Tiểu luận Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp

i trƣờng, ngƣời ta cho thêm cao ngô hoặc nƣớc chiết trái cây, nuôi vi khuẩn ở điều kiện nhiệt độ 28 - 320C trong thời gian 7-8 ng|y v| sau đó bảo quản lạnh, cấy chuyền định kì mỗi tháng 1 lần. - Nhân giống cho sản xuất thƣờng đƣợc thực hiện trong điều kiện kị khí bắt buộc. - Môi trƣờng cho nhân giống có lƣợng đƣờng ít hơn môi trƣờng lên men, còn các thành phần khác của môi trƣờng giống nhƣ môi trƣờng lên men. - Trong môi trƣờng, ngoài thành phần đƣờng ra, ngƣời ta còn cho thêm các muối amon, nƣớc amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 22 - Lƣu ý l| trong trƣờng hợp không dùng loài Prop.shermanii để sản xuất vitamin B12, ta dùng xạ khuẩn hoặc các vi khuẩn sinh metan thì phải thay đổi thành phần môi trƣờng v| điều kiện nuôi cấy. Ví dụ: xạ khuẩn phải nuôi trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, còn vi khuẩn sinh metan lại nuôi trong điều kiện yếm khí bắt buộc. Bảng 5. Môi trường nhân giống Glucose 0,5 – 1 % Cao ngô 1 – 2 % Clorua coban 1,5 – 2 ppm Pepton 0,1 % Dầu đậu nành 0,1 – 2 % pH 6,9 - 7 Nhiệt độ tiệt trùng 1210C Thời gian tiệt trùng 30 phút  Các biến đổi  Sinh học: - Vi khuẩn Prop.shermanii sử dụng cơ chất trong môi trƣờng để tăng sinh khối. - H|m lƣợng cơ chất trong môi trƣờng giảm theo thời gian, sinh khối vi khuẩn tăng.  Thiết bị nhân giống - Thiết bị có dạng hình trụ đứng v| đƣợc chế tạo bằng thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy. Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho t{c nh}n điều nhiệt để ổn định nhiệt độ canh trƣờng trong quá trình nhân giống. - Phần trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng kh{c nhau: cửa thông cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH…Cửa nạp môi trƣờng v| th{o canh trƣờng ra khỏi thiết bị thƣờng đƣợc bố trí ở phần đ{y. Ngo|i ra trong thiết bị còn có những đầu dò pH, nhiệt độ, oxy… để nhà sản xuất có thể theo dõi các giá trị này trong quá trình nhân giống. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 23 Hình 7. Thiết bị nhân giống 1. Hệ thống điều nhiệt(nh}n giống trong erlen). 2. Bình nh}n giống trung gian. 3. Thiết bị nh}n giống. 4. Hệ thống lọc t{ch bụi v| vi sinh vật. 5. Valve. 6. Bộ phận lọc hơi. 7. Bộ phận đo pH.  Thông số công nghệ - Dung tích erlen: 1 lít - Dung tích thiết bị nhân giống: 1m3 - Nhiệt độ nuôi cấy: 28-320C - pH=6.9-7 - Thời gian nuôi cấy: 7-8 ngày Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 24 2. CHUẨN BỊ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN  Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men.  Thành phần môi trƣờng Môi trƣờng lên men bao gồm: Nguồn cacbon, nguồn Nitơ, yếu tố tăng trƣởng, muối dinh dƣỡng, cobalt, glycine và có thể thêm sodium cyanide. - Nguồn cacbon là carbohydrate (dextrose, maltose, xylose, syrup bắp, sucrose, mật rỉ), acid hữu cơ nhƣ l| acid lactic. Khối lƣợng các hợp chất này chiếm từ 0,5% - 10% khối lƣợng môi trƣờng nuôi cấy. - Nguồn Nitơ l| c{c protein trong soybean, yến mạch, bắp, bột mì, dịch chiết nấm men, nƣớc Whey...Khối lƣợng chiếm 1% - 5% khối lƣợng môi trƣờng nuôi cấy. - Yếu tố tăng trƣởng cho vi sinh vật nhƣ l| dịch chiết nấm men, dịch khoai tây, bắp. - Muối: ammonium sulfate, magnesium sulfate, potasseum phosphate dibasic, potassium phosphate monbasic. Hợp chất cobalt: cobalt chloride, sulfate, nitrate. Bảng 6. Thành phần môi trường lên men Mật rỉ 4% Glucose 0,5 - 1% CaCO3 0,1% Clorua coban 1,5 - 10 ppm - Khi thêm glycine v|o môi trƣờng lên men nhƣ l| 1 chất bổ sung dinh dƣỡng thì h|m lƣợng vitamin B12 sẽ tăng lên. Trong khi một số loại acid amin nhƣ analine, leucine, isoleucine, tyrosine, methionine, acid glutamic không l|m tăng m| ngƣợc lại có thể làm giảm h|m lƣợng vitamin B12. - Trong sản xuất ngƣời ta bổ sung thêm 5,6 - dimetylbenzinaldazol l|m tăng sự tổng hợp vitamin B12. Ngoài ra, muối cobalt cũng đƣợc bổ sung v|o môi trƣờng với nồng độ 3 - 5µg/l. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 25  Các biến đổi: - Sinh học: Các loại vi sinh vật không mong muốn nhiễm vào môi trƣờng bị ức chế, tiêu diệt.  Thiết bị sử dụng: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20  Cấu tạo: gồm thùng chứa môi trƣờng dinh dƣỡng, bơm ly t}m, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số của quá trình.  Nguyên tắc hoạt động: Trƣớc khi bắt đầu hoạt động tất cả các thiết bị, đƣờng ống dẫn và phụ tùng YHC đƣợc thanh trùng bằng hơi qu{ nhiệt. Hơi nƣớc đƣợc đƣa v|o bộ đun nóng theo đƣờng viền của van điều chỉnh tiêu hao hơi, sau đó v|o bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt v| theo đƣờng viền của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát. Cùng lúc mở các van xả nƣớc ngƣng v| khi đạt đƣợc nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng. Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trƣờng dinh dƣỡng, môi trƣờng mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng.  Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: 1210C. - Thời gian tiệt trùng: 30 phút. - pH=6.5-7. - Tốc độ bơm môi trƣờng: 3.5 m3/s. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 26 Hình 8. Thiết bị tiệt trùng YHC 1- Thùng chứa 2- Bơm 3- Bộ đun nóng 4- Bộ giữ nhiệt 5- Bộ lấy mẫu 6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát 8- Thiết bị lên men 3. LÊN MEN  Mục đích: Khai th{c: L|m tăng hàm lƣợng vitamin trong tế bào vi sinh vật  Các biến đổi:  Quá trình lên men gồm có 2 giai đoạn: - Giai đoạn đầu kị khí, - Giai đoạn sau hiếu khí.  Thời gian cho mỗi giai đoạn là 72 - 88 giờ. - Vật lý: Nồng độ vitamin B12 sẽ tăng nhanh trong giai đoạn hiếu khí, khoảng 25 – 40 mg vitamin B12/l. - Hóa học: pH môi trƣờng thay đổi. Ta điều chỉnh pH bằng cách thêm dextrose, sucrose, hoặc thêm ammonium hydroxide, potassium phosphate dibasic, urea, calcium carbonate. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 27  pH tối ƣu của môi trƣờng lên men vào khoảng 7 – 7,5. Nếu pH qu{ cao, môi trƣờng mang tính kiềm, nó sẽ phân hủy sản phẩm cuối, hoặc ngăn cản quá trình tạo thành vitamin B12, vì thế h|m lƣợng vitamin B12 sẽ giảm đi.  