annealing temperature-Ta) cho mét ph¶n øng PCR nhÊt ®Þnh phô thuéc trùc tiÕp vµo thµnh phÇn vµ chiÒu dµi måi. NhiÖt ®é Ta nªn chän thÊp h¬n kho¶ng 5oC so víi nhiÖt ®é Tm thÊp nhÊt cña cÆp måi ®­îc sö dông (Innis vµ GelfDNA, 1990). Rychlik vµ nhiÒu ng­êi kh¸c (1990) ®· chØ ra c¸ch xö sù cña Ta. Hä cho r»ng nÕu t¨ng nhiÖt ®é Ta lªn 1oC sau mçi chu tr×nh th× tÝnh ®Æc hiÖu cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i vµ sè l­îng s¶n phÈm (1kb chiÒu dµi) ®Òu t¨ng lªn. Mét hÖ qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ thÊp lµ mét hay c¶ hai ®o¹n måi l¹i g¾n vµo c¸c tr×nh tù kh¸c chø kh«ng ph¶i tr×nh tù ®Ých, do c¸c b¾t cÆp sai mét baz¬ hay sù g¾n måi mét phÇn. §iÒu nµy kh«ng g©y ¶nh h­ëng g× nÕu ta chØ khuÕch ®¹i c¸c tr×nh tù ®Ých th©n thuéc hoÆc t­¬ng tù nhau. Tuy nhiªn, ®iÒu nµy cã thÓ dÉn ®Õn viÖc khuÕch ®¹i “kh«ng ®Æc hiÖu” vµ hËu qu¶ lµ sè l­îng c¸c s¶n phÈm mong muèn bÞ gi¶m xuèng. Mét hËu qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ cao lµ rÊt Ýt s¶n phÈm ®­îc t¹o ra do kh¶ n¨ng g¾n måi bÞ gi¶m xuèng. Mét ®iÒu quan träng kh¸c cÇn c©n nh¾c lµ mét cÆp måi víi nhiÖt ®é Ta kh«ng thÝch hîp sÏ kh«ng bao giê cho s¶n phÈm duy nhÊt víi sè l­îng ®¸ng kÓ, vµ cßn cã thÓ dÉn ®Õn sù khuÕch ®¹i kh«ng ®èi xøng cã nghÜa lµ sù khuÕch ®¹i sîi ®­îc g¾n måi hiÖu qu¶ h¬n. Sù g¾n måi kh«ng thÓ diÔn ra trong thêi gian dµi: hÇu hÕt c¸c måi chØ g¾n hiÖu qu¶ ®­îc trong 30 gi©y hay Ýt h¬n, trõ tr­êng hîp nhiÖt ®é Ta rÊt gÇn nhiÖt ®é Tm hoÆc c¸c måi dµi bÊt th­êng. H×nh trªn minh ho¹ ¶nh h­ëng cña nhiÖt ®é g¾n måi dÕn tÝnh ®Æc hiÖu vµ hiÖu suÊt khuÕch ®¹i cña papillomavirus ng­êi type 16 (Human papillomavirus type 16, HPV-16) (Williamson vµ Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171). Plasmide vµ khu«n DNA mÉu ®­îc khuÕch ®¹i ë c¸c nhiÖt ®é g¾n måi kh¸c nhau nh­ ®· chØ ra ë trªn. Chó ý r»ng trong khi plasmide ®­îc khuÕch ®¹i trong kho¶ng tõ 37oC ®Õn 55o C th× HPA, ADN chØ ®­îc khuÕch ®¹i ®Æc hiÖu ë 50oC. 6.4 Thêi gian vµ nhiÖt ®é kÐo dµi m¹ch: Th«ng th­êng ng­êi ta tiÕn hµnh ë 70oC - 72oC trong 0,5 ®Õn 3 phót. Trong khi ®ã, Taq ho¹t ®éng thùc sù ®Æc hiÖu ë 37oC, nhiÖt ®é rÊt gÇn víi nhiÖt ®é ho¹t ®éng cña ®o¹n Klenow cña E.coli DNA polymerase I. §©y qu¶ lµ mét nghÞch lý, lµm thÕ nµo mµ c¸c ®o¹n måi chØ g¾n vµo m¹ch khu«n ë nhiÖt ®é tèi ­u cña nã l¹i cã thÓ ®­îc kÐo dµi ë nhiÖt ®é cao mét c¸ch ®¸ng kÓ nh­ vËy. C©u tr¶ lêi lµ sù kÐo dµi m¹ch x¶y ra ngay tõ khi b¾t ®Çu cã sù g¾n måi, thËm chÝ nÕu ®iÒu nµy chØ x¶y ra trong thêi gian rÊt ng¾n ngñi, th× nã còng dÉn ®Õn sù æn ®Þnh ®¸ng kÓ. Ho¹t ®éng nµy x¶y ra tèi ­u ë kho¶ng 70oC vµ sù më réng måi diÔn ra víi tèc ®é tèi ®a lµ 100 baz¬/gi©y. Thêi gian kho¶ng mét phót lµ ®ñ ®Ó sù khuÕch ®¹i tr×nh tù 2kb lµ ®¸ng tin cËy (Innis vµ GelfDNA, 1990). C¸c s¶n phÈm dµi h¬n th× cÇn thêi gian l©u h¬n: 3 phót cho s¶n phÈm 3kb hay dµi h¬n. ViÖc kÐo dµi thêi gian lµ cÇn thiÕt trong nh÷ng chu tr×nh cuèi khi mµ nång ®é s¶n phÈm v­ît qu¸ nång ®é enzyme (>1nM), vµ khi dNTP vµ/hoÆc sù suy gi¶m sè l­îng måi cã thÓ trë nªn h¹n chÕ. 6.6 Sè chu tr×nh. Sè l­îng chu tr×nh cÇn thiÕt ®Ó t¹o ra b¨ng nh×n thÊy ®­îc trªn gel phô thuéc phÇn lín vµo nång ®é ADN ®Ých ban ®Çu: Innis vµ GelfDNA (1990) ®Ò xuÊt khuÕch ®¹i 40 - 45 chu tr×nh ®èi víi 50 ph©n tö ®Ých, vµ 25-30 chu tr×nh cho 3x105 ph©n tö cïng nång ®é. Sù kh«ng t­¬ng xøng nµy do c¸i gäi lµ hiÖu øng b»ng (plateau effect) g©y nªn. §©y lµ sù gi¶m tèc ®é t¨ng cña sù tÝch luü s¶n phÈm theo cÊp sè mò ë nh÷ng giai ®o¹n cuèi cña PCR, khi mµ nång ®é s¶n phÈm ®¹t ®Õn 0,3 - 1,0 nM. Cã thÓ sù ph©n r· cña c¸c chÊt ph¶n øng (dNTPs, enzyme), sù depletion cña chÊt ph¶n øng (måi, dNTPs - c¸i ®Çu lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm ng¾n, c¸i sau lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm dµi), sù øc chÕ ®Çu s¶n phÈm (end-product) (sù h×nh thµnh Pyrophosphate), sù c¹nh tranh cña c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu víi chÊt tham gia ph¶n øng, sù c¹nh tranh cña viÖc t¸i g¾n måi cña c¸c s¶n phÈm nång ®é cao (10nM) víi viÖc g¾n måi (Innis vµ GelfDNA, 1990). NÕu s¶n phÈm mong muèn kh«ng ®­îc t¹o ra sau 30 chu tr×nh, tèt h¬n lµ lÊy mét mÉu nhá (1ml) cña hçn hîp ®· khuÕch ®¹i lµm hçn hîp ph¶n øng míi, ®em khuÕch ®¹i 20-30 lÇn chø kh«ng nªn tiÕp tôc ch¹y thªm nhiÒu chu tr×nh. Trong mét sè tr­êng hîp khi mµ nång ®é khu«n h¹n chÕ, ®iÒu nµy cã thÓ t¹o ra s¶n phÈm tèt trong khi viÖc tiÕp tôc chu tr×nh ®Õn 40 lÇn hay h¬n kh«ng lµm ®­îc. Mét biÕn sè quyÕt ®Þnh sè l­îng chu tr×nh lµ PCR måi lµm tæ. Sù khuÕch ®¹i PCR ®­îc thùc hiÖn víi mét tËp hîp c¸c måi, sau ®ã s¶n phÈm nµo ®ã ®­îc lÊy ra - cã hay kh«ng cã sù bá thuèc thö- ®Ó khuÕch ®¹i l¹i, vãi tËp hîp c¸c måi n»m bªn trong, hay cßn gäi lµ måi lµm tæ. Qu¸ tr×nh nµy lµm t¨ng møc ®é cña tÝnh ®Æc hiÖu, cã nghÜa lµ tÊt c¶ c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu ®­îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y ®Çu tiªn sÏ kh«ng ®­îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y thø hai. §iÒu nµy ®­îc minh ho¹ nh­ sau:  Thêi gian cho mét chu kú khëi ®Çu môc ®Ých bung liªn kÕt cña chuçi xo¾n kÐp ADN lµ kh«ng v­ît qu¸ 5 phót. §èi víi 25-40 chu kú tiÕp theo, thêi gian cho giai ®o¹n 1 (bung liªn kÕt ) lµ 10 gi©y – 2 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 2 (måi b¸m) kh«ng qu¸ nhanh hoÆc qu¸ l©u, th«ng th­êng d­íi 1 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 3 (tæng hîp) tuú thuéc vµo ®é dµi vïng ADN cÇn nh©n lªn, nh­ng nãi chung theo qui luËt, 1 phót cho 1 kb (1000 nucleotide). VÝ dô cÇn cã s¶n phÈm lµ 3 kb, thêi gian thÝch hîp lµ 3 phót. Thêi gian dµi h¬n kh«ng ¶nh h­ëng lín ®Õn ADN cã ®é dµi ng¾n h¬n. Trong thùc tÕ, ph¶n øng ®­îc thùc hiÖn trong 25-40 chu kú, vµ kh«ng v­ît qu¸ 40 chu kú cho mét ph¶n øng PCR. Së dÜ nh­ vËy lµ v× ph¶n øng PCR diÕn tiÕn qua hai giai ®o¹n: trong giai ®o¹n ®Çu sè l­îng b¶n sao t¨ng theo cÊp sè nh©n tØ lÖ víi l­îng mÉu ban ®Çu, sau ®ã hiÖu qu¶ khuÕch ®¹i gi¶m h¼n v× nh÷ng nguyªn nh©n sau: - Sù ph©n huû x¶y ra vµ c¹n kiÖt c¸c thµnh phÇn cña ph¶n øng - Cã sù xuÊt hiÖn c¸c s¶n phÈm phô øc chÕ ph¶n øng. - C¸c b¶n sao võa ®­îc tæng hîp kh«ng kÕt hîp víi c¸c cÆp måi mµ b¾t cÆp víi nhau. Ph¶n øng PCR Ýt khi ®­îc thùc hiÖn d­íi 25 chu kú, v× nh­ thÕ sè l­îng nh©n b¶n sÏ Ýt vµ l­îng ADN thu ®­îc trong s¶n phÈm PCR thÊp. Sè chu kú cho mét ph¶n øng phô thuéc vµo sè l­îng b¶n mÉu ban ®Çu. VÝ dô, nÕu sè l­îng b¶n mÉu lµ 105 th× cÇn 25-30 chu kú, nÕu sè l­îng b¶n mÉu lµ 102-103 th× sè chu kú ph¶i lµ 35-40. 