Tiểu luận Phân tích cây chuyển gen

1 MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truyền đã đóng góp đáng kể trong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng. Hiện nay có rất nhiều cây trồng là sản phẩm của công nghệ sinh học được thương mại trên thế giới đã khẳng định tiềm năng và khả năng phát triển của lĩnh vực này. Trong các kỹ thuật ứng dụng công nghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giống cây không thể không kể đến kỹ thuật chuyển gen thực vật. Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng rộng rãi trong việc chuyển các gen hữu ích vào cây trồng tạo ra các cây trồng có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với loài ban đầu. Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2005, tỷ lệ diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển đều tăng hàng năm, từ 1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm hơn 1/3 diện tích đất trồng cây nông nghiệp. Điều này cho thấy ngày càng có nhiều nông dân tại các nước phát triển và đang phát triển chấp nhận và trồng cây chuyển gen. Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng gấp 3 lần trong vòng 9 năm (từ 6 nước năm 1996 đến 21 nước năm 2005) (James, 2007). Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa một hoặc nhiều gen có đặc điểm ưu việt từ những loài có thể rất khác nhau về di truyền vào bộ gen của cây nhận trong một thời gian ngắn. Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được thử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn cả là chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien. Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiến hành ở hầu khắp các phòng thí nghiệm. Có nhiều quy trình chuyển gen đã được xây dựng cho rất nhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai tây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau: (1) Phân lập gen mong muốn từ một sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyển gen vào thực vật nhận và (4) Chọn lọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển. Chuyển gen được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ 2 sản phẩm của gen chuyển cũng phải được biểu hiện; và (iv) sản phẩm biểu hiện của gen chuyển phải thể hiện được chức năng sinh học. Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo ba nội dung sau: (1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang gen chuyển); (2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA và protein; (3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển. Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhà lưới hoặc đồng ruộng. Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá và xác định đặc điểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính di truyền của cây chuyển gen. Hình 1. Mô tả các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen 3 1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN Ở MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM Việc xác định nguyên liệu thu được từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen có phải là cây chuyển gen hay không là rất cần thiết và phải tiến hành đầu tiên. Trước hết, chọn lọc các mô, cây chuyển gen bằng các chỉ thị chọn lọc dựa vào các gen chỉ thị phải được tiến hành. Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển để xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyển gen. Muốn xác định số copy được đưa vào genome cây tái sinh phải thực hiện phép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnh quang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ cây chuyển gen. Xác định gen chuyển có được phiên mã sang mRNA hay không có thể thực hiện bằng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng số của cây cần kiểm tra hoặc lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang và RNA toàn phần của mô cây chuyển gen. Và bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo sản phẩm cuối cùng của nó bằng kỹ thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu với protein đó được tinh sạch từ nguồn khác. 1.1. ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN BẰNG TÍNH KHÁNG CHẤT CHỌN LỌC Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm theo gen đích cho phép sàng lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc. Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc. Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt động của gen chuyển. Chất chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycine khi dùng gen nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar. Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái đơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt. Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung chất theo nồng độ nhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của chất chọn lọc lên mô hoặc cây. Biểu hiện thường thấy đối với mô không mang gen là mất khả 4 năng tạo lục lạp rồi sau đó chuyển nâu đen và chết (hình 2.1(B)). Còn chồi sẽ không thể tạo rễ nếu không mang gen chuyển mặc dù được chuyển sang môi trường có nồng độ chất kích thích ra rễ cao vì bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn lọc. Hình 1.1. Mô sẹo của cây cao lương chuyển gen (A) và đối chứng (B) trên môi trường có chất chọn lọc (Tuong Van Nguyen, 2008) Phương pháp thử tính kháng đối với các chất chọn lọc còn được phát triển thành phương pháp tạo vết cháy trên lá. Chất chọn lọc được sử dụng với nồng độ cao hơn khoảng 2 – 5 lần so với thử in vitro và thường bổ sung thêm Twin 20 để tăng khả năng bám dính bề mặt sau đó dùng bút lông quét lên lá của cây cần thử, cũng có thể dùng một sợi chỉ bông kích thước lớn hơn chỉ bình thường, thấm dịch thuốc rồi vắt sợi chỉ qua nhiều lá của nhiều cây. Sau 3 – 5 ngày có thể thấy nơi bôi thuốc hoặc sợi chỉ vắt qua trên các cây không mang gen kháng thuốc hình thành các vết trắng hoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục. Để đảm bảo chính xác phương pháp này thường được tiến hành lặp lại 2 – 3 lần. (a) (b) Hình 1.2. Thử tính kháng kanamycin của bông chuyển gen bằng tạo vết cháy trên lá (Lê Trần Bình, 2008). (a) bông chuyển gen; (b) đối chứng 5 Ngoài ra, Việc đưa một gen chỉ thị mã hóa cho một enzyme trong vector chuyển gen cho phép dễ dàng nhận biết mẫu mang gen khi nhuộm bằng chất màu. Hệ thống GUS (gus, gusA và uidA) mã hóa cho protein β-glucuronidase - một phân tử homotetramer lần đầu tiên được phân lập từ E. coli (Jefferson et al., 1986). β-glucuronidase thường được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và ổn định cao đồng thời dễ tiến hành định lượng. Ngày nay, việc sử dụng GUS trong chuyển gen thực vật ngày càng được tiến hành rộng rãi. Nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống cây mới (Đỗ Tiến Phát và cs, 2008; Lopez et al., 2004). Ngay sau khi GUS được đưa vào thử nghiệm trong nhận biết cây chuyển gen, nó nhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho nhiều đối tượng chuyển gen thực vật (Jefferson et al., 1987) vì ngoài tính nhạy và bền của enzyme nó còn dễ dàng thực hiện bằng các kỹ thuật khối phổ, so màu và phân tích tế bào học. Hơn nữa hầu như không có hoặc rất ít hoạt động của GUS được ghi nhận ở hầu hết mô thực vật bậc cao (Jefferson et al., 1987, Hu et al., 1990; Kosugi et al., 1990; Muhich, 1998). Trong thực vật GUS hoạt động như một gen hỗn hợp nhờ một promoter khởi động quá trình sao mã của trình tự uidA và điều chỉnh biểu hiện gen. Sự biểu hiện của gen sẽ được nhận diện bởi một chất có tên là 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) hoặc 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) trong thời gian ngắn. Một vài hạn chế đã được ghi nhận trong và sau khi xác định hoạt động của GUS trong mô chuyển gen đó là: hoạt tính nền (Hu et al., 1990; Thomasset et al., 1996), thường do sự khuếch tán các sản phẩm phản ứng hoặc hoạt động của chất nội sinh; Tính tự phát sáng (Thomasset et al., 1996), dập tắt hoặc im lặng (Serres et al., 1997) hoặc sự nhiễm khuẩn. Hình 1.3. Biểu hiện gen GUS trong mô bông chuyển gen (A) và đối chứng không chuyển gen (B) (Đỗ Tiến phát và cs., 2008) 6 Gần đây, một hệ thống chọn lọc khác được xem là “tích cực” có thể thay thế hệ thống chọn lọc dựa trên kháng sinh, chất diệt cỏ… bởi chất được sử dụng trong chọn lọc bản thân không gây độc cho thực vật và hoàn toàn không có hoạt động sinh học. Trong hệ thống chọn lọc tích cực, gen mã hóa một hoặc một số enzyme sẽ được đưa vào vector chuyển gen và cho phép các thực vật chuyển gen sử dụng các hợp chất chọn lọc trong môi trường để sinh trưởng, những tế bào không mang gen không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất chậm trên môi trường có chất chọn lọc. Một ví dụ về hệ thống chọn lọc tích cực được cung cấp bởi Joersbo và Okkels. Nghiên cứu này đã thử nghiệm với cây thuốc lá chuyển gen mã hóa β-glucuronidase bằng biến nạp gen vào lá thông qua Agrobacterim tumefaciens. Chất cytokinin glucuronide được cung cấp dưới dạng một cơ chất và bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Chỉ những tế bào biểu hiện GUS mới có thể chuyển hóa cytokinin glucuronide, những tế bào này có thể tăng sinh và biệt hóa thành rễ trong khi những tế bào không có hoạt động của GUS không có hiện tượng này (Joersbo & Okkels, 1996). Rất nhanh sau đó, hệ thống chọn lọc tích cực trong chuyển gen được phát triển không chỉ sử dụng cơ chất liên quan đến hormone thực vật mà cả những