Tối ưu hóa phản ứng thủy phân mật bò cho quy trình tách axit cholic bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

Phân tích thống kê cho thấy các giá trị P của biến độc lập bậc 1 và biến độc lập bậc 2 X12, X22 , X32đều nhỏ hơn 0,05 cho thấy mức độ ý nghĩa cao của các thành phần này tham gia vào phƣơng trình. Hệ số xác định R2 = 0,9436 cho biết 94,36 % sự biến đổi của hiệu suất thủy phân là doảnh hƣởng của các biến độc lập nhƣ nhiệt độ thủy phân, nồng độ NaOH và thời gian thủy phân, chỉ có 5,64 % sự thay đổi là do các yếu tố không xác định đƣợc gây ra (sai số ngẫu nhiên). Đồ thị các đƣờng đồng mức (contour) ở hình 3 a,c,e đƣợc xây dựng trên cơ sở giữ cố định thời gian, nhiệt độ và nồng độ NaOH tƣơng ứng. Đồ thị hình a và b cho thấy khi tăng nồng độ NaOH, hiệu suất thủy phân có xu hƣớng giảm. Điều này là do ở môi trƣờng kiềm cao, phản ứng thủy phân xảy ra không chỉ ở các liên kết tauro- và glyco- để chuyển hóa acid mật liên hợp về dạng tự do mà phản ứng thủy phân còn xảy ra trên cấu trúc các axit mật làm thay đổi cấu trúc của axit cholic và axit deoxycholic. Từ các mô hình bề mặt đáp ứng đƣợc xây dựng thực hiện dò tìm các điểm tối ƣu từ các đồ thị. Các điểm tối ƣu đƣợc dò tìm từ các đồ thị bề mặt đáp ứng (khi cố định một nhân tố và chọn cặp nhân tố tƣơng tác) đƣợc trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân tối ƣu đạt đƣợc trong khoảng 98,66-98,91 %, khi thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ 92,35 oC, nồng độ NaOH 10,38 % trong thời gian 7,25 giờ

pdf5 trang | Chia sẻ: honghp95 | Lượt xem: 485 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tối ưu hóa phản ứng thủy phân mật bò cho quy trình tách axit cholic bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tạp chí Hóa học, 55(1): 38-42, 2017 DOI: 10.15625/0866-7144.2017-00413 38 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân mật bò cho quy trình tách axit cholic bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Trần Bội An, Phan Minh Vương, Phạm Cao Thanh Tùng, Phan Thanh Thảo* Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Đến Tòa soạn 7-7-2016; Chấp nhận đăng 6-02-2017 Abstract Hydrolysis reaction of cow bile was used to convert bile acid into free cholic acid. This study examined the implementation conditions of the hydrolysis reaction to optimize the performance obtained free acid using RMS method combined with CCD model. Meanwhile reaction yield and cholic acid content was determined by HPLC-ELSD method. Research results showed that a good connection could establish between the concentration of free cholic acid converting from the conjugate acid hydrolysis and temperature, concentration of NaOH, hydrolysis time. Response surface model was used to optimize the hydrolysis conditions. Highest free cholic acid content (98.66 to 98.91 %) was obtained in optimal conditions with 10.38 % NaOH concentration, at 92.35 oC, for 7.25 hours. Keywords. Bile acid, hydrolysis, cholic acid. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Axit mật có tác dụng giúp tiêu hóa và hấp thu chất béo, vitamin. Axit mật cũng có tác dụng điều chỉnh sự cân bằng nồng độ cholesterol, triglyceride, glucose và năng lƣợng trong tế bào. Axit cholic là axit mật sơ cấp tiêu biểu, có mặt trong hầu hết các loại mật động vật, có nhiều ứng dụng quan trọng trong điều trị bệnh [1, 2]. Axit cholic còn có vai trò là nguyên liệu tổng hợp một số các axit mật có giá trị trị liệu cao với trữ lƣợng trong tự nhiên rất thấp nhƣ axit ursodeoxycholic, acid chenodeoxycholic [3- 6]. Axit cholic trong tự nhiên thƣờng tồn tại ở dạng liên hợp với nhóm tauro- và glyco-, vì vậy để thu đƣợc acid cholic tự do cần phải phải thực hiện phản ứng thủy phân để tách các nhóm liên hợp này. Hiệu suất của phản ứng thủy phân dịch mật có ý nghĩa quan trọng đối với công đoạn tách chiết axit cholic từ kết tủa axit mật thô, do đó cần phải tối ƣu hóa hiệu suất phản ứng thủy phân này để đạt đựơc hiệu suất tách axit cholic cao nhất. Trong nghiên cứu này, các thí nghiệm đƣợc thực hiện theo mô hình phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với mô hình tâm phức hợp (CCD) để tối ƣu hóa phản ứng thủy phân dịch mật bò. 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Dịch mật bò đƣợc cung cấp bởi Công ty chế biến gia súc Vissan – Thành phố Hồ Chí Minh. Axit cholic chuẩn - Sigma Aldrich (Mỹ), dung môi sử dụng bao gồm metanol, etyl axetat, n-hexan là dung môi tinh khiết của hãng Labscan (Thái Lan). Các hóa chất sử dụng cho quá trình thủy phân NaOH, HCl tinh khiết của hãng Xilong, Trung Quốc. 2.2. Phản ứng thủy phân mật bò 500 mL dịch mật bò đƣợc hòa tan trong cồn 90 độ ở 60 oC, sau đó lọc qua giấy lọc để loại bỏ các thành phần mỡ, màu mật và cặn không tan. Dịch mật sau khi loại cồn và nƣớc đƣợc sấy chân không thu đƣợc 90 g bột rắn (mật thô). 5 g mật thô đƣợc hòa tan lại trong 20 mL nƣớc cất, thu đƣợc dung dịch pH = 9, dung dịch này đƣợc axit hóa đến pH = 6,5, không có kết tủa đƣợc tạo ra. Dung dịch tiếp tục đƣợc axit hóa đến pH 1,5 kết tủa axit mật tự do. Kết tủa đƣợc lọc và sấy thu đƣợc 4,6 g axit mật thô. Thành phần axit mật thô đƣợc xác định trên HPLC-MS, kết quả đƣợc thể hiện trong hình 1. Các axit mật đƣợc xác định tại các khoảng thời gian lƣu với các tín hiệu m/z nhƣ sau: axit cholic (CA, t = 5,527; m/z = 426,4), axit glycocholic (GCA, t = 2,571; m/z = 466,4), axit taurocholic (TCA, t = 1,895; m/z = 533,3). Trên phổ đồ HPLC- MS không có sự xuất hiện pic của axit deoxycholic (DCA), điều này cho thấy DCA không tồn tại ở dạng axit tự do (có pKa 6,5 và tạo tủa tại pH 6-6,2) trong axit mật thô mà thay vào đó thu đƣợc DCA ở dạng liên hợp là axit glycodeoxycholic (GDCA, t = 6,247; TCHH, 55(1) 2017 Phan Thanh Thảo và cộng sự 39 m/z = 450,1), acid taurodeoxycholic (TDCA, t = 7,420; m/z = 517,2) [7]. 