7. YÕu tè chu tr×nh nhiÖt Mét yÕu tè quan träng ®¶m b¶o sù thµnh c«ng cña ph¶n øng PCR lµ nhiÖt ®é cña chu tr×nh nhiÖt ë giai ®o¹n thø 2 khi måi b¸m vµo khu«n (giai ®o¹n måi b¸m). Mét kinh nghiÖm cã tÝnh qui luËt lµ nhiÖt ®é cho måi b¸m ph¶i thÊp h¬n nhiÖt ®é nãng ch¶y cña cÆp måi lµ Ýt nhÊt 4o C. 8. N­íc N­íc sö dông cho ph¶n øng PCR ph¶i thËt tinh khiÕt, kh«ng chøa bÊt kú ion nµo, kh«ng chøa enzyme ph©n huû ADN (ADNaza), ph©n huû ARN (ARnaza), enzyme giíi h¹n c¾t Adn (endonucleaza) vµ bÊt kú c¸c thµnh phÇn nµo kh¸c. Ion kh¸c l¹ sÏ ¶nh h­ëng nång ®é dung dÞch ®Öm trong ph¶n øng, c¸c lo¹i enzyme sÏ pha huû hay c¾t bá ADN lµm khu«n hoÆc s¶n phÈm PCR. 9. ThiÕt bÞ vµ dông cô Thùc chÊt mét thiÕt bÞ dïng ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR chØ cÇn ®¸p øng ®­îc yªu cÇu thay ®æi nhiÖt ®é thËt nhanh vµ chÝnh x¸c. c¸c thiÕt bÞ hiÖn nay ®· ®­îc c¶i tiÕn ®Ó tr¸nh tèi ®a sù bèc h¬i n­íc trong qu¸ tr×nh ph¶n øng, hay cho phÐp tiÕn hµnh ph¶n øng PCR ngay ë trªn m« tÕ bµo,… Tuy nhiªn mçi kiÓu thiÕt bÞ cã ®Æc ®iÓm khuÕch ®¹i riªng nªn mäi thÝ nghiÖm cña mét nghiªn cøu cÇn ®­îc tiÕn hµnh trªn cïng mét lo¹i thiÕt bÞ. H¬n n÷a èng nghiÖm dïng cho c¸c phan øng cña cïng mét nghiªn cøu ph¶i thuéc cïng mét kiÓu v× ®Æc tÝnh truyÒn nhiÖt cña c¸c èng nµy cóng nh­ ®é tiÕp xóc gi÷a èng vµ bé phËn t¹o nhiÖt cña thiÕt bÞ cã ¶nh h­ëng lín ®Õn qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i. VIII . C¸c h¹n chÕ cña ph¶n øng PCR Do ®é nh¹y rÊt cao cña PCR dång thêi víi thao t¸c rÊt ®¬n gi¶n, ng­êi ta cã khuynh h­íng sö dông ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó gi¶i quyÕt nhiÒu vÊn ®Ò. Tuy nhiªn ph­¬ng ph¸p cã nhiÒu mÆt h¹n chÕ vµ ®ßi hái sù thËn träng ®Æc biÖt khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm còng nh­ khi ph©n tÝch kÕt qu¶. Cã 3 vÊn ®Ò lín khi sö dông kü thuËt PCR: 1. Trong thùc nghiÖm, kÝch th­íc cña tr×nh tù cÇn khuÕch ®¹i lµ giíi h¹n ®Çu tiªn. Trõ vµi tr­êng hîp rÊt c¸ biÖt, ph­¬ng ph¸p PCR kh«ng ho¹t ®éng ®­îc víi nh÷ng ®o¹n ADN lín h¬n 3 kb. ViÖc sö dông PCR ®èi víi c¸c ®é dµi d­íi 1,5 kb cho kÕt qu¶ tèt. Víi nh÷ng ®é dµi lín h¬n, ®iÒu kiÖn tèi ­u cho ph¶n øng ph¶i ®­îc x¸c ®Þnh qua thùc nghiÖm. 2. Sù ngo¹i nhiÔm lµ vÊn ®Ò lín nhÊt ®Æt ra ®èi víi PCR, g¾n liÒn víi kh¶ n¨ng khuÕch ®¹i b¶n sao cña ph­¬ng ph¸p nµy. VÊn ®Ò ®Æc biÖt cÊp thiÕt trong nh÷ng øng dông vÒ chÈn ®o¸n, dù phßng v× hËu qu¶ cã thÓ rÊt nghiÖm träng. Nguån ngo¹i nhiÔm lín nhÊt th­êng lµ c¸c s¶n phÈm khuÕch ®¹i cña nh÷ng lÇn thao t¸c tr­íc. Ng­êi ta chøng minh ®­îc r»ng viÖc më n¾p c¸c èng nghiÖm sau mçi lÇn khuÕch ®¹i trong mét kho¶ng kh«ng gian kÝn nh­ phßng thÝ nghiÖm sÏ khiÕn cho c¸c ph©n tö ®· ®­îc khuÕch ®¹i tho¸t ra khái èng nghiÖm bay l¬ löng trong kh«ng khÝ vµ b¸m vµo t­êng, cöa, thiÕt bÞ dông cô… råi nhiÔm vµo c¸c ph¶n øng tiÕn hµnh sau ®ã. Cã thÓ khÊc phôc c¸c vÊn ®Ò nµy b»ng mét sè biÖn ph¸p sau; - C¸c c«ng ®o¹n thao t¸c kh¸c nhau nh­ thiÕt lËp ph¶n øng PCR vµ ph©n tÝch c¸c s¶n phÈm khuÕch ®¹i ph¶i ®­îc tiÕn hµnh ë nh÷ng ®Þa ®iÓm c¸ch xa nhau. - Dông cô dïng ®Ó thiÕt lËp ph¶n øng kh«ng sö dông vµo c¸c thao t¸c kh¸c. ®Çu tip sö dông víi micropipette ph¶i cã líp läc tr¸nh sù nhiÔm ®Çu micropipette bëi c¸c ph©n tö khuÕch ®¹i khi hót dung dÞch ph¶n øng. - Dïng tia tö ngo¹i ®Ó lo¹i bá c¸c ph©n tö cßn l¹i tõ c¸c lÇn khuÕch ®¹i tr­íc. - TÊt c¶ mäi thµnh phÇn ph¶n øng ®Òu ®­îc chia thµnh nh÷ng l­îng nhá, tÝnh to¸n sao cho ®ñ víi 1 , 2 lÇn thao t¸c. - Ngoµi ra c¸c h·ng s¶n xuÊt cßn tung ra thÞ tr­êng nh÷ng hÖ thèng cho phÐp lo¹i bá hoµn toµn sù ngo¹i nhiÔm, vÝ dô h·ng Perkin - Elmer- Cetus ®Ò xuÊt viÖc sö dông dUTP thay v× dTTP; viÖc thay thÕ nµy kh«ng ¶nh h­ëng ®Õn ph¶n øng. Tr­íc mçi lÇn ph¶n øng kÕ tiÕp, ng­êi ta cho thªm vµo dung dÞch ph¶n øng uracylglycolase; enzyme nµy sÏ ph©n huû tÊt c¶ c¸c ADN cã mang dUTP nhiÔm tõ lÇn tr­íc. §ång thêi, enzyme sÏ bÞ ph©n huû bëi nhiÖt ngay tõ lÇn biÕn tÝnh ®Çu tiªn. BÊt lîi cña c¸c hÖ thèng nµy lµ gi¸ thµnh cao. 3. C¸c sai sãt g©y ra do Taq polymerase. Sù sao chÐp bëi Taq polymerase cho tû lÖ kh¸ cao (104 nghÜa lµ cø 10.000 nucleotide th× enzyme g¾n sai 1 nucleotide). §Æc tÝnh nµy kh«ng nghiªm träng nÕu ta chØ cÇn xem xÐt kÝch th­íc hay sù cã mÆt cña mét s¶n phÈm khuÕch ®¹i, nh­ng cã ý nghÜa lín nÕu cÇn x¸c ®Þnh chÝnh x¸c tr×nh tù nucleotide cña ADN. Ta kh«ng thÓ lo¹i bá hoµn toµn c¸c sai sãt nµy mµ chØ cã thÓ gi¶m bít, vÝ dô nh­ ®¶m b¶o sù c©n b»ng nång ®é c¸c nucleotide trong ph¶n øng x¸c ®Þnh tr×nh tù cña nhiÒu s¶n phÈm khuÕch ®¹i tõ nhiÒu thao t¸c riªng biÖt, so s¸nh tr­íc khi ®i ®Õn tr×nh tù chÝnh thøc. * §é tin cËy cña kü thuËt PCR/RT- PCR Còng nh­ tÊt c¶ c¸c qu¸ tr×nh sinh häc kh¸c, t¸i b¶n ADN lµ mét qu¸ tr×nh kh«ng hoµn h¶o, ®«i khi enzyme ADN polymerase còng nh©n nhÇm mét nucleotide kh«ng bæ sung vµo chuçi ®ang kÐo dµi cña m×nh, tû lÖ nµy trong tù nhiªn lµ 1/106 . Trong tÕ bµo sinh vËt, nh÷ng baz¬ kh«ng bæ sung nµy ®­îc mét hÖ thèng söa sai ngay, nh­ng trong thÝ ngiÖm (invitro), Taq-polymerase kh«ng cã kh¶ n¨ng söa ch÷a nh÷ng baz¬ nh©n nhÇm nµy. Do vËy cø tæng hîp 2x104 nucleotide b»ng PCR cã thÓ cã mét nucleotide kh«ng chÝnh x¸c. Tuy nhiªn sai sãt nµy kh«ng trÇm träng l¾m v× trong èng nghiÖm cïng mét lóc cã tËp hîp nhiÒu ph¶n øng, cïng nh©n mét ®o¹n ADN gièng nhau nªn sè ADN cã mét nucleotide sai sãt lµ kh«ng lín, vµ sÏ ®­îc ®iÒu chØnh chÝnh x¸c sau khi so s¸nh c¸c chuçi kh¸c nhau cña cïng ®o¹n gen. Tuy vËy nÕu dïng ADN nµy lµm vËt liÖu ban ®Çu ®Î nh©n tiÕp vect¬ trong vi khuÈn E.coli cung cã thÓ g©y nguy hiÓm sai kh¸c víi vËt liÖu ban ®Çu. V× mçi dßng v« tÝnh plamsmide chøa mét ®o¹n ADN ®­îc nh©n qua PCR, nÕu ®o¹n ADN ®ã chøa mét vµi nucleotide nhÇm th× tÊt c¶ c¸c mÉu kh¸c tõ dßng nµy ®Òu cã chung mét ®ét biÕn tt­¬ng tù. §Ó kh¾c phôc cÇn mét l­îng lín ADN nguyªn b¶n vµ gi¶m sè chu kú nh©n xuèng ®Ó chØ thu ®­îc Ýt sè ph©n tö cÇn nh©n lªn, vµ dÜ nhiªn sau khi cã chuçi qua gi¶i tr×nh tù, nhÊt thiÕt cÇn so s¸nh kiÓm tra b»ng nhiÒu ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau. IX. C¸c lÜnh vùc øng dông cña ph¶n øng PCR Ph¶n øng chuçi trïng hîp tõ khi ®­îc Kary Mullis ®Ò xuÊt vµ hoµn thiÖn, ®· cã nh÷ng øng dông hÕt søc