chất như nguồn carbonhydrate và nitơ, những chất cần thiết trong nuôi cấy mô. Hệ thống chọn lọc sử dụng carbonhydrate là một trong những hệ thống chọn lọc tích cực phổ biến và dễ dàng nhất bởi vì thực vật sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy đòi hỏi sự có mặt của nguồn carbon. Hơn nữa, hầu hết nguồn carbon thường dễ kiếm, rẻ và có thể thu nhận từ nhiều nguồn như sucrose, glucose và maltose. Nếu đưa một nguồn carbon thay thế cho carbon thực vật vẫn sử dụng vào trong môi trường, trong phần lớn các trường hợp nghiên cứu, tế bào thực vật sẽ không có khả năng phát triển và chết do các hợp chất sẽ được chuyển hóa và tạo sản phẩm trung gian làm thực vật nuôi cấy không thể sử dụng để phát triển. Ví dụ khi manose được dùng làm chất chọn lọc nó sẽ nhanh chóng được chuyển hóa thành manose-6-phosphate (M6P), một chất thực vật không thể hấp thụ chuyển hóa, bởi hoạt động của hexokinase. Trong trường hợp này, nếu thực vật có mang gen manA của E.coli mã hóa cho phosphomanose isomerase (PMI) thì PMI sẽ chuyển hóa M6P thành fructose-6-phosphate. Hệ thống chọn lọc PMI đã được triển khai hiệu quả khi tiến hành chuyển gen vào củ cải đường, ngô, lúa, lúa mì, Arabidopsis (Joersbo et al., 1998; Negrotto et al., 2000; Wang et al., 2000; Wringht et al., 2001; Lucca & Potrykus, 2001) và rất nhiều thực vật 7 hai lá mầm cũng như một lá mầm khác. Hiện nay, cả hai hệ thống chọn lọc tích cực và không tích cực đều được sử dụng trong chuyển gen thực vật (Brasileiro & Aragao, 2001). Phương pháp chọn lọc, phân tích cây chuyển gen bằng các chất chọn lọc mặc dù dễ thực hiện, chi phí thấp tuy nhiên đây chỉ là phương pháp sử dụng ban đầu để loại bớt những cây không mang gen trong quần thể cây tái sinh sau nuôi cấy vì phương pháp này không cho biết các gen cần chuyển đã được đưa vào cây hay chưa, các gen đưa vào có hoạt động không… Chính vì vậy cần phải có những phân tích sâu hơn ở mức độ phân tử. 1.2. PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập tự nhân và (3) ổn định như một đoạn DNA của genome trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp. Đây là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền vững của thể biến nạp, nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp. Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tượng nhân không tương hợp đối với gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân do vị trí đoạn gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ gần đó. Chính vì thế, các phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định sự có mặt của gen và biểu hiện của gen đó trong tế bào là bước làm rất cần thiết. 1.2.1. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm 1983. Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR. Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tíc được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để 8 giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính). (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát hiện các mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism- GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001). Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, terminator, gen chọn lọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được chuyển gen. 1.2.2. Phƣơng pháp xác định số copy trong cây chuyển gen Lai Southern để xác định số copy trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất. Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu dò nó còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây. Mẫu dò chính là một đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang. Các bước chính trong kỹ thuật Southern bao gồm: (1) tách chiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với 1 – 2 enzyme giới hạn mà điểm cắt không nằm trên gen; (3) Điện di trên gel agarose; (4) chuyển lên màng nitrosocellulose hay còn gọi là blotting; (5) Tổng hợp sợi DNA mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫu nhiên; (6) Lai mẫu dò với màng DNA và (7) Hiển thị trên phim X quang và phân tích kết quả. 9 Hình 1.4. Mô tả các bước trong kỹ thuật lai southern Hình 1.5. Kết quả lai Southern hai dòng cao lương chuyển gen SB1 và SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008) Hình 1.5 hiển thị kết quả lai southern hai dòng cao lương chuyển gen SB1 và SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008) cho thấy cây dòng SB4 xuất hiện một vạch còn SB1 xuất hiện nhiều vạch sản phầm lai điều đó có nghĩa dòng SB4 có một bản sao gen chuyển trong genome, đây là kết quả mong muốn trong chuyển gen vào thực vật. Gần đây, một kỹ thuật thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern trong việc phát hiện số copy trong cây chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q- PCR). Q-PCR có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu cần phân tích, ngoài ra còn dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu, chi phí và công sức (James et al., 2002; Bubner et al., 2004). Real-time PCR là khuếch đại DNA diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: (1) Khuếch đại DNA bằng PCR và (2) Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA được tạo thành. Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang. Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu được tăng cao lên từ chu kỳ ngưỡng tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA khuôn ban đầu. Có nhiều chất huỳnh quang đã được tìm ra và sử dụng rộng rãi. Một trong số chất được sử dụng rộng rãi nhất là TaqMan. TaqMan real- time PCR là một kỹ thuật trong đó sự tích lũy sản phẩm PCR đã được kiểm tra bởi sự có mặt của phát sáng huỳnh quang trong mỗi phản ứng. Tức là, trong thí nghiệm TaqMan, một mẫu dò đánh dấu 2 đầu (TaqMan) được thiết kế để lai với 10 đoạn trình tự giữa hai mồi. Mẫu dò này được tổng hợp với đầu 5‟ phát quang và đầu 3‟ có hoạt tính dập tắt huỳnh quang. Khi các mẫu dò còn nguyên vẹn thì chất phát ra từ những chất phát huỳnh quang sẽ bị dập tắt bởi đầu dập tắt và hiệu ứng huỳnh quang sẽ thấp không nhận biết được. Trong mỗi chu kỳ phản ứng PCR, các polymerase kéo dài từ một mồi bắt gặp đoạn lai và phân cắt mẫu dò từ 5‟-3‟ nhờ hoạt động exonuclease của Taq polymerase. Mẫu dò giải phóng ra chất huỳnh quang và phát quang. Kết quả là sự phát quang có thể định lượng sau mỗi phản ứng có liên quan đến lượng sản phẩm PCR được tích lũy. Hình 1.6. Mô tả phương pháp TaqMan định lượng sản phẩm PCR Để sử dụng real-time PCR trong xác định số copy của cây chuyển gen người ta dựa vào mối tương quan giữa giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) và số copy trong DNA mẫu ban đầu. Có nhiều phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm, có thể dựa vào Ct đo được với đường chuẩn thu được từ các nồng độ pha loãng khác nhau của một plasmid mang trình tự gen chuyển mà đã biết trọng lượng phân tử và nồng độ DNA chính xác từ đó tính tương đối số copy của mẫu cần kiểm tra. Hoặc một phương pháp tương đối hiệu quả trong việc xác định số copy bằng real-time PCR là phương pháp dựa vào giá trị Ct tương đối (2-ΔΔCt) (Ingham et al., 2001; Bubner et al., 2004). Phương pháp này dựa vào ΔCt là độ chênh lệch giữa Ct của cây chuyển gen (Ctt) và Ct của mẫu chuẩn là mẫu mang gen nội sinh mà đã biết chắc chỉ có một copy (Cte). Trong cùng một phản ứng với hiệu suất như nhau bằng cách làm chuẩn nồng độ DNA ban đầu đưa vào phản ứng, tất cả các mẫu có cùng giá trị ΔCt với mẫu chuẩn sẽ chứa một bản sao của gen chuyển. 1.2.3. Phân tích biểu hiện gen 11 Nghiên cứu biểu hiện của gen chuyển là rất cần thiết vì đây chính là mục đích của chuyển gen, nếu gen được đưa vào genome mà không được biểu hiện thì coi như không có giá trị. Biểu hiện gen trong sinh học phân tử là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể thực hiện phép lai Northern, RT-PCR hoặc lai in situ (lai tại chỗ) còn muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai Western, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme). Phƣơng pháp xác định biểu hiện gen qua mRNA Northern blot là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử để nghiên cứu biểu hiện sự phiên mã của gen bằng cách phát hiện các RNA trong mẫu nghiên cứu (Kevil et al., 1997). Kỹ thuật lai Northern cho phép sự tìm hiểu hoạt động điều khiển tế bào qua cấu trúc và chức năng bằng cách xác định mức độ biểu hiện của các gen thành phần trong suốt quá trình biệt hóa, tạo hình cũng như trong các điều kiện bất thường hoặc stress (Schlamp et al., 2008). Kỹ thuật này được nghiên cứu phát triển từ năm 1977 (Alwine et al., 1977) và nhanh chóng trở thành công cụ hỗ trợ hữu hiệu trong phân tích cây chuyển gen. Hầu hết các công trình nghiên cứu chuyển gen đều sử dụng kỹ thuật này để phát hiện mRNA của các dòng cây chuyển gen. Về nguyên lý Northern blot cũng dựa trên tính cặp đôi base bổ sung của 2 sợi nucleic acid như Sounthern blot. Trong phương pháp này, RNA tổng số được tách chiết và điện di trên gel agarose, sau đó thấm truyền lên màng lai nitrosocellulose với những mẫu dò đặc biệt được tổng hợp bằng PCR từ gen cần tìm với mồi ngẫu nhiên dài khoảng 6 nucleotide. Các mẫu dò có thể bám lên sợi đơn RNA hoặc sợi đôi DNA. Nếu kết quả dương tính, trên màng lai sẽ xuất hiện những băng sản phẩm lai. Gen được phiên mã càng mạnh thì tín hiệu lai càng rõ. Hình 1.6 mô tả kết quả lai Northern 2 dòng cao lương SB1 và SB4 chuyển gen ở thế hệ T1(Tuong Van