Tổng hợp 2-Methylisothiazol-3(2H)-on và 5-cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 41 TỔNG HỢP 2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ON VÀ 5-CLORO-2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ON Trương Ngọc Tuyền*, Nguyễn Ngọc Vinh**, Lê Nguyễn Bảo Khánh*, Phạm Ngọc Tuấn Anh*, Nguyễn Thị Hương Giang*, Nguyễn Ngọc Anh Đào*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Chất bảo quản dùng trong mỹ phẩm 2-methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) và 5-cloro-2- methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) có thể gây phản ứng có hại trên da nếu vượt quá nồng độ cho phép nhưng hiện nay trong nước chưa tự sản xuất được các chất đối chiếu này để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm. Mục tiêu: Tổng hợp MIT và MCT ở quy mô phòng thí nghiệm đạt độ tinh khiết phù hợp để thiết lập chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm mỹ phẩm. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Hợp chất dị vòng MIT và MCT được tổng hợp từ nguyên liệu đầu acid 3-mercaptopropionic thông qua các phản ứng oxy hóa, amid hóa, đóng vòng và clor hóa. Sản phẩm tổng hợp được tinh chế bằng sắc ký cột, xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR, xác định độ tinh khiết bằng HPLC-PDA. Kết quả: Sản phẩm tổng hợp được chứng minh cấu trúc, độ tinh khiết đạt 100%. Kết luận: Đã tổng hợp thành công MIT, MCT có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu. Từ khóa: 2-methylisothiazol-3(2H)-on, 5-cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on, methylisothiazolon, cloro methylisothiazolon, chất bảo quản, mỹ phẩm ABSTRACT SYNTHESIS OF 2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ONE AND 5-CHLORO-2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ONE Truong Ngoc Tuyen, Nguyen Ngoc Vinh, Le Nguyen Bao Khanh, Pham Ngoc Tuan Anh, Nguyen Thi Huong Giang, Nguyen Ngoc Anh Dao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 41 - 45 Background: Cosmetic preservatives 2-methylisothiazol-3(2H)-one (MIT) and 5-chloro-2-methylisothiazol- 3(2H)-one (MCT) can cause harmful skin reactions if their concentrations are beyond the permissible limit. However, at present, reference standards that used for cosmetic quality control have not been domestically produced yet. Objectives: Synthesis of MIT and MCT at a laboratory scale to obtain substances with suitable purity to establish references used in cosmetic testing. Method: Heterocyclic MIT, MCT compounds are synthesized from 3-mercaptopropionic acid through oxidation, amidation, ring closure and chlorination reactions. The synthesized products are purified by column chromatography, identified structure by IR, MS, 1H-NMR and 13C-NMR spectra, determined purity by HPLC-PDA. Results: The products are proved that they have desired structure and purity of 100%. Conclusion: Successfully synthesized MIT, MCT with high purity that meet requirements for establishment *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh ***Khoa Y Dược, Trường Đại học Trà Vinh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền ĐT: 0903330604 Email: truongtuyen@ump.edu.vn Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 42 of reference standards. Keywords: 2-methylisothiazol-3(2H)-one, 5-chloro-2-methylisothiazol-3(2H)-one, methylisothiazolone, chloro methylisothiazolone, preservatives, cosmetics ĐẶT VẤN ĐỀ Hợp chất 2-Methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) và 5-cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) là chất bảo quản thường được dùng trong nhiều loại