réng r·i bao trïm nhiÒu lÜnh vùc quan träng trong nghiªn cøu vµ trong khoa häc c«ng nghÖ vµ trong ®êi sèng x· héi. 1. Trong nghiªn cøu khoa häc: Kü thuËt PCR gióp Ých h÷u hiÖu cho viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotide cña c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n; cã thÓ sö dông PCR ®Ó t¸c dßng nh÷ng ®o¹n ADN ®Æc hiÖu, mÆc dï trong nhiÒu tr­êng hîp kh«ng cÇn ®Õn PCR; nã gióp ph¸t hiÖn ®ét biÕn, cho phÐp ph©n tÝch liªn kÕt gen tõ nh÷ng tÕ bµo riªng lÎ; gióp nghiªn cøu qu¸ tr×nh tiÕn ho¸ ë møc ph©n tö. ThËm chÝ gióp phôc håi nh÷ng gen ®· tån t¹i c¸ch ®©y hµng chôc triÖu n¨m. 2. Trong chän gièng vËt nu«i vµ c©y trång ®Æc biÖt ®èi víi ®éng vËt vµ thùc vËt bËc cao, vèn tr­íc ®©y viÖc lùa chän cÆp cha mÑ lµm gièng lµ rÊt khã kh¨n, cÇn nhiÒu n¨m nay kü thuËt PCR cho phÐp thùc hiÖn chØ trong vµi ngµy, thËm chÝ vµi giê. 3. Trong Y häc PCR cã thÓ gióp chÈn ®o¸n chÝnh x¸c c¸c bÖnh nhiÔm trïng do vi khuÈn, c¸c bÖnh do virus, do nÊm, kÓ c¶ HIV-AIDS, chÈn ®o¸n sím vµ theo dâi ®iÒu trÞ ung th­. Trong t­ vÊn di truyÒn Y häc, PCR cho phÐp chÈn ®o¸n nhanh, chÝnh x¸c c¸c bÖnh di truyÒn kÓ c¶ chÈn ®o¸n tr­íc sinh giíi tÝnh vµ c¸c dÞ tËt bÈm sinh cã thÓ tõ khi thai míi ®­îc 8 tuÇn tuæi vµ ®iÒu quan träng lµ kh«ng cÇn chäc èi, chØ cÇn lÊy mét giät m¸u ngo¹i vi cña ng­êi mÑ ®Ó lµm mÉu thÝ nghiÖm. 4. Trong khoa häc h×nh sù, kü thuËt PCR gióp cho chÈn ®o¸n nhanh, chÝnh x¸c thñ ph¹m chØ tõ mét vÕt m¸u kh«, mét sîi tãc hoÆc mét sinh phÈm nµo ®ã nh­ tinh trïng… mµ thñ ph¹m ®· ®Ó l¹i trªn hiÖn tr­êng. Ngoµi ra kü thuËt PCR gióp cho ®iÒu tra quan hÖ huyÕt thèng cha con, «ng ch¸u trong nh÷ng vô tranh chÊp con c¸i, nh÷ng tr­êng hîp ®i t×m ng­êi thõa kÕ rÊt hay ®­îc dïng trong gi¸m ®Þnh Y ph¸p. HiÖn nay viÖc nghiªn cøu vµ sö dông c¸c locus cã sè ®o¹n lÆp kh¸c nhau (VNTRs) dïng trong c«ng t¸c khoa häc h×nh sù, y häc chÈn ®o¸n bÖnh vµ ®Ó x¸c ®Þnh c¸c quan hÖ huyÕt thèng ®ang ®­îc øng dông hÕt søc réng r·i. Ph­¬ng ph¸p sö dông PCR ®Ó nh©n b¶n c¸c locut nµy ®· lµm gi¶m ®¸ng kÓ thêi gian tiÕn hµnh thÝ nghiÖm vµ n©ng cao ®­îc ®é chÝnh x¸c cña kÕt qu¶ so víi c¸c ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu truyÒn thèng nh­: c¨n cø vµo h×nh d¸ng bªn ngoµi, c¸c nhãm m¸u hay c¸c hÖ isozym... VÝ dô: Ph¶n øng PCR Dùa trªn nguyªn lý cña Kary Mullis víi c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu cho locut D1S80 x¸c ®Þnh c¸c quan hÖ huyÕt thèngMÑ Con Bè Marker Cã quan hÖ huyÕt thèng 517 506 396 334 298 1018 529 497 481 449 MÉu 1 MÉu 2 Marker Kh«ng cã quan hÖ huyÕt thèng 517 506 396 344 1018 545 497 433 298 220 201 154 134 529 449 5 . PCR ®èi víi søc khoÎ con ng­êi vµ dù ¸n hÖ gen ng­êi. PCR ®· nhanh chãng trë thµnh mét c«ng cô thiÕt yÕu trong viÖc c¶i thiÖn søc khoÎ vµ cuéc sèng con ng­êi. Y häc nghiªn cøu vµ Y häc l©m sµng ®ang thõa h­ëng lîi Ých cña PCR ®èi víi hai lÜnh vùc chÝnh: ph¸t hiÖn bÖnh nhiÔm khuÈn, ph¸t hiÖn sù thay ®æi vµ ®ét biÕn gen, ®Æc biÖt lµ gen ng­êi. Bëi v× PCR cã thÓ khuÕch ®¹i mét l­îng rÊt nhá ADN thËm chÝ chØ tõ mét tÕ bµo. C¸c thÇy thuèc vµ c¸c nhµ nghiªn cøu cã thÓ kiÓm tra tõ mét tinh trïng. Ph­¬ng ph¸p nµy cã lîi trong viÖc t×m kiÕm c¸c c¬ quan bÖnh mµ rÊt khã trong viÖc nu«i cÊy nh­ mét sè loµi vi khuÈn, nÊm, vivrus, v× nã t¹o ra mét khèi l­îng chÊt liÖu di truyÒn cña sinh vËt ®ã cã thÓ ph©n tÝch ®­îc ®Ó x¸c ®Þnh. VÝ dô ph¸t hiÖn virus AIDS sím trong vµi tuÇn ®Çu tiªn sau khi nhiÔm vµ h¬n lµ xÐt nghiÖm ELISA tiªu chuÈn. PCR t×m kiÕm trùc tiÕp ADN duy nhÊt tõ virus, thay v× ph­¬ng ph¸p xÐt nghiÖm tiªu chuÈn ph¶i t×m gi¸n tiÕp b»ng chøng xuÊt hiÖn cña virus tõ viÖc t×m kiÕm nh÷ng kh¸ng thÓ cña c¬ thÓ sinh ra ®Ó chèng l¹i sù nhiÔm bÖnh cña virus. PCR còng cã thÓ chÝnh x¸c h¬n xÐt nghiÖm chuÈn. Nã ®ang t¹o ra mét sù kh¸c nhau, vÝ dô nh­ trong mét tæn th­¬ng, ®au vµ th­êng mét sù rñi ro cña ®øa trÎ nh­ nhiÔm khuÈn tai gi÷a g©y ra viªm tai. Kü thuËt PCR ®· ph¸t hiÖn ADN cña vi khuÈn trong dÞch tai gi÷a cña ®øa trÎ bÞ viªm tai, trong khi nu«i cÊy cã thÓ kh«ng ph¸t hiÖn ra. BÖnh Lyme, ®au do viªm khíp g©y ra bëi vi khuÈn truyÒn qua vÕt c¾n cña con ve, bÖnh nµy ®­îc chÈn ®o¸n dùa trªn nh÷ng triÖu chøng c¬ b¶n. Nh­ng PCR cã thÓ tËp trung vµo ADN tõ nh÷ng sinh vËt chøa trong dÞch khíp cho phÐp ®iÒu trÞ nhanh ®Ó cã thÓ ng¨n chÆn ®­îc nh÷ng biÕn chøng nghiªm träng. PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ nh¹y vµ ®Æc hiÖu nhÊt ®èi víi vi kuÈn Helicobacter Pylory, bÖnh hiÖn nay hÇu hÕt g©y ra loÐt d¹ dµy. Kh«ng gièng nh­ nh÷ng xÐt nghiÖm tr­íc ®©y, PCR cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc 3 bÖnh truyÒn nhiÔm qua ®­êng t×nh dôc trªn cïng mét mÉu bÖnh phÈm (Herpes, papillomavius, Chlamydia) vµ thËm chÝ cã thÓ ph©n biÖt chñng ®Æc biÖt cña papillomavius cã thÓ g©y ra ung th­ mµ c¸c xÐt nghiÖm kh¸c kh«ng thÓ lµm ®­îc. Tãm l¹i, nÕu cã mét lo¹i nhiÔm khuÈn, theo nguyªn t¾c th× PCR cã thÓ t×m ra ®­îc nguyªn nh©n. H¬n 60 m« h×nh PCR ®Ó x¸c ®Þnh t¸c nh©n g©y bÖnh vµ Ýt nhÊt cã 10 s¶n phÈm l©m sµng ®Ó ph¸t hiÖn sù x©m nhËp c¸c c¬ quan g©y ra nh­ bÖnh lao, Chlamydia, virus g©y viªm mµng n·o, Viªm gan virus, AIDS, vµ Cytomegalovirus. Do PCR cã thÓ dÔ dµng ph©n biÖt nh÷ng biÕn ®æi nhá trong AND ë mçi ng­êi vµ t¹o ra ë chóng ta tÝnh chÊt di truyÒn duy nhÊt, ph­¬ng ph¸p nµy ®­a ®Õn mét lo¹i xÐt nghiÖm di truyÒn míi. Nh÷ng xÐt nghiÖm nµy kh«ng chØ ®Ó gióp chÈn ®o¸n víi nh÷ng ng­êi cã rèi lo¹n di truyÒn mµ c¶ víi nh÷ng ng­êi mang nh÷ng biÕn ®æi cã h¹i nh­ ®ét biÕn mµ cã thÓ truyÒn cho con c¸i cña hä (nh÷ng ng­êi mang gen nµy th­êng b¶n th©n hä kh«ng bÞ ¶nh h­ëng bëi ®ét biÕn gen mµ hä cã thÓ truyÒn bÖnh cho thÕ hÖ sau). PCR cã thÓ mang l¹i sù an t©m cho nh÷ng ng­êi ®ang muèn cã ®­îc ®øa con, vÝ dô xua ®i nh÷ng nguy c¬ cã thÓ cã nh÷ng ®­a con cã nh÷ng bÖnh di truyÒn ®Æc biÖt. Kü thuËt nµy thËm chÝ cøu sèng nh÷ng ®øa trÎ tr­íc khi chóng sinh ra. C¸c b¸c sÜ ®· sö dông nã ®Ó xÐt nghiÖm AND thai nhi tõ nhãm m¸u cña mÑ vµ cña con xem cã hoµ hîp víi nhau kh«ng. T×nh tr¹ng nµy th­êng dÉn ®Õn nh÷ng nguy hiÓm g©y chÕt thai nh­ng cã thÓ ®­îc ®iÒu trÞ thµnh c«ng. PCR cã thÓ gióp chÈn ®o¸n nh÷ng bÖnh trong qu¸ khø. Cùu phã tæng thèng vµ øng cö tæng thèng Hubert H. Humphrey ®· tr¶i qua xÐt nghiÖm v× ung th­ bµng quang n¨m 1967. MÆc dï xÐt nghiÖm lµ ©m tÝnh, «ng ta chÕt v× bÖnh nµy n¨m 1978. N¨m 1994 c¸c nhµ nghiªn cøu so s¸nh