Nếu pH quá thấp, tốc độ tăng trƣởng của vi sinh vật bị kiềm hãm, dẫn đến giảm h|m lƣợng vitamin B12. Nhiệt độ tối ƣu cho qu{ trình lên men là 28 - 320C. - Sinh học: Vi sinh vật sinh tổng hợp vitamin B12 trong tế bào.  Đ}y l| một quá trình rất phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn khác nhau nhờ sự tham gia của rất nhiều enzym.  Quá trình bắt đầu bằng sự tạo th|nh c{c porphinin, sau đó l| gắn nucleotat và các thành phần khác vào. Porphinin của vitamin B12 khác với porphinin của xitocrom, clorofin ở chỗ nó chứa rất nhiều nhóm – CH2CH2COOH và – CH3. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 28  Coban trong cấu tạo vitamin B12 đƣợc gắn vào bằng ba hóa trị thông thƣờng và ba hóa trị phụ. Chính côban tạo m|u đỏ cho vitamin B12.  Sự tạo thành porphinin bắt đầu từ succinat (đ}y l| sản phẩm trung gian của chu trình Krebs). Dẫn xuất của axit xucxinic là succinyl - CoA sẽ kết hợp với glyxin và tạo thành chu trình succinat-glyxin. Từ đó porphinin đƣợc tạo th|nh trên cơ sở acid -  - amino -  - cetoadipic sinh ra đƣợc khử cacboxyl thành monopyrol porphobilinogen  Coenzym B12 là một hợp chất có 5 - dezoxyadenozyl ở vị trí của nguyên tử Carbon trung tâm thay cho nhóm xianit. Coenzym corinoid tham gia vào phản ứng của các metylmalonyl - mutaza là phản ứng chuyển succinyl - CoA thành metylmalonyl - CoA trong lên men propionic.  Dƣới tác dụng thông khí, cacbinamit-5-dezoxyadenozin đƣợc chuyển thành 5,6 – dimetyl - benzinmidazol cobanit – 5 - dezoxyadenozin tức là phần quan trọng nhất đối với sự tạo thành vitamin B12.  Bên cạnh acid propionic, acid acetic cũng đƣợc sản xuất trong điều kiện yếm khí, với tỉ lệ 2:1. Acid propionic ở h|m lƣợng thấp có thể ức chế các vi sinh vật nhiễm v|o môi trƣờng lên men nhƣ vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn acid acetic. Propionibacterium có thể chịu đƣợc nồng độ acid propionic xấp xỉ 20g/l (pH lên men gần bằng 7), đ}y cũng l| nồng độ tại đó sự tạo thành acid propionic bị kiềm hãm. Acid propionic không phân ly là chất độc đối với Propionibacterium shermanii. Tốc độ sinh trƣởng riêng giảm nhanh khi nồng độ acid propionic trên 5 mM. H|m lƣợng acid propionic lớn nhất chấp nhận đƣợc khi lên men đạt 25 - 35g sinh khối/l. H|m lƣợng acid propionic là 1 yếu tố hạn chế sự tăng sinh khối, và sản xuất vitamin B12.  Thiết bị lên men: Ta sử dụng hệ thống gồm nhiều bình lên men nối tiếp. Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tƣơng tự nhƣ thiết bị nhân giống vi sinh vật. Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, đƣợc chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy v| c{c đầu dò nhiệt độ, pH… để có thể theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Motor cho cánh khuấy thƣờng đƣợc đặt phía trên nắp thiết bị. Còn Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 29 cửa nạp v| th{o môi trƣờng đƣợc bố trí phía đ{y. Ngo|i ra thiết bị còn có cửa quan sát, van lấy mẫu… Hình 8. Thiết bị lên men Hình 9. Thiết bị lên men vitamin B12 trong công nghiệp  Thông số công nghệ của thiết bị lên men - Thông khí bằng cách khuấy đảo liên tục. - Tốc độ thông khí: 0.5 lít/phút. - Lên men trong 6 - 8 ngày. - Nhiệt độ lên men 28 - 300C. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 30 4. LY TÂM  Mục đích: - Chuẩn bị:Tách sinh khối ra khỏi canh trƣờng lên men, chuẩn bị cho quá trình acid hóa thu vitamin B12. - Khai thác: Tập trung vi khuẩn thành váng trên bề mặt để thu sinh khối vi sinh vật.  Các biến đổi: - Vật lý: Độ nhớt dung dịch giảm, nhiệt độ dung dịch tăng. Thực tế c{c cobamide đƣợc hình th|nh trong qu{ trình lên men đƣợc tích tụ trong tế b|o. Bƣớc đầu tiên l| t{ch tế b|o từ môi trƣờng lên men. M{y ly t}m tốc độ cao đƣợc sử dụng để tập trung vi khuẩn th|nh v{ng trên bề mặt, trong khi m|ng lọc đƣợc sử dụng để t{ch tế b|o.  Thiết bị sử dụng: thiết bị ly tâm lọc. Trên thành thùng quay của máy ly tâm lọc có đục lỗ v| đƣợc bọc bằng các lớp lƣới hoặc vải có kích thƣớc lỗ phù hợp với tính chất sản phẩm. Dƣới tác dụng của lực ly tâm pha lỏng bắn ra qua các lỗ, pha rắn nằm lại trên thành máy. Hình 10. Máy ly tâm lọc  Thông số công nghệ - Tốc độ quay: 4000 vòng/phút. - Năng suất nhập liệu: 363 lít/ phút. - Công suất động cơ: 30 KW. - Khối lƣợng thiết bị: 1.9 tấn. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 31 5. ACID HÓA Vào lúc kết thúc quá trình thì coenzym B12 trong tế b|o đƣợc giải phóng nhờ phƣơng ph{p acid hóa bằng cách bổ sung KCN m| đƣợc chuyển thành cyancobalamin tức là vitamin B12 thật sự.  Mục đích: Khai th{c: Sau khi li t}m để thu tế bào vi sinh vật, ta sẽ tiến hành acid hóa để giải phóng vitamin B12 là sản phẩm nội bào của vi sinh vật.  Các biến đổi: Sinh học: Dƣới t{c động của acid, nhiệt, cyanide hoặc c{c phƣơng pháp khác sẽ phá vỡ thành tế bào vi sinh vật, giải phóng vitamin B12. Biện pháp bổ sung dung dịch cyanide để phân ly coenzyme khỏi vitamin và kết quả là tạo thành cyanocobalamin.  Thiết bị sử dụng: caùnh khuaáy thaùo lieäu boä phaän gia nhieät sinh khoái acid Hình 11. Thiết bị acid hóa  Thông số công nghệ: - Đƣờng kính cánh khuấy: 0.5m - Tốc độ cánh khuấy: 120 rpm. - Nhiệt độ bộ phận gia nhiệt: 550C Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 32 6. HẤP PHỤ Chất lỏng chứa vitamin B12 và tạp chất đƣợc tiếp xúc với 1 chất hấp phụ nhƣ divinylbenzene/styrene copolymer resin ở nhiệt độ 10 - 300C, và vitamin B12 chỉ đƣợc hấp phụ bởi resin.  Mục đích: Khai th{c: l|m tăng h|m lƣợng vitamin B12 bằng cách hấp phụ vitamin trên divinylbenzene/styrene copolymer resin, tách vitamin khỏi tạp chất.  Các biến đổi:  Hóa lý: Vitamin B12 đƣợc hấp phụ bởi nhựa trao đổi ion cation (cation ion exchange resin), vitamin sẽ bền vững hơn, đặc biệt trong điều kiện có acid và chất bất lợi nhƣ acid ascorbic, kim loại… - pH giảm trong quá trình hấp phụ đến vùng resin hoạt động hiệu quả. - Nhiệt độ quá trình này vào khoảng 15 - 250C, có thể thấp hơn hoặc cao hơn, 1 gam resin có thể hấp thu 1,5 gam vitamin B12. - Tuy nhiên điều này còn phụ thuộc v|o độ tinh sạch của vitamin, nồng độ của dung dịch, nhiệt độ, resin, pH, và các yếu tố khác. Hình 12. Ion exchange resin Resin là acid polyacrylic hoặc acid polymethacrylic, m| trong đó có những phân tử nối với nhóm divinyl thơm nhƣ l| divinylbenzenne. Resin có tên thƣơng mại là Amberlites.  