Tiểu luận Tìm hiểu hệ vi sinh vật có lợi trong sản xuất các sản phẩm từ rau quả

men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6-7 độ cồn, nhưng tạo ra một loạt các axit bay hơi cũng như các este của chúng làm cho dịch có mùi tạp và nó còn kim hãm các loại nấm men chính trong lên men, K.apiculata nhạy cảm với SO2. Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loài men này phát triển, nếu có thì chỉ cần có trong giai đoạn đầu tạo được 3-4˚ cồn. 6) Yêu cầu đối với chọn nấm men thuần chủng : Nấm men rượu vang thuần khiết được Hansen lần đầu tiên (1883) tách được từ quả nho va được mang tên là Saccharomyces ellipsoideus. Ông phân lập ra từng khuẩn lạc với tế bào riêng biệt trên môi trường đặc và được cấy chuyền với sự kiểm tra bằng kính hiển vi. Từ đấy việc nghiên cứu giống men thuần chủng được chú ý nhưng cũng có nhiều ý kiến khác nhau vế sử dụng chúng cho sản xuất rượu vang. Sau khi có hãng rượu sản xuất được các loại vang ngon từ giống thuần chủng vấn đề này mới thực sự được quan tâm và phát triển trong nghiên cứu cũng như áp dụng trong công nghiệp. Các nòi nấm men thuần khiết dùng nhiều trong sản xuất thuộc giống S. vini và S. oviformis. Các chủng nấm men thuần khiết này, có sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng, khoảng nhiệt độ thích hợp để lên men, khả năng tạo cồn va chịu cồn, khả năng chịu được pH thấp cũng như khả năng kết lắng ( tạo thành dạng bông hoặc dạng bụi) như đã đề cập tới ở trên. Những yêu cầu đối với nấm men rượu vang là: có lực lên men cao đối với nước quả, sử dụng đường cho lên men gần hoàn toàn, kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh, chịu được độ rượu cao và độ axit của môi trường, cũng như các chất sát trùng, tạo cho rượu hương vị thơm ngon thanh khiết. IV. Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong lên men rượu vang tự nhiên : 1)Oxy : Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong môi trường đủ lượng oxy nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối. Trường hợp thiếu oxy (kị khí) nấm men sử dụng phần oxy hoà tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên men. Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối. Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí. 2)Nhiệt độ : Nhiệt dộ lên men có ảnh đến đời sống của nấm, men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm. Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang đã xác định được khoảng nhiệt, độ lên men rượu vang trắng thích hợp là 15-30˚C. Còn lên men vang đỏ (nước quả lẫn với xác quả) phải chiết xuất các chất thơm và polyphenol từ vỏ quả nên cần thang độ cao hơn, thường là 25˚C. 3) Hàm lượng đường Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccarozo. Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường có hàm lượng đường dưới 20%. Có 1 số chủng loại hoạt động ở môi trường có đường cao hơn. Khi nhân giống dùng môi trường có đường thấp dưới 10%. 4) pH của môi trường : Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon. Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2,8-3,8. Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được. Vùng pH tối thích của nấm men là 4-6. Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ pH bằng 3,0-3,5 , mà không cho lên men ở vùng pH 4-6 vi khoảng pH này cũng là điều kiện thích hợp cho các loài vi sinh vật có hại phát triển . 5)Nguồn nitơ : Đa số trong nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men. Song cũng có trường hợp vì hạn hán hoặc tùy từng loại quả không đủ nguồn nitơ cho nấm men sinh trưởng. Do đó cần phải bổ sung thêm nguồn nitơ. Trong trường hợp này người ta thường dùng amon sulfat (NH4)2SO4. Cũng có thể dùng dịch men tự phân cho thêm vào môi trường. Nếu dịch quả quá chua dùng tactrat amon – kali hay amon hydroxyt trung hòa bớt acid. Ngoài nguồn nitơ cũng cần chú ý đến nhu cầu sinh trưởng của nấm men. Nếu thấy men phát triển kém có thể thêm vào 1lit nước quả 0,2ml hỗn hợp có thành phần như sau amon sulfat – 100g/l, vitamin B1 (thiamin) – 0,25g/l, canxi pantotenat – 0,25g/l, vitamin H (biotin) – 0,002g/l. Cũng có thể dùng cao nấm men thay cho hỗn hợp này. Đối với dịch nhân giống hoặc hoạt hóa giống thì hỗn hợp có các nguồn nitơ và các chất sinh trưởng này rất có ý nghĩa. Trong nước quả thường có đủ các chất khoáng đối với nhu cầu của nấm men. Vì vậy không cần phải bổ sung thêm chất khoáng. Song trong nghiên cứu cũng như nhân giống có thể thêm nguồn photpho kali ở dạng muối photphat magiê ở dạng muối sunfat. Ngoài ra để chống oxy hóa nước quả, người ta có thể thêm hóa chất vào nước quả sau khi ép và trước khi lên men. Chất dùng rộng rãi là SO2 (anhydrit sunfurơ). V.Các quy trình sản xuất rượu vang: Quy trình sản xuất rượu vang có thể mô tả một cách đơn giản nhất như sau: Rượu vang được làm từ các loại nho nguyên chất và được lên men một cách tự nhiên. Vì nho vốn có hai đặc tính tự nhiên là đường và men nên nước nho được ép ra, trải qua một quy trình chế biến sẽ trở thành rượu vang. Rượu vang là một sản phẩm của quy trình tinh xảo mà khởi đầu bằng việc quyết định thởi điểm thích hợp nhất để gặt hái nho. Tất cả các quy trình để làm rượu vang cơ bản đều giống nhau từ lúc gặt hái cho đến khi đóng chai. Để có một kiến thức cơ bản về quy trình làm rượu vang, chúng ta hãy tìm hiểu từng bước trong từng giai đoạn làm rượu vang. 1.Thời điểm gặt hái nho: Khi nho chín thì độ axit sẽ giảm xuống và lượng đường sẽ tăng lên. Thời điểm thích hợp để gặt hái nho là vào tháng 8 đối với vang nổ (Sparkling Wines) vào tháng 10 đối với rượu đỏ. Các nghệ nhân sẽ quyết định thời điểm gặt hái nho, nhằm đạt lượng axit và lượng đường như mong muốn để chế biến theo khẩu vị riêng của mình. Thời điểm các trang trại gặt hái nho cũng được thể hiện rõ trên nhãn của các loại rượu vang. Để làm rượu vang nổ thì nho sẽ được hái khi độ axit đạt khoảng 1% và 19o Brix (Brix là đơn vị đo lượng đường còn lại trên nho, nhân đơn vị Brix với 0,55 thì chúng ta sẽ được nồng độ cồn). Để làm rượu vang đỏ, nho sẽ đựơc hái khi đạt gần được khoảng 0,8% độ axit và 220Brix. Phần lớn các loại nho dùng để làm rượu vang