mÉu n¨m 1976 víi mÉu ung th­ bµng quang cña «ng n¨m 1967. Víi sù trî gióp cña PCR nh©n b¶n tõ mét l­îng nhá ADN trong mÉu n­íc tiÓu c¶u mét ng­êi 27 tuæi, hä ph¸t hiÖn ra r»ng cã sù ®ét biÕn gièng nhau ë gen p53 trong c¶ hai mÉu. C¸c nhµ nghiªn cøu ®· nãi “ bÖnh cña Humphrey cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc ung th­ nÕu c¸c kü thuËt cña sinh häc ph©n tö ph¸t triÓn ®­îc nh­ hiÖn nay ”. LÞch sö di truyÒn quay trë l¹i nhê PCR. Sau bÖnh mï mµu, nhµ ho¸ häc ng­êi Anh, John Dalton chÕt n¨m 1884, mét sè m« m¾t cña «ng ®· ®­îc l­u gi÷. Dalton ®· hái tr­íc khi chÕt xem lý do t¹i sao «ng l¹i nhÇm lÉn gi÷a mµu ®á t­¬i vµ mµu xanh l¸ c©y, mµu hång vµ mµu xanh da trêi. XÐt ngiÖm ADN gÇn ®©y tõ m« m¾t cña «ng b»ng nh©n b¶n ADN ®· cho thÊy r»ng Dalton thiÕu mét gen ®Ó t¹o ra mét trong ba chÊt s¾c tè cÇn thiÕt ®Ó ph©n biÖt mµu b×nh th­êng. *PCR vµ ph¸p luËt Kh¶ n¨ng v« song cña kü thuËt nµy ®èi víi x¸c ®Þnh vµ nh©n b¶n mét l­îng rÊt nhá, thËm chÝ tõ nh÷ng ADN ®· l©u hoÆc bÞ ph©n huû ®· ®­îc chøng minh lµ cã gi¸ trÞ ®èi víi ph¸p luËt ®Æc biÖt trong lÜnh vùc téi ph¹m, PCR lµ mét phÇn kh«ng thÓ thiÕu ®­îc víi gi¸m ®Þnh ph¸p y, th­êng gäi lµ ADN fingerpriting (in dÊu ADN). §èi víi nh÷ng lo¹i ADN, vÝ dô ADN t¸ch chiÕt tõ m¸u t×m thÊy trªn quÇn ¸o cña n¹n nh©n nghi ngê bÞ s¸t h¹i, c¸c nhµ khoa häc nghiªn cøu trªn nh÷ng vÞ trÝ ADN biÕn ®æi gi÷a nh÷ng c¸ thÓ lµ ®iÓn h×nh. ViÖc nµy gióp cho x¸c ®Þnh rÊt cã kh¶ n¨ng mÉu ®ã phï hîp víi ADN cña mét ng­êi cô thÓ nµo ®ã. MÆc dï thêi gian ®Çu ADN typing ®· g©y tranh luËn, c¸c phßng xÐt nghiÖm chuÈn ®· tiÕn hµnh xÐt nghiÖm ADN typing rÊt kü l­ìng, hiÖn nay trªn thÕ giíi ®­îc chÊp nhËn lµ mét b»ng chøng rÊt cã gi¸ trÞ t¹i toµ ¸n. ADN typing lµ mét trong nh÷ng chøng cí ®Ó kÕt téi nh­ng còng lµ mét b»ng chøng cã gi¸ trÞ ®Ó chøng tá ng­êi v« téi. RÊt nhiÒu nh÷ng vô liªn quan ®Õn nh÷ng ng­êi bÞ buéc téi vµo tï nhiÒu n¨m v× bÞ cho r»ng ph¹m téi, vÝ dô Maryland bÞ tï 9 n¨m v× hiÕp d©m vµ giÕt h¹i mét ®øa trÎ 9 tuæi nh­ng ®· ®­îc th¶ tù do nhê cã kü thuËt PCR. ThËm chÝ khi nh÷ng chøng cø nh­ tinh dÞch, vÕt m¸u ®· l©u n¨m, PCR cã thÓ kh«ng h¹n chÕ nh©n b¶n mét l­îng ADN rÊt nhá cßn l¹i trong dÊu vÕt sinh häc nh­ ®· tiÕn hµnh trong tr­êng hîp cña Maryland. * ADN cæ ®¹i vµ mèi quan hÖ tiÕn ho¸ C¸c nhµ kho¶ cæ häc ®· dùa vµo PCR vµ øng dông nã theo nhiÒu c¸ch k¸c hau rÊt h÷u Ých, PCR gióp ph©n lo¹i mèi quan hÖ gi÷a nh÷ng nhãm ng­êi ®· bÞ tuyÖt chñng vµ nh÷ng vÕt tÝch cña nh÷ng ng­êi di c­. Nghiªn cøu nh÷ng bä n·o ng­êi sèng c¸ch 8000 n¨m trong mét hè sôt ë Florida cßn nhiÒu hay Ýt, vÝ dô xem nh÷ng ng­êi ®ã cã kh¸c di truyÒn häc víi nh÷ng ng­êi Mü hiÖn nay? C¸c nhµ kh¶o cæ ®· th©y r»ng PCR cã thÓ lµm s¸ng tá thùc tÕ nÒn v¨n ho¸ con ng­êi. Ph©n tÝch mµu s¬n tõ tranh ®¸ 4000 n¨m tuæi ë Texas, hä ph¸t hiÖn thÊy mét chÊt lµ ADN, cã thÓ tõ rõng Bizon, ®éng vËt kh«ng thÓ sèng ë gÇn s«ng Pecos trong thêi gian ®ã. V× vËy c¸c nhµ nghÖ thuËt ph¶i cè g¾ng nç lùc ®Ó cã ®­îc nh÷ng chÊt liÖu kh«ng b×nh th­êng nh­ vËy cho tranh cña hä. 6. Trong b¶o vÖ m«i tr­êng, viÖc x¸c ®Þnh møc ®é « nhiÔm sinh häc cã thÓ thùc hiÖn rÊt hiÖu qu¶ nhanh chãng b»ng kü thuËt PCR 7. PCR víi hÖ thèng hiÖn ®¹i, nghiªn cøu sinh th¸i häc Víi PCR c¸c nhµ hÖ thèng cã thÓ trùc tiÕp ®o ®­îc sù kh¸c nhau cña chuçi ADN gi÷a c¸c loµi vµ lùa chän nh÷ng chuçi cã Ýt thay ®æi trong qu¸ tr×nh tiÕn ho¸, gi÷a nh÷ng nh¸nh sinh vËt chÝnh. Tèc ®é vµ sù tù ®éng ho¸ cña c¸c ph­¬ng tiÖn, c¸c nhµ khoa häc cã thÓ dÔ dµng so s¸nh hµng t¸, thËm chÝ hµng tr¨m c¸ thÓ. Víi PCR, c¸c nhµ khoa häc thÓ hiÖn l¹i nh÷ng th«ng tin di truyÒn tõ nh÷ng dÊu vÕt mê nh¹t nhÊt, n­íc tiÓu, ph©n ®éng vËt, tãc hoÆc da ng­êi dÝnh trªn c©y. Thªm nh÷ng th«ng tin ®Ó gióp ph©n lo¹i nh÷ng c¸ thÓ cã thÓ ®­îc x¸c ®Þnh ®Ó ­íc tÝnh l­îng d©n sè trong vïng hay ®Ó x¸c ®Þnh vïng ®Þa lý cña ®éng vËt ®¬n lÎ hay tõng nhãm. Kü thuËt nµy cã thÓ ®­îc chÊp nhËn ®Ó nghiªn cøu tû lÖ ®èi víi thùc vËt, ph©n tÝch sù gieo r¾c h¹t vµ mèi liªn quan sinh s¶n cña nh÷ng loµi thùc vËt ®Æc biÖt. X- T­¬ng lai cña PCR C«ng nghÖ hiªn nay ®Ó tiÕn hµnh PCR sÏ ngµy cµng ph¸t triÒn hoµn thiÖn. B»ng c¸ch thay ®æi c¸c chÊt ho¸ vµ pH, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thµnh c«ng ë møc ®é nh©n b¶n cµng ngµy cµng lín h¬n tõ nh÷ng ®o¹n ADN, kÓ c¶ toµn bé hÑ gen HIV. Sù thu nhá ho¸ cña phÇn cøng, khi c¸c nhµ thÝ nghiÖm ®­a PCR vµo thiÕt bÞ xö lý kÝch cì. GhÐp chÐo gi÷a ho¸ chÊt vµ ADN víi nhau. ThiÕt bÞ xö lý lµm t¨ng nhiÖt ®iÖn vµ l¹nh nhanh h¬n nh÷ng thÕ hÖ m¸y mãc hiÖn nay, v× vËy viÖc nh©n b¶n ADN sÏ ®­îc tiÕn hµnh nhanh h¬n. C¸c nhµ khoa häc sö dông nh÷ng m¸y n¨ng l­îng ®iÖn nhá ®Ó nh©n b¶n nh÷ng ®o¹n ADN cã 8 vÞ trÝ ®ét biÕn kh¸c nhau g©y x¬ nang. Trong khi nh÷ng thiÕt bÞ chip-base vÉn ch­a ®­îc chuÈn bÞ cho thÝ nghiÖm, c¸c nhµ khoa häc cã thÓ mang chóng ra ngoµi ®­êng vµ bÖnh nh©n sÏ cã thÓ ®­îc ®äc ADN cña hä t¹i ngay hiÖn tr­êng. Nã cã thÓ th­êng qui dïng ®Ó chÈn ®o¸n mét bÖnh nhiÔm khuÈn hay nh÷ng rèi lo¹n di truyÒn, thËm chÝ ph¸t hiÖn mét bÖnh di truyÒn cã kh¶ n¨ng g©y ung th­ hoÆc bÖnh tim ë ngay t¹i phßng kh¸m cña b¸c sÜ. Theo nguyªn t¾c, PCR cã thÓ t¹o ra vËt chÊt di truyÒn cña mét loµi sinh vËt cÇn thiÕt víi sè l­îng kh«ng h¹n chÕ, v× vËy nã cã thÓ dïng ®Ó ph©n tÝch nh÷ng tÕ bµo nµo chøa vËt chÊt ®ã. Chóng cã thÓ lµ tÕ bµo mÇm, hoÆc thùc vËt hiÕm cã trong y häc, hoÆc con ng­êi, thùc tÕ chóng ta cã thÓ biÕt ®­îc nh÷ng g× ®­îc ghi l¹i trªn ADN cña chóng. Víi nh÷ng sinh vËt ®¬n gi¶n, biÕt ADN cña chóng lµ sÏ biÕt ®­îc hÇu hÕt vÒ chóng, víi nh÷ng sinh vËt phøc t¹p nh­ con ng­êi, ADN chØ lµ mét thø rÊt nhá nh­ng còng lµ mét phÇn v« cïng lín. Nhê PCR chóng ta sÏ dß t×m gen qu¸ khø vµ xem xÐt nh÷ng gen trong t­¬ng lai trong nhiÒu n¨m tiÕp theo. Nh÷ng hiÓu biÕt xung quanh PCR “PCR là kü thuật khoa học mới quan trọng nhất trong suốt một trăm năm qua.” -Mark R. Hughes, phó giám đốc trung tâm nghiên cứu hệ gen người quốc gia, viện sức khoẻ quốc gia (Powledge 1998). Thoạt đầu, tưởng như con đường cao tốc ở California, mùa xuân nóng nực ở công viên quốc gia Đá vàng (Yellowstone National Park) và giải thưởng Nobel về hoá học chẳng có điểm chung nào. Nhưng ẩn dấu bên trong cái vẻ bề ngoài dường như không liên quan gì đến nhau là “một ý tưởng quá tài tình đến mức đã làm thay đổi cách con người đặt câu hỏi” (Rhee 1998). Sự phát triển đột