Vật lý: Sự hiện diện của muối vô cơ hòa tan trong qu{ trình hấp phụ vitamin B12 bằng resin sẽ làm giảm một cách tích cực tỉ lệ hấp phụ.  Thông số công nghệ: - Kích thƣớc resin: 10-8 – 10-7 m, tối thiểu là 10-4m, diện tích bề mặt riêng: ít nhất là 200m2/g Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 33 - Một số loại resin: Amberlite XAD-2, DIAION HP-20, HP-21, HP-2 mG.  Nguyên nhân của việc lựa chọn resin để hấp phụ vitamin B12 Vitamin B12 đƣợc hấp phụ trên resin thì không bị ảnh hƣởng bởi dịch dạ d|y, qua hệ thống dạ d|y, xuống ruột, pH cao hơn, vitamin sẽ tho{t khỏi resin, đi v|o hệ thống ruột. Để kiểm chứng điều n|y ta l|m nhƣ sau:  Pha 1 lít dung dịch chứa 1.4g NaCl, 0.5g KCl, 0.06g CaCl2, 6.94 g acid HCl 36%, 3.2g pepsin.  Hòa tan 2g resin đã hấp thu vitamin B12 vào 200ml dung dịch, để trong 4h. Kết quả là chỉ có dƣới 10% vitamin B12 bị tách khỏi resin, hơn 90% vitamin vẫn còn lại trên resin.  Tuy nhiên, với dịch ruột gồm NaHCO3 và dịch tụy, thì trong vòng 30 phút, toàn bộ vitamin bị tách khỏi resin. Một thí nghiệm khác là trộn 6.88g resin có chứa vitamin B12 với 7.5g acid ascorbic, 17.82g sucrose, 14.62g lactose, 3.56g bột bắp, thêm 4.5 ml dung dịch gum acacia, sau đó sấy ở 1200C, rồi ép thành viên. Sau 4 tuần, ở 500C, hàm lƣợng vitamin B12 vẫn còn nhiều, khá bền với nhiệt. Hoặc ta có thể trộn 10mg resin-vitamin B12 với 10g vitamin B1, 10g riboflavin, 50g niacinamide, 5g calcium pantothenate, đóng th|nh viên.  Yêu cầu: Những tế b|o chƣa bị acid hóa cũng đƣợc hấp phụ trên resin, để tránh làm tổn hại đến những tế bào này, ta phải tiến h|nh trong điều kiện môi trƣờng trung tính, tránh nhiệt độ quá cao. Dịch lên men phải tƣơng đối tinh sạch: không chứa các tạp chất màu, mùi khó chịu. Qu{ trình hấp phụ diễn ra ở nhiệt độ phòng, gi{ trị pH tối ƣu v| thời gian tối ƣu tiếp xúc tiếp xúc với resin phụ thuộc v|o chất lƣợng dung dịch chứa vitamin v| h|m lƣợng tạp chất trong dung dịch. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 34 7. GIẢI HẤP  Mục đích: Khai th{c: tăng h|m lƣợng vitamin B12, rửa resin bằng dung dịch đệm pH thu hồi vitamin B12 và thu hồi resin để tái sử dụng.  Các biến đổi: Sau đó resin n|y đƣợc đem rửa với nƣớc hoặc dung dịch cồn có độ cồn thấp hơn 20%, hoặc dung dịch acid yếu. Dung dịch thu đƣợc có thể chứa cồn ở nồng độ 20% methanol, 10% ethanol hoặc 5% isoprpanol, hoặc 1 dung dịch acid yếu nhƣ dung dịch acid phosphoric 1%, acid acetic 1%, acid boric 1%, hoặc acid clohydric 0,1%. Quá trình phân tách vitamin B12 bao gồm: 1. Mang dung dịch chứa vitamin B12 và tạp chất tiếp xúc với divinylbenzene/styrene copolymer resin. 2. Vitamin B12 đƣợc hấp phụ trên resin. 3. Dùng chất rửa thích hợp để thu hồi vitamin B12. Chất rửa là dung dịch chứa nƣớc có các hợp chất đƣợc chọn lọc từ ketone mạch ngắn, ester mạch ngắn, ether mạch ngắn. 4. Thu dung dịch rửa.  Thiết bị sử dụng: Ta sử dụng thiết bị hấp phụ kết hợp giải hấp Hình 13. Thiết bị giải hấp Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 35 8. CÔ ĐẶC  Mục đích: - Chuẩn bị cho quá trình kết tinh vitamin B12. - Khai th{c: tăng nồng độ vitamin trong dung dịch đến nồng độ 15- 30%. H|m lƣợng vitamin B12 là 4-7 mg/kg.  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, nhiệt độ tăng. - Hóa lý: Nƣớc từ trạng thái lỏng chuyển qua trạng th{i hơi v| tho{t ra môi trƣờng xung quanh.  Thiết bị sử dụng: Qu{ trình cô đặc đƣợc thực hiện bằng thiết bị cô đặc chân không với buồng đốt có ống tuần hoàn ngoài và có kèm theo thiết bị ngƣng tụ Baromet. Hình 14. Thiết bị cô đặc chân không  Thông số công nghệ PCK 720mmHg Phơi  2kg/cm2 Thời gian 23h (khi đạt Bx yêu cầu) Nhiệt độ 800C Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 36  Nguyên tắc hoạt động Dung dịch đi v|o buồng đốt đƣợc đun sôi để tạo th|nh hỗn hợp hơi lỏng đi v|o buồng bốc, ở đ}y hơi thứ đƣợc t{ch ra v| đi lên phía trên. Dung dịch quay về buồng đốt theo ống tuần ho|n ngo|i. Thiết bị hoạt động theo nguyên tắc đối lƣu tự nhiên do sự chênh lệch khối lƣợng riêng ở những vùng nguyên liệu có nhiệt độ kh{c nhau. Ở buồng bốc, nguyên liệu bốc hơi l|m tăng độ Bx, dẫn đến l|m tăng khối lƣợng riêng, ở buồng đốt đƣợc gia nhiệt nên khối lƣợng riêng nhẹ hơn. Do vậy m| nguyn liệu sẽ tuần ho|n từ buồng bốc sang buồng đốt v| đẩy nguyn liệu từ buồng đốt sang buồng bốc. Khi nồng độ chất khô đạt yêu cầu, dung dịch sẽ đƣợc xả xuống theo từng mẻ. Hỗn hợp lỏng – hơi trong buồng bốc đƣợc ph}n ly nhờ hai yếu tố: chiều cao buồng bốc v| sự thay đổi qu{n tính của hỗn hợp khi v|o bộ phận t{ch bọt. Hơi thứ đi v|o thiết bị Baromet v| đƣợc l|m nguội tại đ}y. 9. KẾT TINH  Mục đích: - Khai th{c: h|m lƣợng vitamin tăng lên - Hoàn thiện : độ tinh sạch của vitamin cao hơn  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, độ nhớt giảm, nhiệt độ giảm. - Hóa lý: trong quá trình kết tinh, biến đổi hóa lý là chủ yếu.Nƣớc bị bốc hơi l|m độ hòa tan của vật liệu giảm, dung dịch dần đạt đến trạng thái bão hòa và quá bão hòa. Có sự tạo mầm tinh thể, sau đó c{c tinh thể vitamin lớn lên theo yêu cầu. - Một phần dung môi đƣợc bay hơi. Hơi bay ra theo đƣờng bơm ch}n không. Nhiệt độ của dung dịch ở trạng thái bão hòa sẽ giảm đến nhiệt độ sôi tƣơng ứng với áp suất chân không trong thiết bị. Dung dịch đạt quá bão hòa và kết tinh. Dung môi bay hơi không chỉ do nhiệt độ vật lý của dung dịch mà còn do sự tỏa nhiệt khi kết tinh. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 37 - Kết tinh tiến h|nh đồng thời bay hơi do hút ch}n không v| l|m lạnh sẽ làm quá trình diễn ra nhanh hơn, do đó c{c tinh thể sẽ hạn chế dính vào bề mặt thiết bị và thời gian rửa thiết bị sẽ đƣợc rút ngắn.  Thiết bị: thiết bị kết tinh chân không Hình 15. Thiết bị kết tinh chân không  Thông số công nghệ: - Áp suất chân không: 720mmHg - Nhiệt độ: 300C - Thời gian : 2 - 3h Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 38 10. LY TÂM  Mục đích: - Chuẩn bị: chuẩn bị cho quá trình sấy tiếp theo - Khai th{c: tăng h|m lƣợng vitamin - Hoàn thiện: độ tinh sạch của sản phẩm vitamin càng cao  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích hỗn hợp giảm do nƣớc và các tạp chất đƣợc tách ra.  