trắng và đỏ khi được gặt hái thì sẽ đạt khoảng 0,65% độ axit và 23o Brix. Điều kiện trên là tiêu chuẩn cơ bản để quyết định thời điểm thích hợp nhất khi gặt hái nho. Phần lớn các nghệ nhân làm rượu vang quyết định thời điểm gặt hái nho bằng thông qua việc đánh giá mầu sắc nho và nếm quả nho. 2.Giai đoạn chuẩn bị dịch lên men: Bước đầu tiên là lấy nước từ những quả nho. Quy trình này được thực hiện qua hệ thống vắt và tước cuống. Hệ thống này sẽ tước các cuống từ những chùm nho và vắt nước ra khỏi vỏ nho. Nước này được gọi là dung dịch để lên men . Để làm ra vang trắng thì dung dịch này sẽ được đưa qua hệ thống ép và sau đó được đưa vào bồn lên men. Để làm ra rượu đỏ thì dung dịch này sẽ được đưa trực tiếp đến bồn lên men rồi sau đó đưa qua hệ thống ép. Bước tiếp theo để tiêu diệt vi sinh vật có hại và đảm bảo rượu được tinh khiết, người ta thường dùng SO2 để xông. Lượng SO2 trong dịch lên men không được quá nhiều vì sẽ gây ức chế sự phát triển và hoạt động chuyển hóa đường thành rượu của nấm men, lượng SO2 được đưa vào dịch trái cây khoảng 30-120g/l. | Đối với các loại trái cây khác: Ngoài nho, rượu vang cũng được làm từ các loại trái cây khác: dứa, mơ,…Các loại trái khác nho thì có lượng đường không cao và hàm lượng axit rất cao. Đối với các loại quả không phải là nho, người ta cần phải điều chỉnh lượng đường sao cho tổng lượng đường trong dung dịch phải đạt 16-17% là tốt nhất. Người ta có hai cách để thu nhận dịch trái cây dùng cho quá trinh lên men. -Cách thứ nhất: dùng máy ép ép trái cây, thu lấy dịch trái cây. -Cách thứ hai: người ta dùng dường để trích ly các thành phần có trong trái cây ra ngoài. Trong trường hợp này, dịch trích ly sẽ chứa rất nhiều đường, người ta dùng nước để pha loãng dịch đường đến mức độ đường cần thiết. 3.Quá trình lên men rượu vang: - Yêu cầu lên men nhanh, lên men hết đường: khi cho lên men phải tạo điều kiện để cho men Saccharomyces hoạt động mạnh, nhanh, lên men hết đường. Trong quá trình lên men, con men hoạt động mạnh thì tiết ra một lượng lớn CO2 tạo thành đệm chắn không cho khuẩn, nhất là khuẩn giấm xâm nhập và làm hỏng quả, mặt khác men khỏe, men nhiều thì tiết ra những chất kháng sinh, ức chế các loại khuẩn khác nhất là khuẩn Lactic có sẵn trong nước quả. Bản thân việc lên men tạo cồn ethylic cũng tạo điều kiện thuận lợi để quá trình lên men diễn biến bình thường. Nếu vì một nguyên nhân nào đó, men Saccharomyces ngừng hoạt động nửa chừng, còn lại đường khử, rất dễ bị khuẩn và các men dại phá hủy làm hỏng rượu. Vì vậy một trong những nguyên tắc kỹ thuật chế rượu vang quan trọng nhất là tạo điều kiện cho men Saccharomyces sinh sản nhanh, chuyển toàn bộ đường thành rượu trong thời gian ngắn nhất; sau khi đường đã chuyển hóa hết, lượng cồn etylic sản sinh đã cao thì khuẩn khó hoạt động. - Theo dõi quá trình lên men qua một số chỉ tiêu sau: + Hàm lượng đường: khi lên men phải tạo điều kiện để nấm men hoạt động mạnh, cho lên men nhanh, tiêu thụ hết đường. Vì vậy cần theo dõi hàm lượng đường thay đổi trong quá trình lên men. Nếu vì một lí do nào đó nấm men ngưng hoạt động, trong môi trường còn nhiều đường khử các vi sinh vật khác (không phải nấm men) phát triển dễ dàng, đưa đến thành phần rượu không còn như bình thường. + Nhiệt độ: nếu thực hiện lên men trong những thiết bị có dung tích lớn, người sản xuất phải đo nhiệt độ nhiều lần trong ngày, vì trong quá trình lên men nhất là ở giai đoạn đầu, quá trình lên men mạnh, sủi bọt nhiều, năng lượng tỏa ra nhiều, lúc ấy nhiệt độ cũng tăng lên nhiều. Quá trình lên men thích hợp với khoảng to = 20 - 30oC. Qua thực nghiệm và sản xuất, người ta thấy rằng: tốt nhất là từ đầu đến cuối quá trình cho lên men ở cùng một nhiệt độ. Độ nhiệt ổn định tuy ở mức khá cao to = 30oC, nhưng giữ ổn định liên tục vẫn tốt hơn là lúc đầu to = 20oC sau tăng lên 30oC. + Hàm lượng O2: mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước quả tiếp xúc với O2 không khí bằng cách sục khí. Giai đoạn sau cho lên men yếm khí. Trong lên men ở quy mô sản xuất nhỏ người ta cho lên men ở bình có miệng to và nút bình bằng nút bông. Khi lên men ở quy mô lớn, người ta sử dụng các nồi lên men hay các bể, khi đổ môi trường lên men vào phải để trống một thể tích thích hợp khoảng 1/3 - 1/5 thể tích nồi hay bể lên men. -Các giai đoạn lên men rượu vang: + Giai đoạn hình thành rượu: là giai đoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Nếu giữ được nhiệt ổn định, thời gian lên men này kéo dài từ 4 - 5 ngày. Kết quả của giai đoạn này ta được “rượu non”. Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu (đường, đạm, vitamin) mạnh, biến đường thành rượu, giải phóng CO2. Kết thúc giai đoạn này thành phần nước quả thay đổi rất lớn. + Giai đoạn phát triển: khi kết thúc lên men ở giai đoạn một, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng biện pháp lọc (đối với vang đỏ - vang thu được do lên men dịch quả có kèm xác quả). Trong các cơ sở lên men ở quy mô lớn người ta dùng hệ thống ống hút xiphong để hút dịch lên men sang nồi hay bể lên men khác. Đây là gạn thứ nhất. Khi được “rượu non”, ta tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai đoạn này quá trình lên men xảy ra không ồ ạt, người ta còn gọi là lên men phụ, phân hủy những gam đường cuối cùng có trong dịch lên men. Đồng thời ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic. Kết quả của quá trình này, acid malic chuyển thành axit lactic, làm cho rượu chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu (của acid lactic), CO2 còn được tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng ít dần. Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác men lắng xuống đáy bình hay bể. Tiếp theo thực hiện gạn cặn lần hai (sau lần một khoảng từ 20 – 30 ngày), lần ba (sau lần hai hơn 30 ngày). Nếu rượu còn đục ta gạn tiếp… để có dung dịch trong suốt. Sau lần gạn cuối rượu cơ bản ổn định về thành phần. Ở giai đoạn nay nếu nếm thử ta thấy rượu chưa thể uống được, vì có vị cay, hơi chua, đắng. Ta gọi là “rượu sống”. Lưu ý: sau mỗi lần gạn cặn, các dụng cụ đựng dung dịch lên men như chai, bình (lên men ở quy mô nhỏ), nồi lên men (ở quy mô công nghiệp) được đổ dịch lên men đầy hơn, tạo điều kiện lên men yếm khí nghiêm ngặt hơn. Đến lần cuối cùng đậy kín hoàn toàn, tạo sự cách ly nghiêm ngặt với O2. + Giai đoạn vang chín: sau giai đoạn hai, “rượu non” đã ổn định thành phần nhưng rượu vẫn còn “sống”, người ta phải áp dụng một số biện pháp kĩ thuật để làm tăng chất lượng của rượu, để rượu được “chín”. Những biện pháp này rất đơn giản nhưng lại quyết định chất lượng của rượu thành phẩm. Cụ thể cách tiến hành: Nút chai, bình đựng “rượu non” thật chặt. Hạ thổ ở độ sâu 50 - 60cm ở vùng đất cao, mát, không bị ngập nước. Vị trí tốt nhất là dưới hầm ở trong nhà nơi nhiệt độ ít dao động. Nếu không có điều kiện chôn sâu thì có thể để ở trong thùng đổ cát vùi kín. Hạ thổ với thời gian từ 4 - 5 tháng, rượu có thể uống được tuy chất lượng chưa hoàn hảo. Nếu qua hai năm trở lên rượu có chất lượng hoàn hảo gọi là “rượu chín”. Trong thời gian chuyển từ rượu vang “sống” sang rượu vang “chín” đã xảy ra rất nhiều biến đổi sinh hóa phức tạp để chuyển từ rượu ít ngọt, ít thơm có vị chua lấn át, có vị đắng của CO2 và aldehyde sang rượu chín trong vắt, có màu đỏ (hoặc vàng), có vị ngọt cân đối của cồn - đường, vị đắng nhẹ của glycerin, vị chát của polyphenol. Khi có đầy đủ những tính chất như vậy ta được rượu thành phẩm. CHƯƠNG II: LÊN MEN LACTIC TRONG MUỐI DƯA, MUỐI CÀ. I.Giới thiệu chung về muối dưa, muối cà: Rau quả đóng một vai trò quan trọng trong bữa ăn của con người. Trong rau quả có chất dinh dưỡng quý, như hydrat cacbon, các axit hữu cơ, vitamin, các chất khoáng, tanin, pectin v.v… Khó có thể giữ được các loại rau bắp cải, su hào, rau cải, dưa chuột, cà chua trong thời gian dài để cung cấp cho người tiêu dùng ở các thành phố hoặc khu công nghiệp trong lúc giáp vụ hoặc vì thời tiết khan hiếm rau tươi. Ngoài các hóa chất để bảo quản rau quả người ta còn muối chua rau quả để kéo dài thời gian cất giữ cũng cho kết quả khả quan và có ý nghĩa lớn trong việc cất giữ rau quả và giải quyết cho việc phục vụ bữa ăn của nhân dân. Muối chua rau, quả là một quá trình lên men lactic mà nguyên liệu là rau, quả, đường, muối và gia vị.Quá trình lên men này hoàn toàn là quá trình lên tự nhiên, gây ra bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Muối chua rau dưa có từ xưa. Song, ở nước ta việc tìm hiểu các quá trình hóa sinh – vi sinh ở đây chưa được chú trọng và tới nay công việc này vẫn ở tình trạng thủ công dựa vào kinh nghiệm dân gian. Trong rau dưa thường có sẵn vi khuẩn Lactic và những tạp khuẩn gây hỏng quá trình muối chua (vi khuẩn axetic, butyric, vi khuẩn hoại sinh và nấm mốc). Vì vậy, trong việc này cần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Lactic phát triển và đến khi đã tích tụ được axit lactic trong nước dưa sẽ ức chế các vi khuẩn khác. Công việc đầu tiên là phải chọn rau, rửa sạch, làm vệ sinh dụng cụ và đồng thời cũng lựa chọn nước, muối ăn. II. Lên men lactic là gì? 1) khái niệm chung : Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kỵ khí chứa các hợp chất đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật (chủ yếu) và một số sản phẩm khác nữa. Con người từ lâu đã sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo quản và chế biến các loại thức ăn. Năm 1780, nhà bác học Thủy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857, L. Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn Lactic. Năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn Lactic và đặt tên là Bacterium lactic, gọi là Streptococcus lactic. 2.Tác nhân lên men lactic: Nhóm vi khuẩn Lactic đã được xác định bởi ORLA-JENSEN (1919), bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit thành axit lactic. Lên men lactic có hai dạng:lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm là axit lactic. Quá trình lên men phụ thuộc vào giống vi khuẩn sử dụng. Trong quá trình lên men đồng hình, sự chuyển hóa đường glucose thành axit lactic xảy ra theo chu trình Embden – Meyerhof để tạo thành axit pyruvic, sau đó dưới tác dụng của lactadehydrogenase axit lactic hình thành. Quá trình này có ý nghĩa lớn trong công nghiệp thực phẩm. Lên men lactic dị hình là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như, atanol, CO2…Thông thường, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit succinic chiếm gần 20%, rượu etylic khoảng 10%, axit acetic 10% và các chất khác khoảng 20%. Tùy theo cơ chế lên men bắt buộc hay chủ yếu, mà người ta xác định là lên vi khuẩn lên men đồng hình (homofermentaires) hay vi khuẩn lên men dị hình (heterfermentaires). Một số vi khuẩn lên men đồng hình cũng có khả năng lên men dị hình trong những thời gian sinh trưởng không thuận lợi hoặc tùy thuộc vào nguồn đường sử dụng. 3. Vi khuẩn Lactic: a) Cấu tạo vi khuẩn Lactic: Vi khuẩn Lactic là những vi khuẩn Gram dương (G+): có thành phần cấu tạo cơ bản là peptidoglycan (PG), còn gọi là glucopeptit, murein,… chiếm 95% trọng lượng khô của thành tế bào, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm ba thành phần: N. acetylglucozamin, N. acetylmuramic và galactozamin. Các vi khuẩn G+ có thành tế bào (cell wall) dày hơn, khoảng từ 14 – 18nm, so với thành tế bào của vi khuẩn G- (khoảng 10nm). (1nm = 10-3µm = 10-6mm), trọng lượng có thể chiếm 10 – 20% trọng lượng khô của vi khuẩn. Vách tế bào vi khuẩn có cấu tạo gồm hai chất dị cao phân tử là glucopeptit và nhóm polysaccarit. Nhóm polysaccarit đặc biệt của vách tế bào vi khuẩn G+ là axit techoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào. So sánh thành phần vách tế bào vi khuẩn Gram(+) và Gram (-): Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn G+ G- Peptidoglycan Axit teicoic Lipid Protein 30-95 Cao Hầu như không Không hoặc ít 5-20 0 20 Cao Hình 1: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Lactic(Vi khuẩn Gram +) Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, viết tắt là CM ) dày 7 – 8nm, có cấu tạo gồm 3 lớp: +Hai lớp phân tử protein (chiếm hơn 50% trọng lượng khô của màng và 10 – 20% protein tế bào), gồm có hai dạng: protein cấu trúc và enzyme. +Một lớp kép photpholipid (20 – 