phá của kỹ thuật PCR bởi Kary Mullis được thai nghén vào năm 1983 (Stryer 1995) khi Mullis đang trên con đường cao tốc dọc Đại Tây Dương (Pacific Coast Highway) từ San Francisco đến Mendocino bằng motorcycle. Mười năm sau đó, ý tưởng đã đem lại cho ông giải thưởng Nobel về hoá học (Rhee 1998). Cái đẹp trong ý tưởng của Mullis nằm ở sự đơn giản của nó. Về cơ bản, PCR bắt chước cơ chế mà hầu hết các sinh vật sử dụng để sao chép ADN của chúng (Xeroxing ADN 1992). Một trở ngại chính trong kỹ thuật PCR là việc nó sử dụng rất nhiều nhiệt độ khác nhau để nhân đôi ADN. Phần lớn các enzyme phụ thuộc vào nhiệt độ và hoạt động tự nhiên đều không thể đối đầu với nhiều nhiệt độ khác nhau như vậy. Chính ở đây mà một loài sinh vật, Thermus aquatics và ADN polymerase liên kết của nó trở thành quan trọng. Loại ADN polymerase này ổn định với nhiệt độ (heat-stable) và được gọi là Taq ADN polymerase. Vi khuẩn ưa nhiệt tìm thấy ở công viên quốc gia Đá vàng này tạo ra ADN polymerse có thể chịu được nhiệt độ cao được sử dụng trong quy trình PCR (“Từ các ý tưởng đơn giản” 1998). Về cơ bản, kỹ thuật PCR cho phép tạo ra nhiều bản sao của trình tự ADN đích một cách nhanh chóng. Theo nghĩa này, PCR khuếch đại một đoạn của ADN. Quy trình vòng tròn PCR tổng hợp các bản sao rất nhanh vì sản phẩm của một chu trình PCR lại trở thành khuôn cho chu trình tiếp theo (“Từ các ý tưởng đơn giản” 1998). Kỹ thuật này hiệu quả đến mức một trình tự ADN đích có thể được khuếch đại một triệu lần chỉ sau có vài giờ (McClean 1997). Kỹ thuật này không chỉ nhanh và hiệu quả, nó còn giúp các nhà khoa học làm việc trong những điều kiện hạn chế. PCR giúp các nghiên cứu viên trong các lĩnh vực từ sức khoẻ con người (đặc biệt là về vấn đề phát hiện HIV) đến các nghiên cứu pháp lý, hay mối quan hệ tiến hoá, hay nghiên cứu sinh thái và tập tính động vật (Powledge 1998). Số lượng lớn các ứng dụng của PCR xuất phát từ khả năng khuếch đại các đoạn nhỏ ADN nằm lẫn trong nền tất cả các acit nucleic (“Từ các ý tưởng đơn giản” 1998). Trên thực tế, kỹ thuật PCR chỉ cần dùng ADN trong một phần mười của một phần triệu lít (0,1mL) nước bọt người (chỉ chứa một ít các tế bào biểu mô) để phân biệt một trình tự gen nhất định là của người. Thêm vào đó, lượng DNA trong mủ cây thông 80 triệu năm tuổi cũng đủ để khuếch đại bằng PCR (Brown 1995). Nói tóm lại, PCR chỉ cần một lượng ADN rất nhỏ để làm việc. Khái niệm đi sau PCR rất đơn giản, vì chỉ cần rất ít nguyên liệu để khuếch đại một đoạn ADN: · Phân tử ADN khuôn (trình tự đích): ADN được khuếch đại có thể xuất phát từ các nguồn khác nhau, từ các tác nhân gây bệnh ở người (HIV hay bệnh mụn giộp-herpes), đến vết máu hay tinh dịch thu được trong một vụ án, hay ADN của chú mối 40 triệu năm tuổi (Powledge 1998). Trình tự đích có thể rất nhỏ (như đã đề cập đến ở trên) hay rất dài (đến 10 000 cặp bazơ) (Styer 1995). Yếu tố mấu chốt của ADN khiến PCR dùng được trong hầu hết các trường hợp là vật liệu di truyền của mỗi sinh vật sống (thực vật, động vật, vi khuẩn, và virus) đều chứa cùng một loại gạch xây là deoxynucleotide trong những tổ hợp khác nhau (Powledge 1998). ADN là polyme được tạo nên từ bốn loại nucleotide khác nhau, mỗi loại gắn với một bazơ khác nhau: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T). Đối với ADN điều quan trọng nhất là A bổ sung với T và G bổ sung với C. Do đó, A luôn luôn bắt cặp với T và G luôn luôn bắt cặp với C. Đây chính là cơ sở đặt nền tảng cho kỹ thuật PCR. ·  Các đoạn mồi oligonucleotide: Người, vi khuẩn hay virus không thể sao một chuỗi ADN nếu không có một trình tự nucleotide ngắn để bắt đầu quá trình (“Xeroxing DNA” 1992). Về cơ bản, ADN polymerase cần nhóm 3’-OH tự do để nucleotide khác có thể bám vào (McClean 1997). Vì vậy, cần có một đoạn mồi oligonucleotide dài khoảng 20 đến 30 nucleotide (Brown 1995, Styer 1995). Trong tự nhiên, enzyme đặc biệt tên gọi primase chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp các đoạn mồi. Điều kỳ diệu của kỹ thuật hiện đại là đã thay thế các enzyme này bằng một chất tổng hợp ADN có khả năng tổng hợp các đoạn mồi oligonucleotde. Tất nhiên đoạn mồi oligonucleotide không thể là tổ hợp các bazơ bất kỳ tạo nên ADN. Một cách chính xác hơn, các mồi phải bổ sung với trình tự nucleotide ở cả hai đầu của trình tự đích (Powledge 1998). Điều này có nghĩa là mặc dù không cần biết trình tự đặc hiệu của ADN đích, nhưng trình tự của các nucleotide ở đầu 3’ của trình tự ADN đích lại cần phải được biết chính xác thì PCR mới thực hiện được. Do ADN có hai sợi chạy theo hai chiều song song ngược chiều nhau, cần phải có hai đoạn mồi oligonucleotide. * Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) Như đã đề cập đến ở trên, ADN là một chuỗi polyme cấu tạo từ bốn deoxynucleotide khác nhau (A, G, C, và T). Thêm vào đó, các nucleotide này lại có các cặp bổ sung (A và T, G và C). Vì vậy, để tổng hợp ADN mới, các nucleotide này cần phải có mặt. Với sự giúp đỡ của ADN polymerase, các bazơ đúng được gắn với nhau. Một yếu tố quan trọng khác của dNTPs được sử dụng trong PCR là chúng chứa nhóm photphat. Điều này rất cần thiết trong việc kéo dài chuỗi ADN mới. Năng lượng được giải phóng khi các liên kết photphat này bị phá vỡ chính là động lực cho cơ chế tổng hợp ADN. ·  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase) ADN polymerase là loại enzyme gắn deoxynucleotide vào dầu 3’-OH của sợi DNA phát triển (McClean 1997). Nếu không có enzyme này, không thể gắn thêm nucleotide nào vào mồi oligonucleotide. Kỹ thuật PCR đòi hỏi hỗn hợp phản ứng phải trải qua nhiều lần thay đổi nhiệt độ, bao gồm từ 50oC đến 95oC. Đối với hầu hết các enzyme, dải nhiệt độ này, đặc biệt là nhiệt độ cao khiến chúng không thể tránh khỏi biến tính. Trên thực tế, Mullis và các nhà nghiên cứu khác đều mắc phải trở ngại này trong suốt quá trình phát triển của kỹ thuật PCR. Taq ADN polymerase lµ ®¬n gi¶n vµ c¶i thiÖn PCR: Ban ®Çu E. coli ADN polymerase ®­îc sö dông trong kü thuËt PCR, nh­ng enzyme nµy kh«ng bÒn nhiÖt vµ bÞ ph¸ huû ë nhiÖt ®é cÇn ®Ó t¸ch chuçi ADN kÐp. Bëi vËy enzyme míi ph¶i ®­îc thªm vµo sau mçi chu kú, ®ã lµ mét qu¸ tr×nh ch¸n ng¾t vµ mÊt thêi gian. Mét b­íc tiÕn kü thuËt quan träng ®· xuÊt hiÖn víi sù ph¸t hiÖn mét lo¹i vi khuÈn sèng trong suèi n­íc nãng cã ADN polymerase cã thÓ lµm viÖc tèt ®­îc ë nhiÖt ®é cao. Vi khuÈn