Thiết bị: máy lọc ly tâm Hình 16. Thiết bị lọc ly tâm  Thông số công nghệ: - Tốc độ quay: 1000 vòng/phút - Thời gian ly tâm: 6 phút. - Năng suất nhập liệu: 300 lít/phút - Công suất động cơ: 30 KW - Khối lƣợng thiết bị: 1 tấn Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 39 11. SẤY  Mục đích: - Hoàn thiện: sản phẩm vitamin khô.  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, nhiệt độ hỗn hợp tăng - Hóa lý: nƣớc bốc hơi  Thiết bị: thiết bị sấy chân không hai nón Hình 17. Thiết bị sấy chân không 2 nón - Thiết bị n|y đƣợc dùng phổ biến để sấy những nguyên liệu nhạy cảm với nhiệt độ. Thiết bị hình trụ có lớp vỏ áo gia nhiệt bằng hơi hoặc dầu. Quá trình gia nhiệt đƣợc thực hiện dƣới điều kiện chân không, tốc độ khuấy nhẹ nhàng. - Thiết bị n|y có {p suất cao, ngay cả trong trƣờng hợp dung môi ít bay hơi, cho sản phẩm có độ ầm thấp. Bề mặt hình học của của lớp {o nhiệt, cho phép giảm thời gian của giai đoạn sấy, l|m tăng tính ổn định v| chất lƣợng của sản phẩm. Bụi sinh ra trong qu{ trình sản xuất sẽ đƣợc khử bởi hệ thống lọc đặt phía trên hệ thống t{ch hơi nƣớc. Thiết bị n|y đƣợc dùng để sản xuất trong điều kiện vô trùng. - Đối với thiết bị sấy ch}n không, ngƣời ta thƣờng dùng thùng hình nón. - Hệ thống kiểm so{t bụi bằng thiết bị lọc đặt trên đƣờng ống bơm chân không Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 40 Hình 18. Thiết bị sấy chân không  Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: 40 - 450C - Áp suất chân không: 720mmHg Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 41 Phần IV: SẢN PHẨM Tinh thể vitamin B12 tạo th|nh có m|u đỏ do có chứa kim loại coban, có kích thƣớc kh{c nhau. Sau đó ngƣời ta sẽ dùng nguyên liệu n|y để tạo thành các sản phẩm dƣợc phẩm chứa vitamin B12 trên thị trƣờng. Hình 19. Tinh thể vitamin B12  Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm Hình 20. Sản phẩm bột vitamin B12 Bảng 7. Chỉ tiêu sản phẩm vitamin B12 Cyanocobalamin 93% khối lƣợng Độ ẩm ≤ 8% Vi sinh Không có M|u sắc Sản phẩm m|u đỏ nhạt, bột rời, không kết dính Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 42  Quy trình sản xuất viên con nhộng hay viên nén chứa vitamin B12 Hình 21. Sản phẩm viên nén chứa vitamin B12 a. Viên con nhộng hay viên nén vitamin thƣờng chứa các chất phụ gia thêm vào trong quá trình sản xuất để cơ thể có thể hấp phụ đƣợc các vitamin này. Lactose, calci hoặc malto - dextrin đƣợc dùng làm chất độn trong các viên vitamin. Magie stearat hoặc acid stearic thƣờng đƣợc thêm vào viên nén với vai trò là chất bôi trơn. C{c phụ gia này giúp bột vitamin dễ nén thành viên hoặc thành viên con nhộng. Tinh bột hoặc gum cellulose biến tính thƣờng đƣợc cho v|o nhƣ l| một tác nhân làm phân hủy. Nó giúp hợp chất vitamin dễ hấp phụ trong cơ thể ngƣời. Viên nén vitamin thƣờng đƣợc bọc một lớp áo ngo|i để tạo màu sắc, hƣơng vị riêng.Điều n|y giúp x{c định cách hấp phụ thuốc trong cơ thể. Những lớp {o n|y đƣợc làm từ cellulose. b. Nhiều loại thảo mộc, chất kho{ng nhƣ canxi, sắt, kẽm đƣợc thêm vào hợp chất vitamin. c. Kiểm tra nguyên liệu Nhà sản xuất vitamin sẽ mua những nguyên liệu vitamin từ các nhà phân phối uy tín. Nguyên liệu vitamin đƣợc cung cấp phải có chứng nhận phân tích thành phần. Trong nhiều trƣờng hợp, nhà sản xuất sẽ gửi mẫu nguyên liệu đến nhiều phòng thí nghiệm độc lập để phân tích. d. Nhào trộn sơ bộ Nếu nguyên liệu không đƣợc kết hạt tốt, nó sẽ lọt qua máy xay và trở thành cặn. Một v|i vitamin đƣợc nhào trộn sơ bộ với các chất độn nhƣ malto-dextrin. Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm có thể kiểm tra nhanh các mẻ Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 43 nguyên liệu khi làm việc với các thành phần mới và quyết định có cần thiết phải nhào trộn không. e. Làm ẩm nguyên liệu Đối với viên nén vitamin, kích thƣớc viên thuốc rất quan trọng để x{c định sự tạo hình bằng máy tạo viên nén. Trong nhiều trƣờng hợp, nguyên liệu vitamin đƣợc cung cấp từ các nhà phân phối đã có kích cỡ thích hợp cho sự tạo viên. Tuy nhiên một số trƣờng hợp cần phải làm ẩm nguyên liệu để tạo điều kiện cho quá trình kết hạt. Hình 22. Khuấy trộn thuốc Trong qu{ trình n|y, bột vitamin đƣợc trộn với nhiều loại cellulose, sau đó đƣợc l|m ẩm. Sau đó, hỗn hợp đƣợc sấy khô bằng m{y sấy. Sau khi sấy khô, hỗn hợp đƣợc đi qua m{y nghiền. Dƣới t{c dụng của m{y nghiền, c{c m|nh nguyên liệu lớn sẽ đƣợc l|m nhỏ hơn v| đạt đƣờng kính mong muốn. Sau đó hỗn hợp n|y sẽ đƣợc đem c}n v| trộn. f. Cân và trộn Tiếp theo, công nhân sẽ đem c}n hỗn hợp nguyên liệu. Sau khi cân, dùng máy trộn để trộn đều hỗn hợp khoảng 15-30 phút. Sau khi hoàn tất quá trình trộn, hỗn hợp sẽ đƣợc đem ép th|nh viên nén hay viên con nhộng. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 44 Hình 23. Sơ đồ tạo viên con nhộng và viên nén Hỗn hợp vitamin đƣợc ép th|nh viên, có thể đƣợc bọc {o hoặc l|m th|nh viên con nhộng. g. Đ{nh bóng v| kiểm tra Viên con nhộng vitamin đƣợc đƣa v|o m{y đ{nh bóng. Bụi hoặc bột vitamin sót lại sẽ đƣợc chải sạch. h. Tạo viên Viên nén vitamin đƣợc tạo th|nh từ m{y ép viên. Sau khi hỗn hợp vitamin đƣợc trộn trong m{y trộn, nó sẽ đƣợc đổ v|o phễu gắn phía trên m{y trộn v| đƣợc ép th|nh viên dƣới t{c dụng của {p suất. Tốc độ quay của thiết bị sẽ quyết định năng suất tạo viên. Sau đó viên nén đƣợc đƣa qua s|ng rung để loại c{c hạt bụi rồi đƣợc chuyển đến bộ phận bọc {o. i. Bọc áo Việc bọc {o giúp viên thuốc dễ nuốt, giúp {t mùi vị khó chịu của thuốc, làm viên thuốc có m|u sắc mong muốn. Việc bọc {o còn giúp chống lại acid dạ d|y để viên thuốc có thể đƣợc hấp phụ tại ruột. Sau khi đƣợc bọc {o, tiến h|nh sấy thuốc để chuẩn bị đóng gói. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 45 Phần V: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ I. Nghiên cứu khám phá ra bí ẩn cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp vitamin B12: Ð}y l| biểu đồ hình dải băng của enzym BluB m| c{c nh| nghiên cứu của MIT đã cho thấy việc xúc t{c tạo th|nh DMB ,một đoạn của vitamin B12. Những hình que (m|u v|ng, đỏ v| xanh dƣơng) đại diện cho những cofactor m| enzym bù đắp để tạo nên DMB. (Hiệu đính: phòng thí nghiệm Graham Walker). B12 l| vitamin phức tạp nhất về mặt hóa học v| cần thiết cho sức khỏe của con ngƣời. 