30% trọng lượng khô của màng), nằm ở giữa: một lớp có gốc photphat quay vào trong, một lớp có gốc photphat quay ra ngoài (mô hình khảm lỏng) làm màng hóa lỏng và cho phép các protein di động tự do. Khoảng 70 – 90% lipid của tế bào tập trung ở lớp photpholipid của màng. Chức năng chủ yếu của màng tế bào chất là tấm bình phong ngăn trở dòng các chất ra cũng như cho đi qua các hợp chất từ phía ngoài vào. Nó đảm bảo tế bào hấp thụ được các chất dinh dưỡng, các nguyên tố có lợi cho quá trình trao đổi chất. Màng tế bào chất chứa các enzyme sinh tổng hợp kiểm soát các khâu kết thúc tổng hợp lipid của màng và các hợp chất kiến tạo thành tế bào. Hình 2: Cấu trúc màng tế bào chất của vi khuẩn(theo Thuyết dòng khám) Vùng ưa nước Vùng kị nước Cuối cùng, màng tế bào chất là nơi định vị của nhiều enzyme tham gia tổng hợp ATP. Tế bào chất (Cytoplasm) là thành phần chính của tế bào vi khuẩn. Tế bào chất của vi khuẩn nhân nguyên nói chung, của vi khuẩn Lactic nói riêng gồm có 80 - 90% là nước, nước có thể ở trạng thái tự do (chiếm phần lớn) làm nhiệm vụ hòa tan các chất và tạo nên dung dịch keo với các chất cao phân tử. Nước ở trạng thái kết hợp (chiếm phần nhỏ) thường liên kết trong các vi cấu trúc như protein, lipid và hydratcarbon. Đây là vùng dịch thể dạng keo đồng nhất khi tế bào non và có cấu trúc phức tạp khi tế bào già. Nguyên sinh chất có hai bộ phận chính: +Cơ chất tương bào: dịch keo lỏng chủ yếu chứa các enzyme. +Các cơ quan con: mesosom, ribosom, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ. Mesosom là thể hình cầu, đường kính khoảng 250nm, gồm nhiều lớp bện chặt với nhau, nằm sát vách tế bào và chỉ xuất hiện khi tế bào phân chia. Hình 3: Cấu trúc của Mesosome Trong mesosom có nhiều hệ thống enzym vận chuyển điện tử. Hình 4: Cấu trúc của Ribosome Ribosom có đường kính 15 – 20nm, hằng số lắng 70S, (S là chữ đầu của Sverberg: Hệ số lắng, 1S = 10-13cm /giây trong siêu li tâm), trọng lượng phân tử 3.106 daltons. Mỗi ribosom, khi giảm nồng độ Mg2+ của dung dịch sẽ tách ra thành 2 tiểu phần trong siêu li tâm: tiểu phần lớn (50S) và tiểu phần nhỏ (30S). Ribosom chứa 40 – 60% ARN và 35 – 60% protein, một ít lipid, một số men như ribonuclease…và một ít chất khoáng giàu Mg và nghèo Ca. Mỗi tế bào chứa khoảng 10.000 ribosom, chiếm 40% trọng lượng khô tế bào. Ribosom là trung tâm tổng hợp protein của tế bào. Các chất dự trữ: +Các hạt hydrat cacbon: các hạt này chứa tinh bột hoặc glycogen hoặc các chất tương tự nắm trong tế bào chất như những chất dự trữ. H ình 5: L.acidophilus +Hạt volutin: đây là các chất dị nhiễm sắc. Volutin là một phức chất, cấu tạo bởi polyphotphat, lipoprotein, ARN và Mg+2… +Chất ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác: Trong một vài vi khuẩn có thể chứa thêm một loại chất đặc biệt. Ví dụ như Lactobacillus acidophilus sản xuất axit lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột. Chất nhân (nuclear body) là nhân nguyên thủy chưa có màng nhân. Hình 6: Cấu trúc của thể nhân Chất nhân là một cấu trúc ADN kép, xoắn lại khép kín thành hình vòng tròn. NST của vi khuẩn có chiều dài thay đổi trong khoảng 0,25 - 3µm và chứa 6,6 - 13×106 cặp base nito, số lượng hệ gen của vi khuẩn thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Ngoài NST, nhiều vi khuẩn còn chứa ADN ngoài NST, đấy cũng là những sợi ADN kép, dạng vòng kín, có khả năng sao chép độc lập gọi là plasmid. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Lactic. b) Đặc điểm chung: Vi khuẩn Lactic thuộc họ Steptococcaceae hay Lactobacillaceae và chúng được xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Chúng là những vi khuẩn Gram dương (G+), và trực khuẩn thường nhạy cảm hơn so với liên cầu khuẩn. H ình 7: Vi khuẩn lactic Hình 8: Lactococcus lactic Tất cả các vi khuẩn Lactic hầu hết không di động, không sinh bào tử (trừ Sporolactobacillus có khả năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt). Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra axit lactic (lactat). Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu. Vì vậy, chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng (polyauxotrophie) đối với nhiều axit amin, đối với nhiều bazo nucleic, nhiều loại vitamin… Cho nên, vi khuẩn Lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao và một môi trường sinh trưởng phức tạp. Đồng thời, chúng cũng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các pophyrin, bình thường chúng không có cytocrom. Vi khuẩn Lactic lên men được monosacarit và disacarit, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật này đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào. Các vi khuẩn Lactic không lên men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài L. delbruecki là đồng hóa được tinh bột). Một số khác sử dụng được pentoza và axit citric, mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình. Các vi khuẩn Lactic ngoài việc tạo thành axit lactic còn có một số loài tạo chất thơm (diaxetyl, axetoin, axit bay hơi…) như Streptococcus diaxetylactic. Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh axit lactic, chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí. Chúng thuộc bọn kị khí song đồng thời cũng là bọn hiếu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn Lactic (trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae). Nhóm vi khuẩn Lactic rất đa dạng (heterogene), gồm nhiều giống rất khác nhau. Riêng Lactococcus lactic gồm 6 loài; Lactobacillus gồm 40 loài. c) Cơ chế sinh trưởng: Các loài vi khuẩn Lactic có khả năng rất khác nhau để tạo thành axit trong môi trường và như vậy, sức chịu axit (hay độ bền với axit) của chúng cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit cao hơn (khoảng 2 – 3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4. Cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH = 5,5 – 6. Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn Lactic thuộc loại yếu. Không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucozo và các muối amon . Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin: riboflavin (Lactobacillus casei), tiamin (Lactobacillus fermenti), axit pantotenic (Leuconostoc mesenteroides), axit nicotinic (Lactobacillus arabinosus), axit folic (Streptococcus faecalis), biotin (Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides) và các axit amin. Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một khối lượng tương đối lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu. Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn Lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình photphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn Lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn Lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng. Lactozo + H2O D-glucozo + D-galactozo β-Galactozidase Có thể cho rằng, do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng đường lactozo. Lactozo là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexozo nó phải được phân cắt : Sau khi được photphorin hóa galactozo được chuyển thành glucozo + photphat. Để sinh trưởng bình thường,ngoài một nguồn cacbon, nito, một phần dưới dạng các axit min, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng…Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi (CaCO3). Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành axit qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc. Có thể dùng phương pháp CaCO3 để nhận biết sự có mặt của vi khuẩn Lactic: Nuôi cấy vi khuẩn Lactic trong môi trường MRS có bổ sung CaCO3 (nuôi cấy trên đĩa thạch), nếu vi khuẩn này sinh ra axit lactic thì nó sẽ phân giải được CaCO3 theo phương trình: 2H+  + CO32- CO2 + H2O Dựa vào sự biến đổi về màu sắc trên đĩa thạch mà người ta đánh giá được khả năng sinh axit lactic của vi khuẩn đó. Môi trường MRS: (Môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn Lactic): Casein peptone, tryptic digest 10.00 g Cao thịt (Meat extract) 10.00 g Cao nấm men (Yeast extract) 5.00 g Glucose 20.00 g Tween 80 1.00 g K2HPO4 2.00 g CH3CO2Na (Acetat Natrium) 5.00 g (NH4)2 citrate (Citrat ammonium) 2.00 g MgSO4 x 7 H2O 0.20 g MnSO4 x H2O 0.05 g Nước cất 1000.00 ml Điều chỉnh sao cho pH khoảng 6.2 - 6.5. 1 : Vi khuẩn Lactic 2 : Axit lactic phân giải CaCO3 (có màu xanh) 3 : Môi trường MRS có bổ sung CaCO3 (có màu vàng) 4 : Đĩa thạch Hình 8: Khả năng phân giải CaCO3 của các vi khuẩn sinh axit lactic Từ trên ta thấy, hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sự tổng hợp các axit amin. Chẳng hạn nhiều vi khuẩn Lactic cần bổ sung axit aspactic khi sinh trưởng trong một môi trường thiếu biotin. Song trong một môi trường giàu biotin, các vi khuẩn này không đòi hỏi axit aspactic nữa. Mối tương quan tương tự cũng gặp giữa axit folic và serin. Vitamin B6 – một vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các axit amin ở các vi khuẩn Lactic – cũng có thể được thay thế bởi một axit amin khác. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng lòai vi khuẩn Lactic. Đối với nhiều lòai vi khuẩn Lactic, nhiều lọai vitamin vẫn được coi là các axit amin không thể thay thế, tức là buộc phải có mặt trong môi trường. Các peptic và các amit cũng có thể được dùng làm nguồn nitơ và trong nhiều trường hợp các hợp chất này mang đặc tính của các nhân tố sinh trưởng. Tốc độ sinh trưởng khi có mặt chúng có thể tăng gấp nhiều lần so với khi có mặt các axit amin tự do. Sự phụ thuộc của tốc độ sinh trưởng vào nồng độ các vitamin có thể được sử dụng cho phép dịnh lượng các vitamin này nhờ vi sinh vật. Những phép thử này thường rất nhạy . Phương pháp: trong một giới hạn nồng độ nhất định, tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn tỷ lệ thuận với nồng độ của nhân tố sinh trưởng, do vậy bằng cách xác định sinh trưởng (đo nồng độ tế bào) có thể suy ra nồng độ của chất sinh trưởng.Người ta đã dùng phương pháp này để định lượng hàm lượng của axit folic trong cao nấm men nhờ Lactobacillus casei trong môi trường tổng hợp chứa một dung dịch cơ sở (B) có bổ sung các thành phần khác như riboflavin và piridoxal. Trong công nghiệp sản xuất axit lactic và các loại lactat, người ta thường sử dụng loài Lactobacillus delbrueckii và loài Lactobacillus coagulans, thuộc vi khuẩn ưa nhiệt và có khả năng tích lũy nhiều axit lactic. Ngoài nguồn cacbon (đường, rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột, dịch thủy phân inulin) cần sử dụng một số nguồn thức ăn bổ sung chứa đạm nito và các loại chất sinh trưởng (mầm đại mạch, cám, cao ngô…) với tỷ lệ thích hợp. Quá trình lên men được thực hiện thích hợp ở 48 – 500C trong 5 – 7 ngày với tỷ lệ môi trường là: nồng độ đường: 10 – 15%; lượng CaCO3 sử dụng là: 10%; mầm đại mạch: 0,375%; photphat amon: 0,25%. Nguồn nguyên liệu ban đầu là các chất có chứa tinh bột hoặc đường.Các nguyên liệu chứa tinh bột trước hết phải được phân giải bằng enzym hoặc bằng axit. Nếu nguồn nguyên liệu ban đầu là dịch đường sữa thì nên dùng Lactobacillus bulgaricus vì khả năng lên men lactozo của nó có hiệu quả hơn cả. Gần đây, người ta phát hiện ra rằng 1,2-propandiol có thể được sử dụng làm nguồn cacbon cho quá trình sản xuất axit lactic, nhưng chỉ với các chủng Arthrobacter oxidans, Alcaligenes faecalis hay Fusarium solani. Đây là một quá trình hiếu khí được thực hiện ở 25 – 370C trong môi trường chứa 3% 1,2-propandiol; 0,4% ure; 0,1% K2HPO4; 0,05% MgSO4.7H2O; 0,05% KCl; 0,001% FeSO4.7H2O; 0,05% cao nấm men, quá trình bắt đầu ở pH = 7 – 9. Vi khuẩn Lactic có hoạt tính protease: phân hủy được protein của sữa tới peptit và axit min. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn. Vi khuẩn Lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 -15% cồn hoặc cao hơn; một số trực khuẩn bền với NaCl (7 – 10%). Các vi khuẩn Lactic có khoảng nhiệt độ sinh trưởng tương đối rộng: ở 28 – 320C (L.casei, L.plantarum, L.leichmanii, L. brevis, L.buchneri…); ở 35 – 400C (L. fermenti); ở 37 – 450C (L. causasicus, L. lactic, L.acidophilus…). Các loài ưa nhiệt – có nhiệt độ tối thích là 45 - 620C (L. bulgaricus, L. thermophilus, L. delbrueckii…); các loài ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (50C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 – 800C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Một số loại có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác lại có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacterioxin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Trong tự nhiên vi khuẩn Lactic thường gặp ở trong đất, trong không khí, trong nước, nhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại quả, rau, sữa, thịt…). Có một số giống của vi khuẩn này thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật. Các dạng cầu khuẩn đường ruột được gọi là Enterococus (hoặc Streptococus fecalis). d) Phân loại : Phân loại vi khuẩn Lactic được coi là chưa hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ lactobacillaceae và được xếp vào bốn chi:Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium. Vi khuẩn Lactic được chia làm 2 loại: các vi khuẩn lên men đồng hình và các vi khuẩn lên men dị hình. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% axit lactic. Do thiếu porphyrin và cytocrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu thiếu năng lượng bằng con đường lên men bắt buộc. Nhóm vi khuẩn này gồm có các cầu khuẩn Streptococcus lactis,Streptococcus cremoris và các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum,Lactobacilus bulgaricus… Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh khoảng 50% axit lactic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hương Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diacetylactis, trực khuẩn Betabacterium… Thành phần AND cho ta biết tính gần gũi của các loài thuộc các giống. Tỷ lệ phần trăm của các bazơ Guamin (G) + Cytosin (C) (GC%) là gần gũi ở các loài thuộc giống Streptococcus (34 – 46%); Leuconostoc (36 – 43%) và Pediococcus (34 – 42%). Ngược lại giống Lactobacillus có các loài khác xa nhau (32 – 53%), và sự khác nhau này còn thấy ở ngay trong nội bộ của giống phụ. Tỷ lệ phần trăm GC của các loài thuộc giống Bifidobacterium dao động từ 55 đến 67% Sự tập hợp của 5 giống này vào cùng một nhóm vi khuẩn Lactic đã được khẳng định qua phương pháp phân loại phân tử (Taxonomiemolculaire). Phân tích trật tự các nuleotit của ARN ribosome (rARN) đã cho thấy trong cùng một nhánh lớn chủng loại phát sinh (groupe phylogenetique) có các giống: Lactobacillus, Pendiococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Propionibacterium, Bifibacterium. Trong khi đó các giống Lactobacillus, Lediococcus, Leuconostoc và Streptococcus mà tỷ lệ GC% của chúng thấp, dưới 50%, có thể xếp vào cùng nhánh chủng loại phát sinh của Clostridium và khác biệt với nhánh Actinomycetales có GC% cao hơn 50%, bao gồm Propionibacterrium và Bifidobacterium Dựa vào khả năng sinh trưởng trên môi trường có pH, NaCl, khả năng lên men các loại đường, t0, nhóm huyết thanh khác nhau mà người ta phân biệt các chủng loài thuộc giống (chi) Streptococcus; Streptococcus lactis subsp.lactis Streptococcus lactis subsp.diacetylactis Streptococcus lactis subsp.cremoris Streptococcus lactis raffinolactis Streptococcus lactis thermophilus ¯Giống (chi) Streptococcus (viết tắt Sc.) thuộc về họ Streptococcaceae, thuộc về lớp vi khuẩn gram dương (firmibacteria) bao gồm các cầu khuản lên men lactic đồng hình (trừ một số ít loài), bất động (trừ 1 ít loài), gram dương, đường kính cầu khuẩn 0,5 – 1um, sau khi phân chia theo một phương chúng thường tạo thành chuỗi, sống hoại sinh trong đất, bề mặt cây, da người, ruột… -Streptococcus lactis subsp.diacetylactis: phân biệt với loài Sc. Lactis ở chỗ có khả năng sử dụng xitrat và khi lên men đã sinh ra diaxetyl bên cạnh phần chủ yếu lá axit lactic. -Nhóm Streptococcus lactis thermophiles khác với Streptococcus lactis ở chỗ chúng sinh trưởng ở to tối ưu là 42 – 430C, và có thể chịu được ở 650C trong vòng 30 phút, các chủng ở đây mẫn cảm với Nacl. Những loài ở đây vẫn được mang tên là Streptococcus. ¯ Giống Leuconostoc (viết tắt Ln.) thuộc về lớp cầu khuần gram dương Firmibacteria, ngành (Division) Firmicutes, phần lớn chúng lên men lactic dị hình theo con đường hexoso – monophosphat. Khi phân chia chúng tạo thành cặp hoặc chuỗi. Những cầu khuẩn lên men lactic dị hìnhở đây được chia thành 4 nhóm theo phương pháp lai AND – AND. Những loài thường thấy trong lên men lactic dị hình và lên men malo lactic là: ŸLn. mensenteroides subsp. Mesenteroides; ŸLn. mensenteroides subsp dextranicum ŸLn. mensenteroides subsp cremoris; ŸLn. lactis; ŸLn.Pparamensenteroides; ŸLn.oenos. Một số loài Leuconostoc cùng với Lactobacillus gây lên quá trình lên men malolactic, đây là qúa trình lên men thứ hai sau khi lên men rượu vang, nó làm vang bớt chua, quá trình xảy ra mạnh khi trong vang còn nhiều axit tactric (COOH – CHOH – CHOH – COOH) và axit malic (COOH – CH2 – CHOH – COOH). ¯Giống (chi) Lactobacillus là những trực khẩn không sinh bào tử, thuộc lớp vi khuẩn gram dương Firmibacteria, Division Firmicutes. Những trực khuẩn này đứng riêng lẻ hay thành chuỗi, thủy phân đường saccharose mạnh, hình thành axit lactic dạng D, L hay DL, không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, casein, indole và H2S. Chúng không có catalaza và cytochrome oxydaza. Chúng là những vi khẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axit amin (auxotrophes). Rất nhiều loài được phân lập từ thịt mà ngày nay người ta thường viết thành giống Carnobacterium như Lactobacillus divergens, Lb. piscicola và Lp. Carnis. Giống Lactobacillus chia thành 3 nhóm: + Nhóm 1: được gọi là Thermobacterium, lên men đồng hình và ưa nhiệt (homofermentaire, thermophile). Không pentoza nào hoặc gluconate được chủng lên men. Những vi khuẩn nhóm này có fructose 1,6 disphosphate adolaza, chúng phát triển ở 450C. + Nhóm 2: được gọi là Strepto bacterium, đây là nhóm trực khuẩn lên men đồng hình và ưa ấm (homofermentaire, mesophile), nhiều loài của nhóm này có khả năng lên men dị hình , vì vậy người ta gọi nhóm này là lên men đồng dị hình . Các hexoza được lên men theo con đường EMP thành axit lactic, nhưng các pentoza được phân giải nhờ con đường lên men dị hình để tạo thành axit lactic, axit axetic do phosphoxetolaza được