Thermus aquaticus sèng ë n­íc cã nhiÖt ®é 75oC (sinh sống trong suối nước nóng ở công viên quốc gia Đá vàng). ADN polymerase cña nã (Taq polymerase) cã mét nhiÖt ®é tèi ­u ë 72oC vµ x¸c ®Þnh ë 94 ®é C. Taq polymerase chØ cÇn cho vµo mét lÇn khi b¾t ®Çu ph¶n øng vµ sÏ duy tr× ho¹t ®éng ®Õn khi hoµn thµnh chu tr×nh nh©n b¶n. Sù ph¸t triÓn nµy ®· cho phÐp ph¶n øng PCR x¶y ra mét c¸ch tù ®éng qua viÖc sö dông c¸c chu tr×nh nhiÖt, ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é cã thÓ ®d­îc lËp tr×nh ®Ó tiÕn hµnh c¸c chu tr×nh thêi gian vµ nhiÖt ®é cho mét ph¶n øng PCR. C¸c nguyªn liÖu cho mét ph¶n øng PCR cã thÓ ®­îc ®­a vµo chu tr×nhvµ ph¶n øng ®­îc tiÕn hµnh mµ kh«ng cÇn sù can thiÖp nµo thªm. Vì vậy, chỉ cần thêm chúng vào mẫu PCR một lần là đủ, thay cho việc thêm chúng vào sau mỗi chu trình PCR (“Từ những ý tưởng đơn giản” 1998). TÝnh ®Æc hiÖu vµ ®é nhËy cña ph¶n øng PCR ®­îc c¶i thiÖn bëi Taq polymerase.E. Coli ADN polymerase ®ßi hái nhiÖt ®é thÊp, c¸c måi cã thÓ g¾n vµo vÞ trÝ cña c¸c chuçi kh¸c kh«ng ph¶i chuçi ®Ých. Sù nh©n b¶n cã thÓ x¶y ra sù g¾n nhÇm khi c¸c måi ë gÇn nhau trªn chuèi bæ sung ADN. V× c¸c chuçi bæ sung ®óng víi måi kh«ng ®­îc kÕt hîp thµnh nh÷ng ®o¹n tæng hîp sÏ t¹o ra mét chu kú kh«ng mong muèn. Nh÷ng ®o¹n tæng hîp kh«ng mong muèn nh­ thÕ nµy ë nh÷ng chu kú ®Çu tiªn cña ph¶n ÷ng PCR sÏ ®­îc nh©n b¶n ë nh÷ng chu kú tiÕp theo. ViÖc nµy sÏ ®­îc c¶i thiÖn khi sö dông Taq polymerase. Sù ®Æc hiÖu sÏ ®­îc c¶i thiÖn h¬n trong ph­¬ng ph¸p “hot-start”, n¬i mµ tÊt c¶ c¸c chÊt thö ph¶n øng ®­îc l­u ë mét n¬i cã nhiÖt ®é 72 ®é C tr­íc khi thªm thµnh phÇn cuãi cïng, vÝ dô Taq polymerase. Sù t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu nµy lµm ®¬n gi¶n ph©n tÝch s¶n phÈm PCR. C¸c ®o¹n ®Ých ®­îc nh©n b¶n cã thÓ ®­îc thÊy dÔ dµng trªn gel nhuém Ethi®ium Bromide v× nÒn nhuém cña chuçi kh«ng ph¶i lµ chuçi ®Ých sÏ bÞ lo¹i bá. Gần đây, các nguồn DNA polymerase ổn định với nhiệt độ đã được phát hiện. Các sinh vật sinh sống ở phần nối giữa hai mảng kiến tạo của đáy đại dương cũng sản xuất ra DNA polymerase có thể chịu được nhiệt độ cao trong phản ứng PCR. Người ta mới phát hiện ra rằng những DNA polymerase từ các sinh vật này thậm chí còn chịu nhiệt hơn cả DNA polymerase từ Thermus aquaticus và thậm chí có thể thay thế cho Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR. (McClean 1997). ·   Dung dịch đệm phản ứng (có chứa Mangesium). Phản ứng PCR cần phải được tiến hành trong dung dịch đệm phản ứng chứa ion Mg2+. Việc sử dụng dung dÞch đệm có nồng độ ion Mg2+ thấp dẫn đến sự gắn mồi sai và sự khuếch đại của những trình tự không phải là đích. Ngược lại, nồng độ quá cao lại làm giảm sự gắn mồi và dẫn đến sự khuếch đại ADN không hiệu quả. Cuối cùng, ADN polymerase chịu nhiệt (giống như Taq ADN polymerase) lại phụ thuộc vào ion Mg2+. Do đó, cần xác định chính xác nồng độ ion Mg2+ để làm cho hiệu suất của polymerase và tính đặc hiệu của phản ứng đạt cực đại. (Podzorski và những người khác 1997). ·  Thermal Cycler Trong những ngày đầu của PCR, người ta sử dụng ba bồn nước ở các nhiệt độ khác nhau để thay đổi nhiệt độ của hỗn hợp PCR trong suốt chu tr×nh PCR. Việc duy trì ba bồn nước riêng rẽ này rất không thuận tiện vì hai lý do. Thứ nhất, kỹ thuật viên phải điều khiển nhiệt độ của nước trong mỗi bồn. Thêm vào đó, kỹ thuật viên cũng phải di chuyển hỗn hợp PCR giữa các bồn nước trong suốt chu trình PCR. Sự phát triển của kỹ thuật gần đây đã loại bỏ việc phải thường xuyên theo dõi trong suốt chu trình PCR. “Ông chu tr×nh” (“Mr. Cycle”) là máy PCR tự động đầu tiên. Nó bao gồm bộ phận điều khiển tự động nhiều kênh nước và hai khối nhôm (“Từ những ý tưởng đơn giản” 1998). Công cụ này chỉ huy và điều hoà nhiệt độ của hỗn hợp PCR mà không cần kỹ thuật viên phải quan sát thường xuyên. RAPD PCR RAPD có nghĩa là Sự khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (Random Amplication of Polymorphic ADN). Phản ứng RAPD cũng là phản ứng PCR, nhưng nó chỉ khuếch đại các đoạn ADN mà các nhà khoa học hoàn toàn không biết (ngẫu nhiên). Thông thường, PCR được dùng để khuếch đại một trình tự ADN đã biết. Do đó, nhà khoa học chọn trình tự mà họ muốn khuếch đại, sau đó thiết kế và tạo mồi mà sẽ bám vào trình tự quan tâm. Vì vậy, PCR dẫn đến sự khuếch đại một đoạn ADN đặc biệt nào đó. Standard PCR Tuy nhiên, trong phân tích RAPD, trình tự đích (sẽ được khuếch đại) không được biết trước. Nhà khoa học sẽ thiết kế mồi với trình tự bất kỳ. Nó cách khác, nhà khoa học đ¬n giản là sẽ tạo ra một trình tự 10 bazơ (hay có thể sử dụng máy tính để tạo ra một trình tự 10 cặp bazơ một cách ngẫu nhiên), sau đó tổng hợp đoạn mồi. Rồi tiến hành phản ứng PCR và chạy gel agarose để quan sát xem có đoạn ADN nào được khuếch đại khi có mặt mồi ngẫu nhiên hay không. Nhớ rằng: để PCR có thể xảy ra: ·   Các đoạn mồi phải bám vào theo một hướng nhất định nào đó (có nghĩa là chúng hướng về nhau). ·    Các mồi phải bám vào những điểm cách nhau một khoảng cách hợp lý. Hình sau miêu tả một phản ứng RAPD. Một đoạn lớn ADN được sử dụng để làm khuôn trong phản ứng PCR, phản ứng chứa nhiều bản sao của một đoạn mồi đơn bất kỳ. ·  Các mũi tên miêu tả các bản sao của một đoạn mồi (tất cả các đoạn mồi đều có cùng trình tự). Hướng của các mũi tên cũng chỉ hướng mà theo đó, sự tổng hợp ADN sẽ xảy ra. · Các con số chỉ vị trí trên khuôn ADN mà mồi bám vào. ·   Các mồi bám vào điểm 1, 2 và 3 ở sợi bên dưới của khuôn ADN và các mồi bám vào điểm 4, 5 và 6 ở sợi bên trên của khuôn ADN. Trong ví dụ này, chỉ có 2 sản phẩm PCR RAPD là được tạo ra: Sản phẩm A được tạo ra do sự khuếch đại trình tự ADN nằm giữa hai mồi ở vị trí 2 và 5. Sản phẩm B được tạo ra do sự khuếch đại trình tự ADN nằm giữa hai mồi bám ở vị trí 3 và 6. Chú ý rằng không có sản phẩm PCR nào được tạo ra giữa các mồi bám ở điểm 1 và 4 vì chúng quá xa nhau để có thể hoàn thành phản ứng PCR. Chú ý rằng không có sản phẩm PCR nào được tạo ra giữa các mồi ở vị trí 4 và 2 hoặc giữa 5 và 3 vì các cặp mồi này không hướng vào nhau. Sử dụng phân tích RAPD để tìm sự khác biệt giữa các hệ gen. Hãy xem xét lại ví dụ trên. Nếu khuôn ADN (hệ gen) được tách chiết từ một nguồn khác, rất có thể trình tự ADN của hai khuôn sẽ khác nhau. Giả thiết rằng trình tự thay đổi ở điểm mồi bám số 2: Như đã chỉ ra trong hình trên, mồi sẽ không bám vào điểm 2, và do