4 giải thƣởng Nobel đã đƣợc trao tặng cho những nghiên cứu liên quan đến B12 nhƣng có 1 đoạn của ph}n tử vẫn còn l| bí ẩn cho đến ng|y nay. Khoa học đã tìm ra một vi sinh vật đột biến có 1 enzyme ở thể khuyết đƣợc biết đến nhƣ l| BluB l|m cho nó không thể tổng hợp đƣợc B12. BluB l|m chất xúc t{c cho sự hình th|nh một đoạn B12 v| DMB nối với 1 đoạn kh{c tạo nên vitamin, DMB cũng có thể đƣợc sản xuất theo một c{ch riêng biệt kh{c. Một trong những khía cạnh bất thƣờng nhất trong qu{ trình tổng hợp với chất xúc t{c BluB l| sự bù đắp cofactor lấy từ 1 vitamin kh{c l| B2. Trong suốt qu{ trình phản ứng, cofator B2 t{ch ra th|nh hơn 2 đoạn m| một đoạn trong đó sẽ trở th|nh DMB. Bình thƣờng, cofactor bắt nguồn từ B2 sẽ tham gia phản ứng bằng c{ch giữ electron tạm thời v| sau đó cho eletron đi. Những cofator đó không đƣợc dùng trong phản ứng. Sự bù đắp cofactor rất ít đƣợc quan s{t trƣớc khi tổng hợp vitamin hay theo bất cứ con đƣờng tổng hợp sinh học n|o. Hầu nhƣ không có một dẫn chứng kh{c về việc cofactor đƣợc dùng nhƣ chất nền. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 46 Một đầu mối ban đầu về chức năng của BluB l| có một gen liên kết với nó nằm gần nhiều những gen kh{c liên quan đến sự tổng hợp B12 trong một loại vi khuẩn kh{c.. Vấn đề tại sao vi khuẩn trong đất có thể tổng hợp đƣợc vitamin B12 vẫn đang đƣợc nghiên cứu. Vi sinh vật trong đất không đòi hỏi phải có B12 để tồn tại, v| c}y n|o m| chúng b{m v|o cũng không cần B12, việc tổng hợp B12 có thể giúp vi khuẩn có khả năng chống lại những ‚th{ch thức‛ do c}y cối g}y ra trong suốt qu{ trình hình th|nh mối quan hệ cộng sinh. Có hơn 30 gen liên quan đến quá trình tổng hợp vitamin B12 . II. Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 1. Nguyên lý chung: Kỹ thuật di truyền hiện đại l| kỹ thuật t{i tổ hợp gen. Nếu qu{ trình lai giống trong kỹ thuật di truyền cổ điển bị hạn chế trong c{c qu{ trình chuyển tải di truyền chỉ trong một lo|i thì trong kỹ thuật di truyền hiện đại không giới hạn trong một lo|i. Nếu kỹ thuật tạo đột biến(đột biến điểm) bằng c{c t{c nh}n hóa học hay lý học trong kỹ thuật di truyền cổ điển giới hạn ở sự không định hƣớng của c{c biến đổi di truyền, thì trong kỹ thuật di truyền hiện đại ngƣời ta có thể dự đo{n v| thu đƣợc những đột biến theo mong muốn. Nhƣ vậy, có hai đặc điểm quan trọng của di truyền hiện đại l| không bị giới hạn lo|i v| c{c biến đổi di truyền có định hƣớng. Kỹ thuật di truyền hiện đại dựa v|o những ph{t hiện quan trọng trong thế giới vi sinh vật a. Plasmid L| một loại DNA nằm ngo|i nh}n(nằm trong b|o tƣơng) đóng vai trò nhƣ một chiếc thuyền, chuyên chở vật liệu di truyền từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c để tạo lập ra một hệ thống di truyền ho|n to|n mới cho cơ thể nhận. Plasmid chỉ có ở vi khuẩn v| một v|i sinh vật có cấu trúc đơn giản kh{c. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 47 Ngƣời ta sử dụng chúng nhƣ c{c vector chuyển tải vật chất di truyền rất hữu hiệu. C{c plasmid có c{c đặc tính quan trọng sau: Plasmid có kích thƣớc nhỏ hơn DNA trong nh}n. Plasmid có mã di truyền ho|n to|n giống DNA trong nh}n. Plasmid có khả năng truyền lại một số đặc tính di truyền đặc biệt cho thế hệ sau. b. Enzym cắt giới hạn C{c gen n|y thuộc hai loại exonuclease v| endo nuclease. Chúng có khả năng cắt c{c gen có trong DNA ra bắt đầu từ hai đầu của DNA hoặc có thể tỏng DNA ở những vị trí x{c định. c. Enzym liên kết C{c gen đã ph}n cắt lại với nhau theo đúng trình tự đã đƣợc x{c lập. Ngo|i plasmid ra ngƣời ta còn dùng rất nhiều vector kh{c để chuyển tải c{c gen từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c. 2. Xu hƣớng t{i tổ hợp: Hiện nay có hai xu hƣớng thực hiện t{i tổ hợp: - Xu hƣớng chuyển gen vi sinh vật sang động vật hay thực vật nhằm cải tiến c{c tính trạng hoặc l|m tăng thêm tính trạng m| ta cần cho cơ thể động vật hay cơ thể thực vật. - Xu hƣớng chuyển gen của c{c vi sinh vật kh{c sang cho vi sinh vật v| biến tế b|o vi sinh vật nhƣ những nh| m{y sản xuất c{c chất cần thiết cho con ngƣời. Xu hƣớng n|y hiện nay đang đƣợc nghiên cứu kĩ do c{c nguyên nh}n sau: - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể đơn b|o có chu kì sinh trƣởng rất ngắn, do đó chúng bắt buộc phải có một qu{ trình trao đổi chất rất mạnh. Do đó sẽ dễ d|ng nghiên cứu chúng v| dễ d|ng thu nhận đƣợc một sản lƣợng lƣớn c{c sản phẩm trong một thời gian ngắn. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 48 - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể dễ đồng hóa nhiều loại nguyên liệu kh{c nhau. Do đó nguyên liệu dùng cho qu{ trình sản xuất rẻ tiền v| dễ kiếm. - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể đơn b|o v| l| cơ thể sinh vật duy nhất có khả năng thực hiện c{c qu{ trình sản xuất công nghiệp để sản xuất h|ng loạt v| có kiểm so{t. 3. Thao t{c di truyền: Để thực hiện việc chuyển gen từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c, ngƣời ta thực hiện c{c giai đoạn cơ bản sau: a. T{ch DNA của vật cho Đ}y l| công việc đầu tiên đƣợc quyết định bởi tính trạng đặc biệt của một gen n|o đó trong DNA vật m| ta quan t}m. Trƣớc khi thu nhận gen n|y ta phải t{ch đƣợc DNA. Việc t{ch DNA đƣợc thực hiện trƣớc tiên bằng c{ch ph{ vỡ th|nh tế b|o. Đối với vật cho l| vi sinh vật, ngƣời ta thƣờng dùng lizozym. Sau đó ngƣời ta dùng dosysulfate 1% để loại protein. Sau 2,5 giờ lắc trên m{y lắc, ngƣời ta tiến h|nh ly t}m v| dùng pipet hút lấy phần dịch trên. Sau đó cho thêm ete với liều lƣợng tƣơng đƣơng, lắc mạnh v| li t}m trong 5 phút với tốc độ ly t}m 2000 vòng/phút. Khi đó DNA nằm ở lớp dƣới của ống ly t}m. Bằng c{ch n|y ta t{ch đƣợc DNA khỏi phenol v| protein. Bỏ lớp dịch trên kết tủa DNA bằng cồn. Ta có thể nhận DNA bằng c{ch dùng đầu đũa thủy tinh cuộn sợi DNA ở đầu đũa thủy tinh. Nếu chƣa sử dụng ngay ta có thể bảo quản DNA bằng cồn 70%/V v| để trong tủ lạnh. b. Chọn vector chuyển gen Vector chuyền gen thƣờng phải có những yêu cầu cơ bản sau: Vector pahir có trình tự sao chép để có khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập. Vector phải có trình tự điều hòa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã gen. Vector phải đảm bảo tính bền vững di truyền của DNA t{i tổ hợp ở dạng độc lập hoặc gắn thêm v|o nhiễm sắc thể của tế b|o chủ. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 49 Vector có những gen đ{nh dấu để dễ d|ng ph{t hiện ra chúng hoặc c{c gen lạ gắn v|o. Vector có những gen l|m vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn bị gắn v|o. Vector chứa nhiều bản sao để t{ch đƣợc ra khỏi tế b|o với số lƣợng lớn v| dảm bảo sự khuyếch đại của gen nhƣ chất hoạt hóa. T{c có thể chọn c{c loại vector l| c{c plasmid, phage, cosmid để chuyển tải c{c đoạn DNA của vật cho sang vật nhận. c. Tiến h|nh việc chuyển gen Qu{ trình chuyển gen đƣợc thực hiện bằng nhiều phƣơng ph{p kh{ nhau. Hiện nay việc chuyển gen v|o tế b|o thực vật v| tế b|o động vật thƣờng đƣợc thực hiện bằng 2 c{ch: - Chuyển gen nhờ vector chuyển gen. - Dùng súng bắn gen Đối với những tế b|o kích thƣớc qu{ nhỏ không thể sử dụng phƣơng ph{p bắn gen đƣợc, do đó phƣơng ph{p chuyển gen nhờ vector chuyển gen đƣợc thực hiện nhiều hơn. Để thực hiện điều đó trƣớc tiên ngƣời ta phải dùng enzym cắt giới hạn c{c gen trong DNA của vật cho v| chuyển chúng v|o vector chuyển gen có sự tham gia của ligase v| một số chất l|m tăng c{c qu{ trình n|y. Sau đó nhờ vector chuyển đoạn gen n|y sang cơ thể nhận. Cuối cùng l| kiểm tra tính trạng m| ta quan t}m ở cơ thể nhận có đƣợc biểu hiện không.  Hệ thống thao t{c di truyền đối với lo|i vi khuẩn propionic C{c lo|i trong giống vi khuẩn propionic đƣợc sử dụng một c{ch rộng rãi trong việc sản xuất vitamin B12, c{c hợp chất tetrapyrole, acid propionic cũng nhƣ trong công nghiệp sản xuất phômai v| propiotic. Shuttle vector đƣợc ph{t triển trong lo|i propionic để sử dụng replicon từ plasmid nội b|o trong vi khuẩn propionic v| Escherichia coli v| một tế b|o nhận thích hợp. Sự chuyển nạp hiệu quả ho|n th|nh khi vật chủ trung gian đƣợc chuẩn bị từ lo|i Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 50 vi khuẩn Propionic freudenreichii để vƣợt qua hệ thống high restriction modification trong vi khuẩn propionic. Vector chuyển gen với những chất hoạt hóa tự nhiên đƣợc sử dụng trong lo|i vi khuẩn propionic cũng đƣợc ph{t triển. Sử dụng hệ thống n|y, cholesterol oxidase đƣợc sử dụng nhƣ enzym ph{t hiện, đƣuọc sản xuất nhờ lo|i P.freudenreichii. Gen chứa trong việc sinh tổng hợp acid 5-aminolevulinic(ALA) v| vitamin B12 của vi khuẩn propionic đƣợc ph}n lập. ALA trong vi khuẩn propionic có thể đƣợc tổng hợp bằng cả con đƣờng C4( sự ngƣng tụ của glycin v| succinyl CoA) v| con đƣờng C5( từ glutamat). Gen hem A mã hóa enzym ALA synthase từ lo|i Rhodobacter spheroides, ALA đƣợc tích lũy trong P.freudenreichii. Do đó, hệ thống thao t{c di truyền đối với lo|i vi khuẩn propionic sẽ tạo điều kiện cho việc nghiên cứu di truyền của qu{ trình sinh tổng hợp probiotic v| vitamin B12. Hình 24. Plasmids trong chủng vi khuẩn propionic Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 51 Khoảng 20% vi khuẩn propionic đƣợc tìm thấy mang một hoặc hai plasmid. Hình thù plasmid đƣợc phân biệt dựa trên bản đồ kích thƣớc. Kích thƣớc plasmid nằm trong khoảng 4.4Mdal tới 119Mdal hoặc cao hơn v| đƣợc đặt tên prGO1 tới prGO7, chủng P.freudenreichii chứa thông tín plasmid đơn giản nhất trong khi chủng P.acidipropionici chỉ chứa plasmid 4.4 Mdal. Plasmid 4.4 Mdal, pRGO1 bình thƣờng đƣợc tìm thấy trong trong chủng P.acidipropionici, P.freudenreichii và P.jensenii. Plasmid pLME106(6.9 kb) và pLME108(3.6 kb) đã đƣợc tìm thấy trong P.jensenii và P. freudenreichii. Các plasmid p545 v| p546, đã đƣợc tìm thấy trong chủng P.freudenreichii LMG16545 và P.freudenreichii LMG16546, cs cùng kích thƣớc 3.6 kb và có mối quan hệ mật thiết với nhau. Chuỗi nucleotit của plasmid pRGO1(số đăng kí AB007909), pLME106( số đăng kí AJ250233), pLME108(số đăng kí AJ006662) và p545(số đăng kí AF291751) đã đƣợc x{c định. Đặc biệt, plasmid pLME106 của P.jensenii chứa 100% chuỗi nucleotit đồng nhất với plasmid pRG01 của P.acidipropionici, trong khi phân tích chuỗi orf1 và orf2, mã hóa sự sao chép các protein, RepA và RepB của plasmid pRGO1 có 46%-53% tƣơng đồng với plasmid p545. Protein RepA có tính tƣơng đồng với sự sao chép theta tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn gram dƣơng có h|m lƣợng GC cao, cho thấy plasmid pRGO1, pLME106 và p545 có thể sao chép thông qua sự sao chép kiểu theta. Thêm v|o đó, protein RepB có thể đóng vai trò trong sự sao chép plasmid ban đầu. III. Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: Trong c{c dƣợc chất, vitamin, đặc biệt l| vitamin B12 rất kém bền vững. Với phƣơng ph{p kiểm nghiệm mới l| phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu năng cao, việc ph{t hiện h|m lƣợng không đạt tiêu chuẩn của vitamin B12 trở nên dễ d|ng hơn. Vitamin B12 dễ hút ẩm, nếu tiếp xúc với môi trƣờng ẩm dễ bị phân hủy đƣa đến giảm h|m lƣợng. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 52 Vì vậy trong thực tế, để sản xuất thuốc dạng viên nén, các nhà sản xuất dùng vitamin B12 bao gelatin kết hợp t{ dƣợc hút ẩm polyvinyl pyrrolidon (PVP) trong công thức để ổn định hoạt chất Do thuốc vitamin B1+B6+B12 đƣợc ƣa chuộng sử dụng nhiều nên một nhu cầu đặt ra là cần cải thiện việc sản xuất thuốc loại n|y nhƣ thế n|o để ổn định thuốc, giúp đạt chất lƣợng trong suốt thời hạn sử dụng. Phƣơng ph{p: nghiên cứu cải tiến bào chế vitamin B1+B6+B12 bằng c{ch dùng t{ dƣợc Kollidon CL-M để ổn định thuốc kết hợp với phân tán vitamin B12 ở trạng thái khô thay vì hòa tan trong cồn nhƣ một quy trình sản xuất trƣớc đ}y đã l|m. Khí hậu nƣớc ta thuộc nhiệt đới ẩm, nên việc bảo quản thuốc tƣơng đối khó khăn.