Nguyen, 2008). Kết quả lai cho thấy vạch lai dòng SB1 đậm hơn dòng SB4 đồng nghĩa với lượng mRNA nhiều hơn điều này rất có thể do hoạt động phiên mã gen của dòng SB1 mạnh hơn. 12 Hình 1.7. (A) Kết quả lai Northern 2 dòng cao lương SB1 và SB4 chuyển gen thế hệ T1; (B) RNA tổng số. (Tuong Van Nguyen, 2008). RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) là kỹ thuật cho phép phát hiện rất nhanh sự biểu hiện gen trong cây chuyển gen, đặc biệt nếu trình tự gen chuyển có độ tương đồng thấp với các gen nội sinh trong genome cây chủ. Về cơ bản đây chính là kỹ thuật PCR nhưng khuôn để chạy phản ứng là cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số. RT-PCR gồm có các bước chính sau: (1) Tách chiết RNA tổng số từ mẫu cần phân tích; (2) Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA nhờ enzyme phiên mã ngược, đây là bước quan trọng để thực hiện RT- PCR vì DNA polymerase chỉ hoạt động trên khuôn DNA; (3) thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen quan tâm. Hạn chế của TR- PCR chính là việc định lượng và kiểm tra khả năng hoạt động của gen chuyển, ngoài ra có thể cho kết quả dương tính giả do sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi. Hạn chế này có thể khắc phục bằng cách sử dụng kỹ thuật real-time RT- PCR được phát triển từ kỹ thuật real-time PCR. Real-time RT-PCR là một kỹ thuật với độ nhạy cao cho phép định lượng số copy mRNA của một gen đặc hiệu (Freeman et al., 1999). Lai tại chỗ (In situ hybridization ) là một kỹ thuật ngoài xác định phần tử chuyển gen trong các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen, còn có thể nhận biết sự định vị của quá trình phiên mã trong các mô khác nhau. Kỹ thuật này đặc biệt giá trị khi mô đang phát triển hoặc promoter được sử dụng đặc hiệu để biểu hiện gen chuyển trong mô. Lai in situ có thể được tiến hành bằng cách lai giữa một sợi đơn đánh dấu (mẫu dò) bổ sung với trình tự mRNA đặc hiệu trong một mảnh mô hoặc cơ quan của thực vật. Chỗ mô cắt từ cây chuyển gen được cố định bằng nhiệt độ lạnh nhanh sau đó gắn vào màng lai methacrylate và được lai với mẫu dò. Mẫu dò sử dụng là sợi đơn có trình tự bổ sung với mRNA được 13 đánh dấu bằng DIG (Angerer et al., 1987). Kỹ thuật này có thể cho pháp phát hiện đồng thời 2 gen khác nhau trong một mẫu mô (gen chọn lọc và gen đích) bằng cách xen kẽ hai chất màu nhận biết để đánh dấu cho 2 mẫu dò RNA đặc hiệu với 2 gen (Long & Rebagliati, 2002; Lee et al., 2000). Phƣơng pháp xác định biểu hiện protein Kỹ thuật lai Western là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong phân tích để phát hiện protein dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Để tiến hành kỹ thuật này, trước hết protein toàn phần được tách chiết từ mẫu cần phân tích, sau đó điện di trên gel polyacrylamid (PAGE) và thấm truyền protein lên màng lai nitrosocellulose sau đó lai với kháng thể đã được tổng hợp từ trước nhờ kháng nguyên gốc tinh sạch hay kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể thực hiện thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay hiện phim thông qua phản ứng dạ quang ECL. Để phát hiện protein trong cây chuyển gen, người ta còn sử dụng kỹ thuật ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Đây là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu xét nghiệm với độ nhạy cao. Elisa được sử dụng trong nhiều lĩnh vựu nghiên cứu như y học, nông nghiệp và kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của Elisa là dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể được tiến hành trên pha rắn và gồm các bước chính sau: (1) Kháng nguyên chưa biết được gắn lên một bề mặt; (2) Kháng thể đã biết đã gắn kết với một enzyme được tráng qua bề mặt đó; (3) Thêm vào một cơ chất để enzyme chuyển hóa để tạo tín hiệu có thể xác định được bằng máy hoặc có thể nhận biết bằng mắt thường. Trong nghiên cứu có 3 phương pháp chính để tiến hành Elisa bao gồm Elisa gián tiếp, sanwich Elisa và Elisa cạnh tranh. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm riêng của nó và tùy từng điều kiện có thể sử dụng bất kỳ phương pháp nào. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật Elisa thường dùng để nhận biết sự có mặt của protein được mã hóa bởi gen chuyển để đánh giá sơ bộ mức độ biểu hiện gen đó. Ngoài ra đối với thực vật chuyển gen kháng virus, kỹ thuật này được sử dụng để kiểm tra mức độ kháng của các dòng cây chuyển gen thông qua lượng virus suy giảm sau một thời gian lấy nhiễm trên các dòng cây chuyển gen và đối chứng (Phạm Thị Vân, 2009). 14 2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NHÀ LƢỚI VÀ ĐỒNG RUỘNG. 2.1. PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA GEN CHUYỂN Sau khi đã khẳng định nguyên liệu tạo được là cây chuyển gen thực sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm, bước tiếp theo là phải xác định phương thức, đặc điểm di truyền của gen chuyển và tính trạng do gen chuyển mã hóa đồng thời kiểm tra mức độ đồng hợp tử của thế hệ con cái chúng bằng cách lai chéo hay tự phối hoặc lai phân tích. Biến nạp gen với mục đích cuối cùng là đưa được tính trạng mong muốn vào cây trồng, vì thế bước phân tích trực tiếp tính trạng đó là bước có giá trị quyết định cuối cùng. Các gen chuyển thuộc nhiều nhóm khác nhau vì thế phương pháp phân tích cũng khác nhau phụ thuộc vào tính trạng quan tâm có thể gồm các nhóm tính trạng sau: 2.1.1. Phân tích tính kháng bệnh Sâu bệnh là một trong những nguyên nhân chính làm suy giảm nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng cây trồng (Levine, 2007). Nghiên cứu tạo các giống cây có đặc tính kháng bệnh được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và đã thu được nhiều thành tựu đáng kể (He et al., 2009; Jackson et al., 2004; Kahs et al., 2008). Trong nghiên cứu tạo cây kháng bệnh, tính kháng virus, vi khuẩn, nấm hay kháng sâu thường được thử bằng hình thức lây nhiễm nhân tạo các tác nhân gây bệnh lên cây chuyển gen và thường được tiến hành với các phòng thí nghiệm bệnh học thực vật. Các quy trình thử nghiệm có thể xây dựng khác nhau và tùy thuộc vào từng đối tượng nghiên cứu. Đối với tính kháng sâu có thể cho sâu ăn trực tiếp các bộ phận của cây (thân, rễ, lá…) hoặc bổ sung dịch chiết protein của cây chuyển gen vào khẩu phần ăn và theo dõi biểu hiện của sâu thông qua các chỉ số về sinh trưởng phát triển và thời gian sống so với đối chứng (Lê Trần Bình, 2008). Đối với thử tính kháng virus có thể lây nhiễm bằng cơ học như tạo vết xước rồi nhiễm dịch chiết cây bệnh lên vết xước đối với những loại virus lây truyền tự nhiên (Phạm Thị Vân và cs., 2008) hoặc lây nhiễm thông qua côn trùng truyền bệnh (Inoue-Nagata et al., 2007) sau đó theo dõi mức độ kháng của các cây chuyển gen dựa vào các thang điểm bệnh chuẩn đã được các nhà bệnh học công bố. Dù sử dụng phương cách nào thì các điều kiện thí 15 nghiệm phải được chuẩn hóa và luôn sử dụng đối chứng là cây không chuyển gen (WT). Sau khi thử nghiệm ở phòng thí nghiệm hoặc nhà lưới, cần triển khai trên đồng ruộng nơi có áp lực bệnh cao qua một vài để kiểm chứng các dòng đã lựa chọn. Bước cuối cùng là khảo nghiệm trên đồng ruộng ở nhiều địa điểm khác nhau và phải qua ít nhất 2 vụ liên tiếp. 2.1.2. Phân tích tính chống chịu Tính chống chịu thường được kiểm tra bằng các thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo, tuy nhiên việc làm này không dễ. Đối với khô hạn có thể có nhiều cách bố trí thí nghiệm khác nhau như: (1) xử lý hạn bằng cách xử lý PEG hay đường saccharose, các chất này cạnh tranh nước với bộ rễ cây; (2) Bố trí thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong nhà hoặc trồng cây không tưới hoặc tưới phục hồi rất hạn chế, thí nghiệm được tiến hành với cây trồng trên cát sạch hoặc đất trồng trong chậu; (3) tiến hành trên thực tế tại những vùng khô hạn. Tương tự như vậy, khi nhiên cứu tính chịu mặn, phèn cần có những bố trí thí nghiệm tự nhiên và hợp lý nhưng không quá khác biệt với điều kiện bất lợi trong tự nhiên. 2.1.3. Phân tích gen cải tiến chất lƣợng sản phẩm Đây là loại phân tích dễ tiến hành nhất vì khi quan tâm đến tính trạng chất lượng nào thì sẽ tiến hành phân tích về chỉ tiêu chất lượng đó. Các tính trạng thường được quan tâm để cải tiến chất lượng cây trồng là tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng (đường, tinh bột, các amino acid…), tăng lượng chất sản xuất nguyên liệu (hàm lượng các chất gỗ, dầu…) hoặc các đặc tính khác như tính chín chậm ở cà chua, tính chống đổ của lúa … Các tính trạng có thể được quan sát bằng mắt thường, sử dụng các hình thức cân đong đo đếm và xử lý tính toán thống kê (đối với các tính trạng số lượng) hoặc dưới sự hỗ trợ của các kỹ thuật phân tích chỉ số sinh hóa (thường đối với các tính trạng chất lượng). 2.2. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ NHẬN BIẾT THỂ ĐỒNG HỢP TỬ CỦA THẾ HỆ SAU Khi chuyển một gen nào đó vào cây trồng, điều mong muốn nhất là chỉ một copy sẽ được đưa vào hệ gen. Sau khi sử dụng tất cả các phương pháp phân tích đủ chứng minh kết quả tạo cây chuyển gen đúng như mong muốn thì việc tiếp theo là phân tích sự phân li để lựa chọn các dòng đồng hợp tử ở thế hệ sau nhằm làm nguyên liệu phục vụ cho việc cải tiến giống. Theo quy luật phân li của Mendel, nếu gen chuyển vào nằm trên một nhiễm sắc thể thì khi các cây T0 tự 16 thụ phấn, tỉ lệ phân li các cây mang gen/cây không mang gen ở T1 sẽ là 3:1, còn nếu gen nằm trên 2 nhiễm sắc thể sẽ cho tỷ lệ 15:1 tương tự các trường hợp gen nằm trên 3, 4, 5… nhiễm sắc thể sẽ là (3:1)n trong đó n là số nhiễm sắc thể mang gen chuyển. Bước đầu tiên trong việc lựa chọn các dòng cây đồng hợp tử của thế hệ con là cho hạt T0 nảy mầm và chọn các dòng phân li 3:1. Sau đó những cây T1 mang gen sẽ tiếp tục cho tự thụ phấn (hoặc lai phân tích) để kiểm tra kiểu gen dựa vào sự phân li của T2. Nếu sự phân li T2 tiếp tục ra tỉ lệ 3:1 thì cây mẹ T1 là dị hợp còn nếu T2 cho toàn cây mang gen thì T1 là cây đồng hợp. Như vậy các cây đồng hợp có thể lựa chọn từ thế hệ T2 (hạt T1) trở đi. Các phương pháp sử dụng để nhận biết các cây mang gen ở các thế hệ T1, T2… bao gồm dựa vào đặc tính kháng chất chọn lọc hoặc bằng kỹ thuật PCR. Có thể gieo hạt cây T0 trong môi trường nuôi cấy in vitro, sau khi các hạt nảy mầm cắt chuyển sang môi trường kích thích ra rễ bổ sung chất chọn lọc, các cây mang gen sẽ ra rễ và sinh trưởng phát triển còn những cây không chứa gen sẽ không thể ra rễ rồi chết dần. Bằng cách này người ta có thể dễ dàng xác định được tỷ lệ phân li của T1. Đây là cách thường dùng nhất vì đơn giản, tiết kiệm chi phí mà tính chính xác khá cao. Ngoài ra, để xác định tỷ lệ phân li ở các thế hệ con cái còn có thể tạo vết cháy chất chọn lọc trên lá hoặc gieo hạt vào chậu thí nghiệm rồi phun chất chọn lọc lên… Một điều lưu ý khi phân tích tỷ lệ phân li thì số lượng mẫu phân tích cần đủ lớn để đảm bảo tính chính xác tương đối. Thông thường phải tiến hành ít nhất trên 30 mẫu. Số mẫu thử càng nhiều thì tính chính xác càng cao. Để đảm bảo tính chính xác trong việc xác định sự có mặt của gen và sự phân li gen chuyển ở các thế hệ sau cần phải tiến hành phản ứng PCR. Bằng cách gieo hạt nảy mầm sau đó thu lá tách chiết DNA và chạy PCR với mồi đặc hiệu của gen chuyển, dựa vào sự xuất hiện hay không của băng DNA sau điện di người ta dễ dàng biết chính xác sự phân li của các thế hệ con cái những dòng chuyển gen. Trong trường hợp này cây đã qua sinh sản hữu tính nên các biểu hiện dương tính giả do tạp nhiễm vi khuẩn được loại trừ hoàn toàn và kết quả thu được có độ tin cậy cao. 17 Hình 2.1. Kết quả phân tích tỷ lệ phân li của các dòng cao lương SH4 và SH7 chuyển gen thế hệ T1. (Tuong Van Nguyen, 2008) Hình 2.1 mô tả kết quả xác định tỉ lệ phân li các dòng cao lương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR (Tuong Van Nguyen, 2008). Dựa vào kết quả trên hình ta có thể thấy rõ dòng T1SH4 có tỉ lệ cây mang gen/không mang gen tương ứng là 19/6 phù hợp với tỷ lệ phân ly 3:1 còn dòng TSH7 có tỉ lệ phân ly xấp xỉ 15:1. Như vậy dòng T1SH4 gen chuyển nằm trên 1 nhiễm sắc thể còn T1SH7 nằm trên 2 nhiễm sắc thể khác nhau. Trong phân tích và lựa chọn dòng đồng hợp tử, các phương pháp xác định sự biểu hiện gen như lai Northern, Western và phân tích chức năng sinh học của gen chuyển cần được tiến hành lặp lại ở một vài thế hệ con để chứng minh sự ổn định của gen chuyển trong cây chuyển gen trước khi đưa vào làm nguyên liệu cho lai tạo giống mới. 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proc Natl Acad Sci USA 74 (12): 5350– 5365. 2. Angerer LM, Cox KH, Angerer RC (1987) Demonstration of tissuespecific gene expression by in situ hybridization. Meth Enzymol 152: 649– 661. 3. Brasileiro ACM and Aragao FJL (2001) Marker genes for in vitro selection of transgenic plants. Plant Biotech 3: 113–121. 4. Bubner B, Gase K, Baldwin IT (2004) Twofold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real- time PCR. BMC Biotechnol 4:14 5. Carleton KL and Kocher TD (2001) Cone opsin genes of African cichlid fishes: tuning spectral sensitivity by differential gene expression. Mol Biol Evol 18: 1540–1550. 6. Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008) Đánh giá ảnh hưởng của mật độ huyền phù vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông (Gossypium hirsutum L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.Tạp chí công nghệ sinh hoc số 6: 689-695 7. Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (1999) Quantitative RT-PCR: Pitfalls and potential. BioTechniques 26: 112–125. 8. Gause WC and Adamovicz J (1994) The use of PCR to quantitate gene- expression. PCR Methods Applicat. 3: S123–S135. 9. He KJ, Wang ZY, Zhang YJ (2009) Monitoring Bt resistance in the field: China as a case study.In: Ferry N, Gatehouse AMR (eds) Environmental impact of genetically modified/novel crops CAB International, Oxford, UK, 344–360 10. Hu CY, Chee PP, Chesney RH, Zhou JH, Miller PD (1990) Intrinsic GUS-like activities in seed plants. Plant Cell Rep 9: 1–5. 11. Ingham DJ, Beer S, Money S, Hansen G (2001) Quantitative realtime PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants. Biotechniques 31:132–140. 