cảm ứng. +Nhóm 3: gồm những trực khuẩn có tên gọi là Bentabacterium, chúng là những cơ thể lên men dị hình bắt buộc (strictement heeterofermentaire). Chúng sinh ra axit lactic, axit axetic CO2, ethanol.Những vi khuẩn này có phosphocetolaza nhưng không có adolaza. Phân biệt các loài ở đây bằng sự lên men các loại đường, bản chất isomere của axit lactic được hình thành, nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng, bản chất của mocopeptit, thành phần axit béo của tế bào. ¯Giống Pediococcus (viết tắt Pc.): gồm những tụ cầu hoặc dạng song cầu lên men lactic đồng hình, hình thành axit lactic dạng DL hoặc L(+), chúng đòi hỏi các chất dinh dưỡng, có hoạt tính thủy phân protein yếu. Đối với phần lớn Pediococcus chúng không có khả năng sử dụng lactose. Vì vậy không làm axit hóa và đông tụ sữa. Các loài Pediococcus khác nhau bởi tính chịu nhiệt, chịu pH, chịu NaCl và phổ lên men đường. ¯Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn kỵ khí không sinh bào tử, Gram dương, bất động. Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có phân nhánh có dạng chữ Y.V. tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành trực khuẩn thẳng hoặc hơi uốn cong với những hạt dự trữ nhuộm màu bởi xanh methylen. Trước đây người ta viết giống này trong Lactobacillus. Ví dụ Lb.bifidus, nhưng theo Bergey’s 1986 thì chúng được tách thành giống riêng mang tên Bifido bacterium và xếp vào họ Actinomyce-taceae. Chúng lên men lactic dị hình, sản phẩm chính của chúng là axit axetic và axit lactic (tỷ lệ 3:2), cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit xuccinic. Nhưng khác biệt với vi khuẩn lên men lactic dị hình khác là chúng không sinh CO2, chúng là những cơ thể catalaza âm, nitrat dương, indole và genlatin âm. Chúng không hình thành axit từ các đường sau: rhamnoza, sorboza, adontol, dulcitol, erythritol và glyxerol. Chúng là những cơ thể ưa ấm ( t0 sinh trưởng là 31 – 410C), chúng không chịu được pH 5,0 – 4,5. Hiện nay đã mô tả tỉ mỉ 25 loài thuộc giống này, các loài thường gặp là: B.bifidum, B.infantis, B.liberorum, B.lactensis B.cornutum, Bifidobacterium animals Lactobacillus brevis Pediococcus sp Bifidobacterium animals e) Cấu tạo của một số vi khuẩn trong muối dưa, muối cà: ¯Cấu tạo của Lactobacillus brevis (tên cũ là L. brassica fermentati) Trực khuẩn, có những dạng tạo khí, không tạo khí. Trong môi trường nhân giống có độ axit 0,7 – 0,8 % và có thể bảo quản lạnh không quá 2 – 3 ngày. Được tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột. Vì vậy, nó còn được gọi là trực khuẩn bắp cải. Trong lên men, ngoài axit lactic (tới 1,2%), nó còn tạo thành axit axetic, rượu êtylic (tới 2,4%) và CO2, nó còn tạo hương làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu. ¯Cấu tạo của Lactobacillus plantarum Khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 300C, Giống này thấy chủ yếu trong muối chua rau dưa và ủ xylo thức ăn xanh dùng trong chăn nuôi. III.Cơ chế của quá trình lên men lactic: 1.Mức năng lượng: Đối với một số nhóm VSV thì nguồn năng lượng là chất dinh dưỡng đã được tế bào hấp thụ. Khi các liên kết hoá học trong các chất dinh dưỡng bị đứt, năng lượng được giải phóng ở dạng hoá năng và sẽ được tế bào hấp thu, thu nhận để sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau (tổng hợp các cấu trúc tế bào, tổng hợp các hợp chất cao phân tử, sử chữa và duy trì tế bào, sinh trưởng và sinh sản, di động, tiếp hợp...). Với một nhóm VSV khác thì nguồn năng lượng lại là ánh sáng. Chúng chuyển hoá quang năng thành hoá năng để sử dụng cho các quá trình trao đổi chất. - Quá trình chuyển hoá các chất dinh dưỡng và chế biến để tổng hợp ra các hợp chất riêng của tế bào được gọi là quá trình đồng hoá (còn gọi là quá trình trao đổi chất xây dựng hay trao đổi chất kiến tạo) - Ngược lại quá trình phân huỷ các thành phần của tế bào VSV được gọi là quá trình dị hoá. - Hai quá trình trên tương tác với nhau và diễn ra đồng thời. Quá trình đồng hoá bao giờ năng lượng tự do của sản phẩm cũng lớn hơn năng lượng tự do của các chất phản ứng. Còn trong quá trình dị hoá, năng lượng tự do của các chất phản ứng bao giờ cũng lớn hơn năng lượng tự do của sản phẩm. Quá trình ôxi hoá - phân huỷ kèm theo sự giải phóng năng lượng cần thiết cho hoạt động sống gọi là quá trình trao đổi năng lượng. Ở tế bào VSV, số lượng các chất dự trữ thường rất nhỏ, do vậy chúng phải sử dụng chủ yếu các chất hấp thu từ môi trường xung quanh. Các dạng tự dưỡng: Các vi khuẩn này có những nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nhất. Chỉ dùng dioxit carbon như nguồn carbon duy nhất, các hợp chất amoni như là nguồn nitơ duy nhất, chúng tạo ra được tất cả các hợp chất riêng cho chúng như vitamin, đường, axít amin và các nucleotit. Các dạng dị dưỡng : Ða số vi khuẩn là dị dưỡng, có nghĩa chúng lấy năng lượng do phân hủy các hợp chất hữu cơ có sẵn. Chúng thường là sinh vật hoại sinh, dinh dưỡng trên xác chết hữu cơ bằng cách tiết enzym và hấp thu sản phẩm hòa tan của hoạt động enzym. Các dạng vi khuẩn dị dưỡng khác nhau dinh dưỡng trên các hợp chất hữu cơ khác nhau. Nguồn năng lượng hữu cơ có thể đơn giản như metan (CH4), hoặc phức tạp như celluloz. Thường thường chúng sủ dụng những hợp chất trung gian như axít lactic, axít pyruvic hoặc glucoz. Một số ít loài có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng có trong dầu mỏ. Nói chung vi khuẩn hoại sinh có một vai trò sống còn về mặt sinh thái như những tác nhân phân hủy để đảm bảo nguồn cacbon, nitơ và các nguyên tố khác dưới dạng mà cơ thể sống có thể dùng được. Trong lên men lactic các chất dinh dưỡng tham gia vào các phản ứng chuyển hoá phức tạp và hoá năng của các chất được chuyển thành các hợp chất giàu năng lượng là ATP ( Adenozin triphosphat) . ATP trong quá trình phân giải sẽ cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động của vi sinh vật. Lượng ATP luôn được tái tổng hợp tuỳ theo mức độ tiêu hao. Các chất creatin photphat (CP), glucoza và glycogen có thể phân giải để tạo năng lượng cho quá trình tái tổng hợp ATP trong điều kiện yếm khí. Quá trình tái tạo năng lượng