Ở thành phố Hồ Chí Minh nhiệt độ trung bình hằng năm l| 270C, độ ẩm trung bình l| 79.5%, l| điều kiện bất lợi cho việc bảo quản thuốc. Kollidon CL-M là sản phẩm thƣơng mại của PVP. Đ}y l| loại crospovidone không hòa tan, dạng hạt mịn, có tác dụng ổn định thuốc Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 53 IV. Sản phẩm Tempeh 1. Quy trình sản xuất Tempeh Phơi khô đậu nành Bóc vỏ bằng thiết bị nghiền đá mài Lắng tách vỏ Ngâm lần 1 qua đêm ở nhiệt độ phòng Nấu trong 60 phút với nước ngâm Ngâm lần 2 qua đêm ở nhiệt độ phòng Phân loại theo kích cỡ Tháo nước và làm lạnh Cấy hỗn hợp bột “ragi tempeh” và 1 ít sắn hột Đóng trong túi plastic (khoảng 200g) và bịt kín Tempeh Đặt trong lưới plastic Phun hơi hay nấu trong 30 phút Ủ trong giá tre trong khoảng 36 – 40 giờ Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 54 Sản xuất vitamin B12 trong quá trình lên men sản phẩm Tempeh Tempeh l| sản phẩm lên men truyền thống từ đậu n|nh của Indonesia. Sau khi ng}m, đậu đƣợc nấu hơn một lần. Sau giai đoạn lên men với chất nền dạng rắn, chúng đƣợc cấy chuyền với chủng mốc Rhizopus spp. Theo kiểu truyền thống thì đậu đƣợc ng}m qua đêm, sau đó đƣợc acid hóa tức thời. Trong phƣơng ph{p công nghiệp dùng acid lactic. Tempeh quan trọng hơn vì chứa h|m lƣợng cao acid amin, acid béo v| vitamin. Vitamin quan trọng nhất l| B12, thƣờng không tìm thấy trong c{c thực phẩm thực vật. Trong c{c vi sinh vật sản xuất ra vit B12 thì giống Citrobacter freundii cho lƣợng vitamin B12 nhiều hơn cả. Giống Klebsiella pneumoniae cũng cho lƣợng lớn vit B12. C{c giống trong họ Enterobacteriaceae đƣợc biết có thể sinh ra độc tố enterotoxin. Khuynh hƣớng ng|y nay l| nghiên cứu ảnh hƣởng của c{c biến số lên men v| cấu trúc của vit B12. 2. Nguyên liệu v| phƣơng ph{p Vi sinh vật: nấm mốc Rhizopus oligosporus đƣợc ph}n lập từ Tempeh, cung cấp lƣợng lớn c{c vitamin hòa tan trong nƣớc đƣợc sử dụng để lên men Tempeh. C.freubdii và K.pneumoniae đƣợc thêm v|o trong giai đoạn đầu lên men vì chúng tạo ra nhiều vitamin B12 suốt qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn. Quá trình lên men Tempeh: phƣơng ph{p hiện đại đƣợc tiến h|nh theo tiêu chuẩn: đậu n|nh (300g) đƣợc cấy v|o 1.8ml giống R. ologosporus (106 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×103 tế b|o/g đậu), đối với giống C.freubdii và K.pneumoniae (107 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×104 tế b|o/g đậu), nhiệt độ 320C trong 34 giờ. Phƣơng ph{p truyền thống đƣợc tiến h|nh (với C.freubdii) nhƣ sau: đậu đƣợc rửa sạch v| nấu với nƣớc đã khử kho{ng (3 lần) trong 30 phút. Trong giai đoạn l|m nguội, nƣớc ng}m ấy đƣợc cấy v|o C.freundii (3×107tế b|o/ml). Nhiệt độ khoảng 300C trong 15 giờ. Sau khi ph}n riêng nƣớc v| đậu, Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 55 đậu đƣợc t{ch bỏ vỏ, nấu lại sau 30 phút, sấy khô bề mặt v| chia th|nh 2 phần. 1 phần đƣợc tiệt trùng (trong autoclave) trƣớc khi thực hiện qu{ trình SSF với Rhizopus sp , v| phần còn lại không phải tiệt trùng. Một phần của đậu ng}m nh}n tạo v| 2 phần của phƣơng ph{p truyền thống đƣợc chia l|m 3 phần . 1 phần cấy Rhizopus sp và C.freundii, phần thứ 2 chỉ cấy có Rhizopus sp và phần 3 cấy hoặc Rhizopus sp hoặc C.freundii (kiểm chứng). Sự biến đổi các thông số quá trình lên men: Nhiệt độ cấy khi lên men có thể l| 24, 28 v| 320C. Ảnh hƣởng của số lƣợng kh{c nhau của tế b|o vi khuẩn lên vit B12 đƣợc nghiên cứu từ 103 đến 108 bế b|o trên ml3 (tƣơng đƣơng 7-7×105 tế b|o/g đậu). Phân tích vit B12: mẫu thử nghiệm ph}n tích sự kh{c biệt giữa loại B12 (cobalamin) có thể sử dụng cho ngƣời v| loại không thể. Tất cả mẫu ph}n tích vit B12 đƣợc tiến h|nh 3 lần tại 2 nồng độ kh{c nhau. Độ lệch phải dƣới 7.5% 3. C{c yếu tố ảnh hƣởng Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men: với cả 2 lo|i Rhizopus sp và C.freundii, nhiệt độ lên men tại 320C cho lƣợng vitamin B12 nhiều nhất. Nếu giảm nhiệt độ từ 320C xuống 280C hoặc 240C thì cũng giảm lƣợng vit B12. Một ảnh hƣởng nữa của nhiệt độ thấp l| kéo d|i thời gian lên men cho Rhizopus sp từ 34 giờ (320C) lên 50 giờ (280C) v| 67 giờ (240C). Giống C.freundii cho nhiều hơn vit B12 so với giống K.pneumoniae tại bất kỳ nhiệt độ n|o. Nhiệt độ (0C) Cyanocobalamin (ng g/ khối lƣợng khô) C.freundii K.pneumoniae 24 114 74 28 130 95 32 152 135 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 56 Ảnh hưởng của cobalt và 5,6-dimethylbenzimidazole: sự thêm v|o cobalt l|m tăng vit B12. Lên men với K.pneumoniae đƣợc bổ sung lƣợng nhỏ cobalt (II)-sulfate-heptahydrate l|m tăng nhanh vit B12 từ 73 lên 170 ng g/khối lƣợng khô. Sự tăng vit B12 khi thêm cobalt của C.freundii thì theo đƣờng thẳng v| đạt đến tối đa tại 290 ng g/khối lƣợng khô. Tuy nhiên sự dự đo{n thì không hiệu quả khi hiệu suất thấp v| đạt tối đa chỉ 0.014 Sự thêm v|o 5,6-dimethylbenzimidazole cũng l|m tăng vit B12 đặc biệt tại h|m lƣợng thấp (0-100mg/l). Tr{i lại lên men với K.pneumoniae, ta dùng C.freundii sẽ cho kết quả tốt hơn với h|m lƣợng lên đến 300 mg/l. Hiệu suất của sự hợp nhất 5,6-dimethylbenzimidazole vào vit B12 cũng rất thấp v| chỉ đạt gi{ trị cao nhất khoảng 0.013. Số lƣợng tế b|o không bị ảnh hƣởng bởi việc thêm v|o 2 chất n|y v| có thể so s{nh đƣợc trong tất cả qu{ trình lên men. Ảnh hưởng của số lượng tế bào cấy vào (trường hợp C.freundii): Mặc dù số lƣợng tế b|o ban đầu khoảng 105 đến 106 (g/khối lƣợng ƣớt), sau 27 giờ số tế b|o đã đạt mức 109 đến 1010 (g/khối lƣợng ƣớt). Sự tăng tốc độ ph{t triển khi tăng lƣợng nhỏ vi sinh vật cấy v|o. Sau 27 giờ, lƣợng B12 thu đƣợc trong c{c trƣờng hợp đạt gần một gi{ trị 150-160 ng g/khối lƣợng khô, phù hợp với sự gia tăng của số lƣợng tế b|o. Ảnh hưởng của các xử lý sơ bộ trong quá trình lên men với chất nền dạng rắn lên lượng B12: Những công nghệ kh{c nhau đƣợc so s{nh hiệu quả tạo B12 trong suốt qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn. Lên men đƣợc tiến h|nh ng}m đậu trong lactate, v| cấy v|o giống C.freundii, Rhizopus sp cho kết quả tốt nhất. Tempeh chuẩn bị bằng phƣơng ph{p ng}m truyền thống (ng}m đậu v| cấy vào C.freundii) hoặc có thể cấy thêm Rhizopus sp trƣớc khi thực hiện qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn cho lƣợng vitamin B12 thấp nhất. Cũng có sự kh{c biệt giữa tempeh có qua tiệt trùng trong autoclave v| không qua tiệt trùng. Mẫu thí nghiệm đậu qua tiệt trùng, chỉ có C.freundii đƣợc ph{t hiện sau khi SSF. Mẫu thí nghiệm không qua tiệt trùng đƣợc cấy C.freundii, thì sau khi ph}n lập Bacillus cereus cũng đƣợc ph{t hiện. Tempeh ng}m với phƣơng ph{p truyền thống kết hợp không tiệt trùng (cấy v|o Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 57 C.freundii, Rhizopus sp) cho ra nhiều vit B12 hơn tempeh l|m theo phƣơng ph{p truyền thống kết hợp không tiệt trùng (chỉ cấy có Rhizopus sp). Bảng : Hàm lƣợng B12 v| số tế b|o trong qu{ trình lên men l|m Phƣơng ph{p lên men H|m lƣợng vitamin B12 (ng g/ khối lƣợng khô) Số khuẩn lạc từ C.freundii (×109) R.oligosporus + C.freundii Ngâm trong lactate Tiệt trùng Không tiệt trùng 53.9 48.8 33.0 50.0 35.0 50.0 R. oligosporus Ngâm trong lactate Tiệt trùng Không tiệt trùng ND ND 23.2 ND ND 5.0 Mẫu ‚sạch‛ đối chứng Ngâm trong lactate Tiệt trùng Không tiệt trùng ND ND 3.5 ND ND 0.1 Chú thích:  Độ lệch ≤ 7.5%  Đối với không tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii và nấu nhƣng không tiệt trùng sau khi ngâm  Đối với không tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii , nấu và tiệt trùng.  Đối với ng}m trong lactate, đậu đƣợc ngâm với lactate và tiệt trùng sau khi ngâm và nấu. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 58  ND (not detectable): không phát hiện đƣợc. Mẫu đối chứng (không cấy bất cứ lo|i n|o trƣớc khi lên men với chất nền dạng rắn) ngâm bằng phƣơng ph{p truyền thống (với C.freundii), và không tiệt trùng nhƣng cũng thu đƣợc vit B12. Phân lập thu phát hiện đƣợc cả C.freundii, B.cereus và Micrococcus luteus. Lên men tiến h|nh theo phƣơng ph{p ngâm truyền thống và ngâm với lactate, cả 2 đƣợc tiệt trùng sau khi ngâm cho kết quả không có vitamin B12 (chỉ cấy Rhizopus sp). 4. Thảo luận Lƣợng vitamin B12 sản xuất bằng C.freundii hoặc K.pneumoniae tăng lên khi ta tăng nhiệt độ lên men tr{i ngƣợc lại với acid amin tự do, acid γ- linolenic trong tempeh chỉ tăng khi nhiệt độ lên men thấp (24-320C). Sản xuất vit B12 luôn đi kèm với sự ph{t triển vi khuẩn. Sự gia tăng vit B12 rất ít khi thêm v|o cobalt cho thấy cobalt chứa trong đậu gần đạt điểm cực đại của h|m lƣợng vit B12 bởi C.freundii hoặc K.pneumoniae. Mặc dù sự thêm v|o cobalt v| 5,6-dimethylbenzimidazole làm tăng vit B12 đối với cả 2 giống vi sinh vật, nhƣng sự hợp nhất của chúng l| kém và cho hiệu suất thấp. Bổ sung những tiền chất n|y l| không cần thiết, vì lƣợng vit B12 tạo ra do 2 giống vi sinh vật trên đã đủ nhiều cho nhu cầu hằng ng|y của con ngƣời. Sự cấy v|o số tế b|o kh{c nhau của C.freundii chỉ rằng sản phẩm vitamin B12 liên quan đến sự ph{t triển của vi sinh vật. Điều n|y cũng đƣợc x{c nhận cho Propionibacterium freudenreichii. Hiệu suất thấp của phƣơng ph{p ng}m truyền thống, không tiệt trùng cấy v|o C.freundii trước khi lên men với chất nền dạng rắn đƣợc giải thích l| do sự tồn tại của hỗn hợp c{c vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy trong mẫu tempeh. Môi trƣờng m| có nhiều lo|i vi sinh ngo|i C.freundii thì cho hiệu suất thấp hơn hẳn đối với môi trƣờng thuần khiết chỉ chứa C.freundii. Sự xuất hiện của C.freundii và B.cereus trong tempeh làm theo phƣơng ph{p ng}m truyền thống, không tiệt trùng l| hiển nhiên v| nó mô Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 59 phỏng theo phƣơng ph{p của Indonesia. Kết quả đã nói lên rằng vi khuẩn hiện diện trong suốt qu{ trình ng}m v| đƣợc chuyển sang qu{ trình lên men. Rhizopus spp có tác động tích cực lên sự ph{t triển vi khuẩn. Lý do l| khả năng hydro hóa của nấm mốc lên c{c chất nhƣ l| acid amin (cần cho vi khuẩn ph{t triển). Hơn nữa chất kìm hãm protease nhƣ l| Bowman-Birk đƣợc tìm thấy trong đậu v| có thể kìm hãm protease của vi khuẩn. Tr{i lại protease của nấm (loại aspartate) không nhạy với chất kìm hãm, do đó có thể ph}n giải acid amin cho dù có sự hiện diện của c{c chất kìm hãm protease. Kết luận trong sự so s{nh của c{c qu{ trình xử lý sơ bộ trƣớc khi thƣc hiện SSF chỉ ra rằng phƣơng ph{p ng}m đậu trong lactate kết hợp cấy C.freundii cho hiệu suất tốt nhất. Họ Enterobacteriaceae chứa nhiều mầm bệnh, nhƣ l| Salmonella typhi, Shigella dysenteriae,K.pneumoniae và Yersinia pestis. Thêm v|o đó E.coli, C.freundii g}y ra bệnh tiêu chảy. Mặc dù tempeh chƣa nhiều th|nh viên của họ Enterobacteriaceae, nhƣng không có kiểm tra n|o cho thấy c{c vi sinh vật g}y bệnh tiêu chảy n|o còn lại sau khi ăn tempeh. Tuy nhiên do 2 giống K.pneumoniae, C.freundii cần thiết cho lên men nên phải đƣợc kiểm tra khả năng sinh độc tố enterotoxin, nếu vƣợt qu{ mức sẽ không đƣợc sử dụng. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 60 PHẦN VI: PHỤ LỤC Các sản phẩm vitamin B12 hiện có trên thị trƣờng I. Folic acid & vitamin B12 injection Th|nh phần:  Folic acid 15mg/mL  Cyanocobalamin: 500µg/mL II. Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm Công thức: Cyanocobalamin ................................................. 1000 mg Kali dihydrophosphat ……………………………....5 mg Natriclorid................................................................2,5mg Nƣớc cất pha tiêm................................................ ..vđ 1ml. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 61 III. Viên nén vitamin B12 Th|nh phần:  Vitamin B12 5000 mcg (83,33%)  Các thành phần khác: magnesium sterate, stearic acid, và microcrystalline cellulose  Không có nấm men, đƣờng, màu nhân tạo, chất tạo vị, chất bảo quản. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 62 PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]: Nguyễn Đức Lƣợng, ‚Công nghệ vi sinh tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp”, Nhà xuất bản ĐHQG TP.HCM, 2002. [2]: Lê Bạch Tuyết, ‚Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm”, NXB GD, 1996. [3] Nguyễn Tiến Thắng. ‚Giáo trình sinh hóa hiện đại”, NXB GD, 1998. *4+: Ronald R. Eitenmiller and W.O.Landen, Jr, ‚Vitamin analysis for the health and the food sciences”, CRC Press LLC, 1999. [5]: “ Vitamins In Foods Analysis, Bioavailability, and Stability”, Taylor & Francis Group, LLC, 2006. [6]: www.freepatentsonline.com [7]: www.journal@chive.com [8]: www.spingerlink.com [9]: www.sinhhocvietnam.com