19 12. Inoue-Nagata A, Nagata T, de Avila AC, de BGordano L (2007) A reliable egomovirus inoculation method for screening Lycopersicon esculentum lines. Horticultura Brasileira 25: 447-450. 13.Jackson RE, Bradley JR Jr, Van Duyn JW (2004) Performance of feral and Cry1Ac-selected Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) strains on transgenic cottons expressing either one or two Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki proteins under greenhouse conditions. Entomol Sci 39:46–55 14. James C (2007) Global status of commercialized biotech/GM crops. ISAAA Briefs 37, ISAAA 15. Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447–8451. 16. Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987) GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. Embo 6: 3901–3907. 17. Joersbo M and Okkels FT (1996) A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection. Plant Cell 16: 219–221. 18. Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection for the production of transgenic sugar beet. Mol Breed 4: 111–117. 19.Kahn RS, Sjahril R, Nakamura I, MiiM (2008) Production of transgenic potato exhibiting enhanced resistance to fungal infections and herbicide applications. Plant Biotechnol 2:13–20 20. Kevil CG, Walsh L, Laroux FS, Kalogeris T, Grisham MB, Alexander JS (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem and Biophys. Research Comm. 238:277-279. 21. Kosugi S, Ohashi Y, Nakajima K, Arai Y (1990) An improved assay for β-glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely suppresses a putative endogenous β-glucuronidase activity. Plant Sci 70: 133–140. 22. Kunze I, Ebneth M, Heim U, Geiger M, Sonnewald U, Herbers K (2001) 2-Deoxyglucose resistance: a novel selection marker for plant transformation. Mol Breed 7: 221–227. 20 23. Lee MLT, Kuo FC, Whitmore GA, Sklar J (2000) Importance of replication in microarray gene expression studies: statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9834–9839 24. Levine MJ (2007) Pesticides: a toxic time bomb in our midst. Praeger, USA: 213–214 25. Lê Trần Bình (2008) Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt nam. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 26. Long S and Rebagliati M (2002) Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin - and dinitrophenol-labeled RNA probes. BioTechniques 32: 494–500. 27. Lopez SJ, Kumar RR, Pius PK, Muraleedharan N (2004) Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze). Plant molecular biology reporter 22: 201a-201j. 28. Lucca P, Ye X, Potrykus I (2001) Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent. Mol Breed 7: 43– 49. 29. Matthews PR, Wang MB, Waterhouse PM, Thornton S, Fieg SJ, Gubler F, Jacobsen JV (2001). Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent „twin T-DNAs‟ on standard Agrobacterium transformation vector. Mol Breed 7: 195- 202. 30. Muhitch MJ (1998) Characterization of pedicel β-glucuronidase activity in developing maize (Zea mays) kernels. Physiol Plant 104: 423–430. 31. Negrotto D, Jolley M, Beer S, Wenck AR, Hansen G (2000) The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Rep 19: 798–803. 32. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học số 6: 679 – 687. 33. Phạm Thị Vân (2009) Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm bằng kỹ thuật RNAi. Luận văn Thạc sỹ sinh học. 34. Schlamp K, Weinmann A, Krupp M, Maass T, Galle PR, Teufel A (2008) BlotBase: A northern blot database. Gene 427: 47-50 21 35. Serres R, McCown B, Zeldin E (1997) Detectable glucuronidase activity in transgenic cranberry is affected by endogenous inhibitors and plant development. Plant Cell Rep 16: 641–646. 36. Thomasset B, Ménard M, Boetti H, Denmat LA, Inzé D, Thomas D (1996) β-Glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic tobacco cells: specific elimination of plant inhibitors and minimization of endogenous GUS background. Plant Sci 113: 209–219 37. Tör M, Mantell SH, Ainsworth C (1992) Endophytic bacteria expressing β-glucuronidase cause false positives in transformation of Dioscorea species. Plant Cell Rep 11: 452–456. 38. Tuong Van Nguyen (2008) Genetic engineering of grain sorghum (Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement. Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological Siences. 39. Wang AS, Evans RA, Altendorf PR, Hanten JA, Doyle MC, Rosichan JL (2000) A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplast. Plant Cell Rep. 19: 654–660. 40. Wright M, Dawson J, Dunder E (2001) Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the hosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Rep 20: 429–436