0 2 4 6 8 10 Acid Taurodeoxycholic Acid Cholic Acid Glycocholic Acid Glycodeoxy cholic Acid Taurocholic A Hình 1: (A) Sắc kí đồ HPCL-MS của axit mật thô; (B) Phổ MS của axit cholic, glycocholic và taurocholic Hình 2: Sắc kí đồ HPLC của kết tủa I (a) và kết tủa II (b) Bảng 1: Thành phần axit tự do và axit liên hợp trong 4,6 g axit mật thô Thành phần trong axit mật thô Thành phần DCA tự do và DCA trong axit liên hợp Thành phần CA tự do và CA trong axit liên hợp Hàm lƣợng trong CA tổng (%) Ký hiệu Khối lƣợng (g) Hàm lƣợng (%) Khối lƣợng trong axit mật thô (g) Hàm lƣợng (%) Khối lƣợng trong axit mật thô (g) Hàm lƣợng (%) CA 0,43 9,49 DCA 0 0 CA 0,43 9,49 29,14 m1 GCA 0,32 7,12 DCA từ GDCA 0,68 14,33 CA từ GCA 0,28 6,24 19,18 m3 * TCA 0,97 21,26 DCA 0 0 DCA từ TDCA 0,75 15,83 CA từ TCA 0,77 16,82 51,68 m4 * GDCA 0,75 16,47 TDCA 0,93 20,23 DCA tổng 1,44 30,16 CA tổng 1,49 32,55 100,00 m2 *m3 và m4 là khối lƣợng axit cholic tách từ axit liên hợp tƣơng ứng GCA và TCA: m2 = m1 + m3 + m4 Hình 1: A. Sắc ký đồ HPLC-MS của acid mật thô; B. Phổ MS của acid cholic, glycocholic và taurocholic 0 2 4 6 8 10 12 14 16 DCA (m DCA1 ) m A = m CA1 + m DCA1 3a 3b m B = m CA2 + m DCA2 DCA (m DCA2 ) Hình 2: Sắc kí đồ HPLC của kết tủa I (a) và kết tủa II (b) TCHH, 55(1) 2017 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân 40 Điều này hoàn toàn hợp lý với thực nghiệm khi tại pH 6 không xuất hiện kết tủa của DCA tự do. Thành phần axit tự do và axit liên hợp trong axit mật thô đƣợc thể hiện trong bảng 1. Phản ứng thủy phân nhằm mục đích sử dụng nhiệt độ để cắt đứt liên kết giữa các axit mật với các nhóm tauro- và glyco-, ở môi trƣờng kiềm phản ứng này sẽ tạo muối kiềm của các axit mật (CA và DCA), các muối này tan trong nƣớc [8]. Sau đó, axit hóa đến pH thích hợp để tách loại các axit DCA pKa = 6,5 đƣợc tách ở ở pH 6-6,2 và CA pKa = 5,2 ở pH 3 [10]. 5 g acid mật thô đƣợc hòa tan trong 20 mL dung dịch NaOH 1 N, gia nhiệt đến điều kiện khảo sát và thực hiện phản ứng thủy phân trong bình cầu có gắn sinh hàn hồi lƣu, và theo dõi phản ứng theo thời gian. Làm nguội dung dịch phản ứng đến 60 oC, axit hóa đến pH 8,5 thu đƣợc 0,4 g kết tủa acid béo. Dung dịch sau lọc đƣợc làm nguội đến nhiệt độ phòng, axit hóa đến pH 6 tạo kết tủa I, lọc, sấy thu đƣợc bột rắn mA (g) đƣợc xác định trên phổ đồ HPLC-MS là hỗn hợp DCA và CA (hình 3a). Tiếp tục acid hóa dung dịch sau lọc đến pH 3 thu đƣợc kết tủa II, lọc sấy và thu đƣợc mB (g) bột rắn xác định trên phổ HPLC-MS thành phần chủ yếu là CA (hình 3b). Các axit liên hợp có pKa thấp, không bị tủa ra trong môi trƣờng pH 3 nên còn lại ở dạng hòa tan trong dung dịch qua lọc [10]. Khối lƣợng CA (mCA) và DCA (mDCA) trong axit mật thô đƣợc xác định nhƣ sau: mCA = m2’ = mCA1 + mCA2 (g) ; mDCA = mDCA1 + mDCA2 (g) Kết quả nghiên cứu này là khảo sát các điều kiện phản ứng thủy phân mật bò để thu đƣợc lƣợng CA tối ƣu. Do đó hiệu suất (y) của phản ứng thủy phân đƣợc xác định trên lƣợng CA tự do thu đƣợc sau phản ứng thủy phân (m2’) so với lƣợng CA tổng có trong axit mật thô (m2), hiệu suất phản ứng đƣợc tính theo công thức sau: 2 2 ' 100 m H m (%) (1) 2.3. Phương pháp phân tích Thành phần axit mật thô đƣợc xác định bằng sắc ký lỏng cao áp kèm đầu dò khối phổ HPLC-ESI-MS Agilent 1260-6120B, cột Zorbax Eclipse Plus C18 4,6x150, 