đó, sản phẩm PCR A sẽ không được tạo ra. Chỉ có sản phẩm B là được tạo ra. Nếu chạy 2 sản phẩm của phản ứng PCR RAPD này trên gel agarose, ta sẽ thấy như sau: Chuẩn đoán virus. Một trong những phương pháp dùng để xác định xem một người có bị nhiễm HIV không là PCR ADN. Đây không phải là một phân tích huyết thanh (serology assay) vì nó không phát hiện kháng thể đối với virut HIV mà là một 'measurement of proviral ADN'. Proviral ADN được tạo ra khi virut HIV xâm nhập vào tế bào và sử dụng sao mã ngược để tạo ra các bản sao ADN từ hệ gen ARN. Các bản sao này, được gọi là proviral ADN, có thể tìm thấy trong tế bào chất của tế bào hay trở thành một phần của tế bào chủ. Người ta có thể giải thích đơn giản phép kiểm tra này được thực hiện như thế nào như sau: các tế bào đơn nhân (peripheral mononuclear cell) được thuỷ phân, rồi người ta khuếch đại vật liệu di truyền qua một quá trình nhân đôi được lặp lại 20 - 30 lần. Sau khi khuếch đại, vùng được chọn có thể được khuếch đại lên gấp một triệu lần. Người ta có thể phát hiện ra proviral ADN trong cả các tế bào mà virut đang hoạt động nhân đôi lẫn các tế bào mới chỉ chứa (habour) các proviral ADN. PCR có một vài ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh: 1. Được sử dụng như vật đánh dấu báo trước (prognostic marker) cho những neonate được sinh từ các bà mẹ sero dương (seropositive) với khả năng phát hiện 50% số người bị nhiễm neonate sớm ngay sau khi sinh. (Bartlett, 1994). Những kháng thể của mẹ có thể có mặt cho đến tháng thứ 18 và khiến cho việc chuẩn đoán bằng phân tích kháng thể trở nên khó khăn. 2. PCR ADN có thể giúp cho việc phân tích tình trạng nhiễm bệnh của cá thể bằng Western blot. 3. Để xác định sự có mặt của HIV khi môi trường virus và/hoặc kiểm tra kháng nguyên cho âm tính. Degenerate PCR PCR thoái hoá về hầu hết các mặt đều giống với PCR thông thường, nhưng có một điểm khác biệt quan trọng. Thay vì sử dụng mồi PCR đặc hiệu có trình tự biết trước, người ta lại sử dụng một hỗn hợp mồi PCR. Điều đó có nghĩa là nếu không biết chính xác trình tự của gen cần khuếch đại, người ta sẽ đưa vào một hỗn hợp các mồi PCR sao cho có hơn một khả năng là có đoạn mồi đúng. Ví dụ, nếu biết cấu trúc của protein, ta có thể dịch ngược cấu trúc của protein thành cấu trúc nucleotide tương ứng (Từ protein ------> Giải trình tự). Sau đây là ví dụ về một mồi PCR thoái hoá được thiết kế dựa theo cấu trúc protein. Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu 5’ TGG GAY ACN GCN GGN CAR GAR 3’ Trong đó Y = C hay T, R = G hay A, N = G, A, T hay C. Có tất cả 256 loại oligonucleotide khác nhau từ mồi thoái hoá trên. Số lượng mồi có thể có càng cao thì tính thoái hoá của mồi PCR càng cao. (Tính thoái hoá của mồi được tạo ra trong suốt quá trình tổng hợp DNA, do đó ta không cần tạo ra 256 mồi khác nhau, nó quả là nhiều việc và đắt nữa). Tại sao lại sử dụng PCR thoái hoá? PCR thoái hoá đã chứng tỏ là công cụ rất hữu ích trong việc tìm gen “mới” hay các họ gen. Phần lớn các gen đều xuất phát từ những họ có những điểm chung về cấu trúc. Bằng cách so sánh các trình tự protein từ một số protein thân thuộc, ta có thể phát hiện ra phần nào của protein được bảo tồn và phần nào đã biến đổi. Dựa trên thông tin này, ta có thể tìm thấy cấu trúc protein được bảo tồn và sử dụng nó như điểm bắt đầu để tạo ra các mồi PCR thoái hoá. PCR thoái hoá có thể được sử dụng để giải quyết một số vấn đề. 1.Khi đã tách chiết được một protein và đã giải được trình tự các acid amine từ nó, PCR thoái hoá có thể được sử dụng để tìm gen tương ứng. 2. Khi cần nhân dòng các gen tương đồng ở chuột hay ruồi giấm với gen của người. 3. Người ta mới tìm ra một gen thú vị ở nấm và sử dụng PCR thoái hoá để tìm gen tương ứng ở người (nếu tồn tại). 4. Ứng dụng trong các nghiên cứu về di truyền hình thái (phylogenetic) và tiến hoá của gen. Nói cụ thể hơn, có thể ta tìm ra các gen đặc hiệu (specific orthologous genes) từ một số loài thân thuộc và so sánh chúng. (Dạng thông tin này có thể cho biết các điểm tiềm hoạt động (potential active sites), vùng điều hoà và nhiều hơn nữa). 5. Có ích trong những nghiên cứu về họ gen. (Ví dụ, có bao nhiêu thành viên trong họ Rab tồn tại ở tảo xanh, khi so sánh với các thực vật bậc cao hơn thì chúng có gì khác không). Technical comments. Một số yêu cầu. (Để bắt đầu ta cần thông tin về trình tự kiểu gì). ·        Hai bản trình tự acid amino hoặc trình tự ADN bảo toàn. Chiều dài mồi nên có ít nhất là 20bp. Cấu trúc protein không cần thiết phải được bảo tồn 100%. Đôi khi người ta chỉ cần một phần cấu trúc protein được bảo tồn là đủ. Các ví dụ thường thấy về sự thay thế các acid amin là Glu « Asp và Arg « Lys. Nếu ta sử dụng codon thoái hoá GAN, nó sẽ bao gồm cả Glu và Asp. Cũng tương tự nếu ta sử dụng codon MGN, (M = C hay A), trong đó ta biết có hai acid amin cơ bản là Arg hoặc Lys, codon MGN còn bao hàm một phần codon Lys AAR. Tuy nhiên nếu còn Lys thừa, sẽ có sự bắt cặp sai G/T ở bazơ thứ hai. Khi sự bắt cặp sai này xảy ra ở giữa hay phần 5’ của mồi, thông thường nó sẽ không nguy hại lắm. (Nhớ lại trong hoá sinh rằng dạng enol của T có thể bắt cặp với G). ·   Phần cuối N (N-terminal part) của một protein (thu được từ giải trình tự protein) thường cho biết đủ thông tin trình tự để sử dụng trong PCR thoái hoá. Nếu trình tự cuối N khoảng 20-30 acid amin, thông thường người ta có thể tạo ra hai mồi thoái hoá, và có thể tiến hành PCR đến mảnh cADN 50-90bp, mà sau đó có thể được sử dụng như mẫu dò để tạo ra thư việ cDNA. Hoặc ta có thể tạo ra hai mồi thoái hoá rồi tiến hành 3’ RACE để khuếch đại phần còn lại của cADN. Hướng dẫn: Thông thường cách dễ nhất là PCR một mảnh của N-terminal, giải trình tự mảnh này rồi tạo mồi đặc hiệu cho 3’RACE. cDNA hay DNA hệ gen ·   Thông thường, cADN làm việc tốt nhất với chức năng là ADN khuôn, nó có độ phức tạp thấp. (Ở eukaryote, một phần nhỏ trong ADN hệ gen mã hoá cho protein). ·  Kích thước của mảnh được PCR “có thể dự đoán được” vì nó không có intron. ·  Trong việc xác định xem gen có được biểu hiện trong giai đoạn phát triển hay trong mô nào đó, người ta sử dụng ADN hệ gen làm vật liệu khởi đầu. Điều trở ngại là thường sẽ phải tách qua rất nhiều ADN sai mới thu được gen cần thiết. Mồi PCR nên thoái hoá ở mức độ nào. 1 000 đến 10 000 lần thoái hoá là không phải không thông dụng. Sự thoái