còn có thể là sự oxi hoá các chất glucoza,glycogen, axit béo tự do, glycerol và những sản phẩm không chứa nitơ của axit amin trong điều kiện hiếu khí. ATP là đồng tiền năng lượng vì: -ATP có chứa các liên kết cao năng, có đặc điểm mang nhiều năng lượng. -ATP lại có năng lượng hoạt hóa thấp nên dễ dàng bị phá vỡ và giải phóng năng lượng. -Các phản ứng thu nhiệt trong tế bào đều cần một năng lượng hoạt hóa ít hơn 7,3 kcal, nên ATP có khả năng cung cấp đủ năng lượng cho tất cả mọi hoạt động của tế bào Dựa vào hai quá trình lên men là đồng hình và dị hình mà có mức năng lượng khác nhau: a)Trong lên men dị hình: Một phân tử gam (mol) lactoza được sử dụng cho ra 4 phân tử lactate + 5ATP (2ATP theo sự phân giải glucoza và 3ATP theo sự phân giải galactoza) b)Trong lên men dị hình: Một mol lactoza lên men chỉ sinh ra được 3 phân tử lactate và 4 phân tử ATP. Nồng đọ đường lactoza trong sữa khá lớn 2. Quá trình lên men lactic trong muối dưa có thể chi thành ba giai đoạn: a)Giai đoạn đầu: Vi khuẩn Lactic phát triển cùng với tạp khuẩn. Muối dùng trong muối dưa vào khoảng từ 3 – 4%. Ở nồng độ này chưa đủ diệt các vi khuẩn hoại sinh. Nếu nồng độ muối quá cao sẽ giúp cho quá trình teo nguyên sinh và tiết dịch tế bào trong rau quả được tốt nhất nhưng cũng ức chế nhiều vi khuẩn phát triển, trong đó có vi khuẩn Lactic. Để cho sự thẩm thấu dịch tế bào rau ra nước muối được tốt, cần phải nén chặt rau. Trong giai đoạn này axit lactic dần dần được tích tụ và ức chế các vi khuẩn hoại sinh. Muối có tác dụng nâng cao áp suất thẩm thấu trong nước dưa giúp cho quá trình teo nguyên sinh ở tế bào thực vật, làm cho dịch tế bào tiết ra ngoài, trong dịch này có các chất đường, tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển. Trong giai đoạn này cùng với vi khuẩn Lactic còn có các vi khuẩn gây thối cũng phát triển. Trong giai đoạn này lúc đầu vi khuẩn Lactic chỉ chiếm 5-10% còn vi sinh vật gây thối chiếm 85-90%. b)Giai đoạn 2: Giai đoạn 2 là giai đoạn lên men chính. Vi khuẩn Lactic bắt đầu phát triển mạnh mẽ. Do vi khuẩn Lactic phát triển mạnh nên pH môi trường giảm 3-3,5 làm ức chế các vi khuẩn khác, chỉ còn vi kkhuẩn Lactic phát triển, chúng chiếm ưu thế tuyệt đối làm cho rau quả trở nên chua và ngon hơn. Đây là giai đoạn quyết định, nếu không tạo đươc ưu thế của vi khuẩn Lactic thì các vi khuẩn khác sẽ phát triển làm rau hư: - Rau quả rửa không kỹ, dập nát, có nhiều tạp khí. - Nồng đô muối không đúng. Nếu nồng độ muối quá 5-6% sẽ ức chế các vi khuẩn Lactic, nếu dưới 3% thì nhiều tạp khuẩn sẽ phát triển lấn át. - Không đậy, nén kỹ. - pH là yếu tố quan trọng, nếu vi khuẩn lactic phát triển ưu thế thì pH sẽ 3-3,5, còn nếu không thì vi sinh vật khác sẽ phát triển (pH 4,5-5 vi khuẩn gây thối hoạt động, pH 5-5,5 vi khuẩn đường ruột phát triển, pH 2,5-3 nấm men hoạt đông, pH 1,2-3 nấm men phát triển). c) Giai đoạn 3: Khi tích tụ axit đến nồng độ cao 1,2% các vi sinh vât gây thối bị tiêu diệt và ức chế mạnh. Đồng thời ở nồng độ này chính vi khuẩn Lactic cũng bắt đầu bị ức chế, giai đoạn muối chua coi như kết thúc, có thể sử dụng dược sản phẩm trong một thời gian, thường 5-10 ngày chất lượng vẫn tốt. Thường sản phẩm tốt nhất khi hàm lượng axit đạt 0,8-2%. Quá trình lên men lactic dừng lại khi lactic là 1,5-2,4%. d)Một số lưu ý khi muối dưa: Trong quá trinh muối dưa ta cần chú ý thời gian, nhiệt độ, nồng dộ cơ chất,.... Thời gian muối dưa khoảng 10 – 12 ngày, nhiệt dộ thích hợp khoảng 20oc. Nếu nhiệt độ cao sẽ làm dưa nhanh bị hư thối. Dưa muối thỉnh thoảng bị nhớt do các chủng sinh nhầy của vi khuẩn Lactic phát triển. Hiện tượng này hay gặp khi lên men ở nhiệt độ cao. Trong quá trình lên men trên bề mặt nước dưa xuất hiện bọt khí CO2, ở các bọt này chứa nhiều vi khuẩn gây hại, vì vậy cần phải vớt bọt này bằng vợt vải sạch. Đôi khi muối dưa bị thâm do tiếp xúc với oxy không khí trong trường hợp nước dưa không đủ ngập rau. Hiện tượng dưa thâm còn do sự phát triển của các tạp khuẩn, đặc biệt là trong trường hợp lên men ở nhiệt độ cao (trên 300C) hoặc khi muối phân bố không đều đặn hoặc nồng độ muối quá cao làm cho vi khuẩn Lactic ức chế mà các vi khuẩn khác phát triển. Những nấm dại phát triển làm giảm độ axit của nước dưa, làm cho dưa có dư vị khác. Nếu trên bề mặt nước dưa thấy có váng nghĩa là có nấm mốc, nấm men phát triển. Các vi sinh vật này ăn axit lactic làm cho độ axit trong nước dưa giảm, tạo điều kiện cho các vi khuẩn hoại sinh phát triển gây hư hỏng dưa. Khi trên bề mặt nước dưa có màng là do nấm mốc và bấm men tạo màng gây ra: Mycoderma, Aspergillus, Torula, Oidium lactis, Penilium v.v… Khi bảo quản dưa thành phẩm cần phải vớt bỏ màng hoặc bảo quản dưa ở nhiệt độ thấp tránh hiện tượng này. Muối dưa theo phương pháp công nghiệp người ta chứa rau dưa trong các thùng kín làm bằng các vật liệu không gỉ, có víp ép, tiện cho việc lấy sản phẩm và làm công tác vệ sinh, dễ điều chỉnh nhiệt độ và lấy mẫu theo dõi quá trình động học rong lên men. Đặc biệt là trong công nghiệp người ta dùng chủng vi khuẩn thuần khiết, nhân giống và dùng cho lên men cho hiệu quả lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt. 3. Sử dụng giống thuần chủng trong muối dưa: Để rút ngắn thời gian muối dưa và cải thiện chất lượng sản phẩm người ta dùng những giống thuần chủng vi khuẩn Lactic. Giống được nhân trong môi trường chứa nước ép từ rau cải hoặc bắp cải ở 15 – 300C khoảng 3 ngày. Vi khuẩn Lactic dùng trong mục đích này có thể là Lactobacillus brasscae fermentati. Tỷ lệ dùng giống khi muối dưa là 1,25% so với nguyên liệu. Trong quá trình muối dưa người ta còn tìm thấy nấm men Sacharmyces brassicae fermentati, gây lên men rượu (tích tụ được 0,5 – 0,8% cồn etylic). Nhờ vậy mà những este phức tạp được tạo thành, làm cho dưa có mùi thơm. Nhưng, những tế bào nấm men ở đây không được nhiều quá. Trong trường hợp lên men bình thường tỉ số giữa tế bào nấm men với vi khuẩn là 1/80 – 1/130, còn trong trường hợp lên men kém ta thấy tỉ số này là 1/3 – 1/35. Dùng giống thuần chủng còn giúp cho công việc muối dưa dễ cơ khí hóa và nâng cao được năng xuất trong quy mô công nghiệp.