1,8 µm, hệ pha động axetonitril: axit formic 0,1 % (40:60), tốc độ dòng pha động 0,5 ml/phút. Hàm lƣợng axit cholic trong axit mật thô đƣợc xác định theo đƣờng chuẩn axit cholic xây dựng trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp Agilent 1260 HPLC- ELSD, cột Zorbax Eclipse Plus C18 4,6x250,5 µm, hệ pha động axetonitril:amonium axetat 50 mM, pH 3 (40:60), tốc độ dòng pha động 1 ml/phút, nhiệt độ hóa hơi dung môi 60 oC, tốc độ dòng khí N2 1,6 mL/phút. 2.4. Phương pháp thống kê 2.4.1. Lựa chọn nhân tố độc lập ảnh hưởng đến hàm mục tiêu y (hiệu suất thủy phân) Trong nghiên cứu này sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để phân tích, xây dựng phƣơng trình hồi quy và giải bài toán tối ƣu. Bài toán tối ƣu đƣợc lập dựa trên phƣơng trình hồi quy xác định bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm là hàm mô tả sự phụ thuộc của hiệu suất thủy phân vào các nhân tố: nhiệt độ thủy phân (73,18-106,82), nồng độ NaOH (1,59-18,41) và thời gian thủy phân (3,64- 10,36). 2.4.2. Phân tích thống kê Mô hình toán học đƣợc chọn biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất thủy phân vào các nhân tố đƣợc mã hóa là phƣơng trình đa thức bậc hai có dạng: 3 3 2 3 2 0 ij 1 1 1 1 1 i i ii i i j i i i j y b b X b X b X X Trong đó y là hiệu suất của quá trình thủy phân đƣợc xác định theo công thức (1): 2 2 ' 100 m y H m Xi lần lƣợt là nhiệt độ thủy phân, nồng độ NaOH và thời gian phản ứng thủy phân; bi là các hệ số bậc 1; bij là các hệ số tƣơng tác của từng cặp yếu tố; bii là các hệ số bậc 2; Xi, Xij, Xii là các biến độc lập. Kiểm định sự tƣơng thích của dữ liệu theo mô hình và dữ liệu thực nghiệm đƣợc thực hiện. 2.4.3. Số thí nghiệm Số thí nghiệm N = 2k + 2k + 6 (N = 20 với k = 3). Trong đó, k là số biến số độc lập và 2k là số thí nghiệm bổ sung tại điểm sao. Khoảng cách từ tâm đến điểm sao α = 2k/4 (α = 1,68 với k = 3). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở năm mức (-α, -1, 0, +1, + α). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân đến hiệu suất TCHH, 55(1) 2017 Phan Thanh Thảo và cộng sự 41 3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân Hình 3 là các đƣờng đồng mức thể hiện sự ảnh hƣởng của các yếu tố khảo sát đến hiệu suất thủy phân. Thực hiện phản ứng tại 80 oC hiệu suất phản ứng chỉ đạt 50,11 %, tiếp tục khảo sát tăng dần nhiệt độ phản ứng, thì hiệu suất thủy phân đạt cao nhất ở 90 oC đạt 96,97 %. Khi tăng nhiệt độ cao hơn, hiệu suất giảm, do ở nhiệt độ cao, phản ứng thủy phân xảy ra mạnh hơn, không chỉ phá vỡ liên kết của nhóm tauro- và glyco- trên cấu trúc phân tử axit cholic và axit deoxycholic mà phản ứng thủy phân còn xảy ra trên một số các thành phần khác và cả các axit mật tự do, làm thay đổi cấu trúc axit mật, kết quả làm giảm hiệu suất thu đƣợc axit cholic tự do. 3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH Nồng độ NaOH có ảnh hƣởng quan trọng đến hiệu suất thủy phân. Tăng nồng độ NaOH làm tăng đáng kể hiệu quả thủy phân, tuy nhiên khi nồng độ NaOH tăng vƣợt mức giới hạn sẽ có tác dụng ngƣợc và làm giảm hiệu suất thủy phân. 