hoá của mồi có thể giảm xuống bằng cách thay thế inosine cho bốn bazơ linh động. (Ví dụ: GGI thay cho GGN). Ví dụ: Cấu trúc CVG G(M/L)N RRP (tìm thấy ở p53 protein). Nếu không dùng inosine sẽ có 131 072 mồi khác nhau. 5’ TGY GTN GGN GGN MTN AAY MGN MGN CC 3’ Nếu có inosine chỉ có 512 mồi khác nhau. 5’ TGY GTI GGI GGI MTI AAY MGN MGN CC 3’ Cách chọn điều kiện PCR. ·    Đầu tiên thử “điều kiện chuẩn” với nhiệt độ bám mồi hơi thấp hơn, tiến hành 35-50 chu trình. ·     Nếu thu được kết quả âm từ “điều kiện tiêu chuẩn” thì chạy 4 chu trình PCR đầu ở nhiệt độ thấp hơn 5-10oC so với “đề xuất” (42-46oC). (Các mồi PCR với nhiều điểm bắt cặp sai sẽ bị mở ra, và hy vọng là một số sẽ bám vào gen mong muốn). ·     Nếu các mồi rất thoái hoá (hỗn hợp gồm 512 mồi hay hơn) thì sự ức chế cạnh tranh (competive inhibition) có thể lại là một vấn đề. (Các mồi bám vào đúng khuôn nhưng lại không được kéo dài bởi polymerase vì đầu 3’ không ổn định). Điều này có nghĩa là những chu trình PCR đầu tiên có hiệu suất rất thấp và đôi khi phải chạy đến 50 chu trình PCR mới nhìn thấy được một băng gen mong muốn. ·    Nhớ là không dùng ADN polymerase với 3’« 5’ exonuclease activity (Các mồi PCR sẽ bị tách ra). Taq polymerase thì OK. Loại gen nào “dễ dàng” phát hiện ra nhờ PCR thoái hoá? Rất nhiều protein có những đặc điểm chung về cấu trúc với các protein khác và thường chia sẻ chung nguồn gốc tiến hoá. Những protein với các cấu trúc cổ được bảo tồn, (ACM’s), thường dễ tìm ra. Người ta đã biết đến hơn 500 họ protein với ACM’s! (Một số trong các họ này rất lớn: Ser - Thr - Tyr - kinases ở người có đến trên dưới 1 000 gen). Đến cuối năm 2002, trình tự hoàn thiện của 8 hệ gen eukaryote đã được biết (Người, Drosophila melanogaster (ruồi giấm), Anophele gambiae (muỗi), C. elegans (giun tròn), S. cerevisiae (nấm men), Schizosaccharomyces pombe (nấm men), Arabidopsis thaliana (thực vật), Plasmodium falciparum (động vật nguyên sinh) và gần đây nhất là Giardia lamblia). Thêm vào đó, mười trong số những hệ gen của vi khuẩn cũng đã được hoàn thiện. Các hệ gen này cung cấp những thông tin phong phú về sự tiến hoá của rất nhiều họ gen khác nhau và có thể sử dụng làm điểm bắt đầu để tìm các gen thậm chí ở những sinh vật còn chưa được biết đến. Bắt đầu bằng cách sắp xếp (align) các protein quan tâm, bao gồm càng nhiều protein có thể tìm thấy càng tốt. Nếu protein không được bảo tồn tốt, thử tìm các vùng có acid amin được bảo tồn, và nếu ta biết trình tự từ một sinh vật khá thân thuộc, sử dụng nó như một “trình tự dẫn” (guide sequence). Đôi khi việc chọn trình tự cũng như việc đặt cược trong một ván bài vậy, cần rất nhiều may mắn). Ứng dụng: Sử dụng PCR thoái hoá ta có thể tìm thấy hầu hết các gen từ bất kỳ loài sinh vật nào, dù là nấm men hay động vật (bò, ếch, ốc, bọ cánh cứng, giun hay nấm). Việc nắm bắt các gen tiến hoá nhanh có thể đưa ra nhiều vấn đề. Nếu không quan tâm đến những gen loại này, chắc chắn ta sẽ tìm được cái cần tìm bằng cách sử dụng PCR thoái hoá. Trong trường hợp tìm gen ở nguyên sinh vật, ví dụ cryptomonads, khi mà chúng có nhiều gen trải qua biến động di truyền lớn (genetic drift) thì công việc sẽ khó khăn hơn một chút, và sẽ khác nhiều so với những sinh vật nhân chuẩn khác. Trừ điều đó thì hạn chế của PCR thoái hoá thường rất nhỏ. Những hạn chế khác: 1. Các acid amin dùng để sau đó thiết kế mồi PCR chứa phần lớn là Ser, Arg và Leu. (Đây là những acid amin thoái hoá nhất). Điều này có thể dẫn đến việc các mồi quá thoái hoá đến mức chúng không khuếch đại được gì cả, những gì thu được chỉ là một đống bỏ đi. 2. Vùng muốn khuếch đại quá lớn. Khi đó tránh sử dụng sản phẩm PCR lớn hơn 1000bp. 3. Sinh vật mang đoạn cần khuếch đại có phần GC rất cao. Chúng thường gây ra khó khăn và việc khuếch đại kết thúc với rất nhiều lỗi. 4. Sinh vật mang đoạn cần khuếch đại có phân GC rất thấp và phải thiết kế đoạn mồi rất ngắn (phần TA cao thường tạo ra nhiệt độ nóng chảy cao cho mồi). 5. Những gen đang tìm kiếm không có ở sinh vật đã chọn. Có một vài “gen khủng long” (dinosaur genes) mà đã biến mất trong những dòng nào đó trong quá trình tiến hoá. (Ví dụ gen Rac ở S. cerevisiae). TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương. Sinh học phân tử, Tái bản lần thứ 3 (2003). NXB Giáo dục, 301 trang. Lê Đình Lương. Nguyên lý kỹ thuật di truyền (2001). NXB Khoa học và Kỹ thuật, 208 trang. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân. Cơ sở di truyền học, Tái bản lần thứ 4 (2000). NXB Giáo dục, 207 trang. Phạm Thành Hổ. Di truyền học, Tái bản lần thứ 3 (2001). NXB Giáo dục, 613 trang. Võ Thị Thương Lan. Sinh học phân tử, Tái bản lần thứ 2 (2002). NXB ĐHQG Hà Nội, 204 trang. Lª Thanh Hoµ, “Sinh häc ph©n tö: nguyªn lý vµ øng dông” tµi liÖu gi¶ng d¹y sau ®¹i häc, 2003. Alan G. Atherly, Jack R. Girton, John F. McDonald. The Science of Genetics (1999). Saunders college publishing, USA, ISBN 0-03-029232-8, 704 pp. Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak. Molecular Biotechnology - Principles and Applications of Recombinant DNA, 2nd Edition (1998). ASM Press, Washington, D.C., USA. ISBN 1-55581-136-1, 683pp. Bob B. Buchanan, Wilhelm Gruissem, Russell L. Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants (2000). American Society of Plant Physiologists, USA, ISBN 0-943088-37-2,1343pp. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition (2002). Garland Science Publishing, Inc, New York, USA, ISBN 0-8153-3218-1, 1463pp. JamÐ D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkowski, Mark Zoller. Recombinant DNA. Second edition 1992. Scientific Amercan Book, New York, USA Neil A. Campbell, Jane B. Reece, Lawrence G. Mitchell. Biology, 6th Edition (2002). Benjamin/Cummings, an imprint of Addision Wesley Longman, USA, ISBN 0-8953-6573-7, 1175pp P.C. Turner, A.G. McLennan, A.D. Bates, M.R.H. White. Instant notes in Molecular Biology (1997). Bios scientific publishers, UK, ISBN 981-3083-39-5, 307pp. Robert H. Tamarin. Principles of Genetics, 5th edition (1996). Wm. C. Brown Publishers, USA, ISBN 0-697-21889-9, 683pp. Tom Strachan, Andrew P. Read. Human Molecular Genetics (1996). Bios scientific publishers, UK, ISBN 1-872748-69-4, 587pp. William H. Elliott, Daphne C. Elliott. Biochemistry and Molecular Biology (1997). Oxford University Press, London, UK, 436pp. ………..***………..