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Hiệu suất thủy phân tăng khi tăng thời gian phản ứng, và phản ứng thủy phân đạt bão hòa sau 9 giờ. Tăng thời gian phản ứng không làm tăng hiệu suất thủy phân. 2.5. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng thủy phân mật bò bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp RSM kết hợp với mô hình CCD Hình 3: Các đƣờng đồng mức (a), (b), (c) và đồ thị 3D (d), (e), (f) (3D response surface) cho biết ảnh hƣởng của các cặp yếu tố đến hiệu suất thủy phân mật bò; (a) và (d): nhiệt độ thủy phân – nồng độ NaOH; (b) và (e): thời gian – nồng độ NaOH; (c) và (f): thời gian – nhiệt độ thủy phân Bảng 2: Các điểm tối ƣu đƣợc dò tìm (khi cố định một nhân tố) Các cặp nhân tố tƣơng tác Nhân tố cố định Hiệu suất thủy phân (%) Giá trị nhân tố tƣơng tác Nhiệt độ thủy phân – Nồng độ NaOH Thời gian thủy phân (7 giờ) 98,86 Nhiệt độ: 92,35 oC Nồng độ NaOH: 10,38 % Nhiệt độ thủy phân – Thời gian thủy phân Nồng độ NaOH (10 %) 98,66 Nhiệt độ: 93,09 oC Thời gian: 7,63 giờ Nồng độ NaOH – Thời gian thủy phân Nhiệt độ thủy phân (90 oC) 98,91 Nồng độ: 11,04 % Thời gian: 7,25 giờ Phản ứng thủy phân chịu ảnh hƣởng từ ba nhân tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian thủy phân. Hiệu suất thủy phân thể hiện mức độ chuyển hóa axit mật liên hợp về dạng axit tự do (axit cholic, axit deoxycholic), có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu hồi các axit tự do. Do đó, tối ƣu hóa phản ứng thủy phân với các thông số nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian thủy phân nhằm chọn đƣợc các điều TCHH, 55(1) 2017 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân 42 kiện kỹ thuật phù hợp cho quá trình thủy phân mật bò với hiệu quả cao nhất. Mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa hiệu suất phản ứng thủy phân với các biến mã hóa nhƣ sau: Y = 95,80 + 15,23X1 + 11,75X2 + 5,75X3 + 8,90 X1X2 – 14,69X1 2 – 16,92 X2 2 – 7,99X3 2 (2) Phân tích thống kê cho thấy các giá trị P của biến độc lập bậc 1 và biến độc lập bậc 2 X1 2, X2 2 , X3 2đều nhỏ hơn 0,05 cho thấy mức độ ý nghĩa cao của các thành phần này tham gia vào phƣơng trình. Hệ số xác định R2 = 0,9436 cho biết 94,36 % sự biến đổi của hiệu suất thủy phân là doảnh hƣởng của các biến độc lập nhƣ nhiệt độ thủy phân, nồng độ NaOH và thời gian thủy phân, chỉ có 5,64 % sự thay đổi là do các yếu tố không xác định đƣợc gây ra (sai số ngẫu nhiên). Đồ thị các đƣờng đồng mức (contour) ở hình 3 a,c,e đƣợc xây dựng trên cơ sở giữ cố định thời gian, nhiệt độ và nồng độ NaOH tƣơng ứng. Đồ thị hình a và b cho thấy khi tăng nồng độ NaOH, hiệu suất thủy phân có xu hƣớng giảm. Điều này là do ở môi trƣờng kiềm cao, phản ứng thủy phân xảy ra không chỉ ở các liên kết tauro- và glyco- để chuyển hóa acid mật liên hợp về dạng tự do mà phản ứng thủy phân còn xảy ra trên cấu trúc các axit mật làm thay đổi cấu trúc của axit cholic và axit deoxycholic. Từ các mô hình bề mặt đáp ứng đƣợc xây dựng thực hiện dò tìm các điểm tối ƣu từ các đồ thị. Các điểm tối ƣu đƣợc dò tìm từ các đồ thị bề mặt đáp ứng (khi cố định một nhân tố và chọn cặp nhân tố tƣơng tác) đƣợc trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân tối ƣu đạt đƣợc trong khoảng 98,66-98,91 %, khi thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ 92,35 oC, nồng độ NaOH 10,38 % trong thời gian 7,25 giờ. 4. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể thiết lập đƣợc tƣơng quan tốt giữa hàm lƣợng axit cholic tự do chuyển hóa từ các axit liên hợp trong quá trình thủy phân với nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian thủy phân. Mô hình bề mặt đáp ứng đƣợc sử dụng để tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân mật bò bằng dung dịch NaOH. Hiệu quả thủy phân cao nhất đạt đƣợc ở các điều kiện nồng độ NaOH 10,38 %, nhiệt độ 92,35 oC và thời gian 7,25 giờ. Với các điều kiện đƣợc chọn, hàm lƣợng axit cholic tự do đƣợc chuyển hóa đạt đƣợc là cao nhất (98,66-98,91 %) sau phản ứng thủy phân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kandrac J., Kevresan S., Gu J.K., Mikov M., Fawcett J. P., Kuhakda K. Isolation and determination of bile acids, European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 31, 157-177 (2006). 2. Charlotte Murphy, Paolo Parini, Jin Wang, Ingemar Bjorkhem, Gosta Eggertsen Mát Gafvels. Cholic acid as key regulator of cholesterol synthesis, intestinal absorption and hepatoc storage in mice, Biochimica et Biophysica Acta, 1735, 167-175 (2005). 3. Prasad S. Dangate, Chetan L. Salunke, Krishnacharya G. Akamachi, Regioselective oxideation of cholic acid and its 7β epimer by using o-iodoxybenzoic acid, Steroids, 76, 1397-1399 (2011). 4. Malika Ibrahim-Ouali, Luc Rocheblave. First synthesis of thia steroids from cholic acid, Steroids, 75, 701-709 (2010). 5. Antonio Bonaldi, Chiuduno; Egidio Molinari, Longone al Serrino. Process for preparing high purity ursodeoxycholic acid, United States Patent No.4379093 (1983). 6. Ashok K. Batta, Suresht K. Aggarwal, Gerald Salen, Sarah Shefer. Selective reduction of oxo bile acids: synthesis of 3β-, 7β-, and 12β-hydroxy bile acid, Journal of Lipid Research, 32, 977-983 (1991). 7. Sifferd Robert H., Preparation of cholic acid, Patent CA 496445 (1953). 8. Trƣơng Phƣơng, Trần Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Thị Tuyết Trinh. Chiết xuất axit cholic từ mật động vật và bán tổng hợp axit chenodeoxycholic, Tạp chí Dƣợc học, 1, 11-13 (2004). 9. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi. Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong nghiên cứu hóa học, Nxb. Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội (2007). 10. Jenkins G. J., Hardie L. Bile Acid: Toxicology and Bioactivity, RSC, ISBN: 978-0-85404-846-5 (2009). Liên hệ: Phan Thanh Thảo Viện Công nghệ Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh E-mail: phanthao60@gmail.com; Điện thoại: 0903884577.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf9749_36335_1_sm_868_2085663.pdf
Tài liệu liên quan