mỹ phẩm như dầu gội, sữa tắm, kem chống nắng do phổ kháng khuẩn, kháng nấm rộng, ít tương kỵ. Tuy nhiên hai chất này có thể gây ra nhiều phản ứng có hại như viêm da, dị ứng(1). Hội đồng mỹ phẩm ASEAN và Cục Quản lý Dược Việt Nam quy định hỗn hợp MIT, MCT tỉ lệ 1 : 3 chỉ được sử dụng trong các sản phẩm rửa sạch với nồng độ tối đa 15 ppm, MIT riêng lẻ tối đa 100 ppm, hỗn hợp MIT, MCT tỉ lệ 1 : 3 phối hợp thêm với MIT thì không được phép sử dụng(2). Để thực hiện công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm, việc sử dụng các chất đối chiếu là rất cần thiết. Tuy nhiên, hiện nay cả hai chất này đều chưa có mặt trong danh mục chất đối chiếu được cung cấp bởi các Viện Kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam. Do đó, nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu tổng hợp MIT, MCT quy mô phòng thí nghiệm đạt độ tinh khiết phù hợp để thiết lập chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm mỹ phẩm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và thiết bị Acid 3-mercaptopropionic, thionyl clorid, sulfuryl clorid từ Mỹ; methylamin từ Ấn Độ; methanol dùng cho HPLC từ Đức; các hóa chất khác bao gồm iod, kali iodid, natri hydroxyd, natri bicarbonat, dicloromethan, ethyl acetat, methanol, ethanol có nguồn gốc từ Trung Quốc được dùng trực tiếp không qua tinh chế. Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp- Sanyo, máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR Bruker Avance III 500 MHz, máy đo khối phổ LC-MS Shimadzu, máy đo phổ IR Affinity-1S Shimadzu, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao LC solution Shimadzu. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tổng hợp MIT và MCT được tổng hợp qua 3 giai đoạn theo sơ đồ 1(3, 4). Các sản phẩm được đo nhiệt độ nóng chảy và chứng minh cấu trúc bằng phổ: IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR (Hình 1). Giai đoạn 1 Oxy hóa acid 3-mercaptopropionic tạo acid 3,3’-dithiodipropionic. Giai đoạn 2 Amid hóa tạo dẫn chất N,N’-dimethyl-3,3’- dithiodipropionamid. Giai đoạn 3 Đóng vòng và clor hóa tạo sản phẩm MIT và MCT Phương pháp xác định độ tinh khiết và hàm lượng Độ tinh khiết và hàm lượng của MIT và MCT được sơ bộ xác định bằng phương pháp HPLC. Điều kiện tiến hành: cột pha đảo Phenomenex C8 4,6 × 250 mm, pha tĩnh 5 µm, thể tích tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dòng 1 mL/ phút, chạy đẳng dòng trong 30 phút, hệ dung môi pha động cho MIT là methanol-nước (5:95), cho MCT là methanol-nước (30:70), detector PDA, bước sóng phát hiện 210 nm và 274 nm(5). Hình 1. Quy trình tổng hợp MIT và MCT Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 43 KẾT QUẢ Tổng hợp acid 3,3’-dithiodipropionic (1) Cho từ từ iod (2,55 g; 10 mmol) vào erlen chứa sẵn hỗn hợp gồm acid 3-mercaptopropionic (2,12 g; 20 mmol), natri hydroxyd (0,8 g; 20 mmol) và kali iodid (0,1 g; 0,6 mmol) trong 50 mL methanol, khuấy đều ở nhiệt độ phòng. Sau 15 phút, natri thiosulfat được thêm vào để làm mất màu dung dịch. Cô cạn dưới áp suất thấp, lọc, rửa với nước cất lạnh và kết tinh lại trong ethanol 50% thu được 1,83 g sản phẩm. Hiệu suất 87%. Acid 3,3’-dithiodipropionic (1) là tinh thể trắng dạng vẩy; tan trong nước; dễ tan trong methanol, ethanol; khó tan trong cloroform, ethyl acetat. Nhiệt độ nóng chảy: 155 oC. Rf = 0,47 (n- hexan-ethyl acetat, 1:1); 0,75 (ethyl acetat-ethanol, 4:1); 0,83 (cloroform-ethanol, 9:1). Phổ IR (cm-1): 2928 (νO-H), 1689 (νC=O), 1236 (νC-O). Phổ MS (m/z) C6H10O4S2 [M–H]– dự kiến: 208,9942; [M–H]– tìm thấy: 208,9899. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 2,95 (2H, t, J = 7 Hz, S-CH2); 2,73 (2H, t, J = 7 Hz, CH2). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 175,3 (C=O); 49,0 (CO-CH2); 34,7 (S-CH2). Tổng hợp N,N’-dimethyl-3,3’- dithiodipropionamid (2) Cho sản phẩm (1) (2,1 g; 10 mmol) vào bình cầu hai cổ có chứa SOCl2 (7 mL, 96 mmol), khuấy đều ở 60 oC đến khi (1) tan hết tạo thành chất lỏng màu vàng cam. Để nguội và hòa tan trong 10 mL dicloromethan. Nhỏ từ từ dung dịch này vào bình cầu chứa methylamin 40% (8 mL, 93 mmol) được làm lạnh trong nước đá đồng thời khuấy mạnh. Sau 2 giờ khuấy ở nhiệt độ phòng, lớp dicloromethan được tách ra, làm khan với natri sulfat rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu sản phẩm rắn, kết tinh lại trong ethyl acetat được 1,38 g. Hiệu suất: 58,62%. N,N’-Dimethyl-3,3’-dithiodipropionamid là tinh thể hình kim màu trắng; dễ tan trong methanol, ethanol; khó tan ethyl acetat, n-hexan. Nhiệt độ nóng chảy: 105 oC. Rf = 0,23 (ethyl acetat-ethanol, 14:1); 0,50 (cloroform-ethanol, 9:1). Phổ IR (cm-1): 3314 (νNH), 1637 (νC=O), 1541 (δNH). Khối phổ MS C8H16N2O2S2; [M+Na]+ dự kiến: 259,0551; [M+Na]+ tìm thấy: 259,0504. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6,43 (1H, s, NH); 2,99 (2H, t, J = 7 Hz, S-CH2); 2,83 (3H, d, J = 5 Hz, CH3); 2,59 (2H, t, J = 7 Hz, CH2). Phổ 13C- NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,8 (C=O); 35,8 (CO-CH2); 34,4 (S-CH2); 26,4 (CH3). Tổng hợp 2-methylisothiazol-3(2H)-on và 5- cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on (3a, 3b) Phân tán sản phẩm (2) (2,36 g; 10 mmol) trong 10 mL dicloromethan, sau đó nhỏ từ từ vào bình cầu 2 cổ chứa sẵn dung dịch gồm sulfuryl clorid (2,43 mL; 30 mmol) và 10 mL dicloromethan được làm lạnh ở 0 oC. Sau khi nhỏ xong, khuấy tiếp ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng với pha động là ethyl acetat đến khi vết nguyên liệu biến mất thì dừng phản ứng. Tách lớp dầu bên dưới hòa tan trong nước và cho từ từ dung dịch natri bicarbonat bão hòa vào đến pH khoảng 7 để chuyển sản phẩm từ dạng muối HCl thành dạng base. Chiết với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10 mL sau đó làm khan với natri sulfat. Cô quay dưới áp suất giảm thu được hỗn hợp (3a) và (3b) dạng dầu màu vàng nhạt. Tiến hành sắc ký cột với silica gel 0,2-0,5 µm, pha động ethyl acetat- ethanol (15:1) để tách (3a) và (3b). Sau khi cô dung môi, (3b) xuất hiện ở dạng dầu nhầy nên tiến hành kết tinh lại trong n-hexan được tinh thể hình kim màu trắng. Tổng khối lượng sản phẩm thu được là 0,64 g. Hiệu suất chung đạt 45,12%. Sản phẩm (3a) là chất lỏng vàng nhạt; dễ tan trong nước, methanol, ethanol; khó tan trong cloroform, ethyl acetat, n-hexan. Rf = 0,28 (ethyl acetat); 0,42 (ethyl acetat-ethanol, 14 : 1); 0,60 (cloroform-ethanol, 9 : 1). (3b) là tinh thể trắng hình kim; dễ tan trong nước, methanol, ethanol; tan trong cloroform, ethyl acetat, khó tan trong n-hexan, nóng chảy ở 57 oC. Rf = 0,68 (ethyl acetat); 0,75 (ethyl acetat-ethanol, 14 : 1); 0,72 (cloroform-ethanol, 9 : 1). Dữ liệu phổ của hai chất này được thể hiện ở bảng 1, đối chiếu với dữ liệu tham khảo cho phép khẳng định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 44 Bảng 1. Thông tin cấu trúc sản phẩm MIT và MCT Sản phẩm tổng hợp Tài liệu tham khảo(6) Phổ IR (cm-1) MIT 3110 (ν=C-H), 2984 (νC-H), 1646 (νC=O), 1590 (νC=C), 1328 (νC-N). 1648 (νC=O). Khối phổ MS (C4H5NOS) [M+H]+ dự kiến: 116,0170; [M+H]+ tìm thấy: 116,0180. [M]: 115,1. Phổ 1H-NMR δ (ppm) 8,49 (1H, d, J = 6,5 Hz, S-CH=); 6,32 (1H, d, J = 6,5 Hz, CH=); 3,41 (3H, s, CH3) (a) 8,42 (1H, d, J = 6,1 Hz, S-CH=); 6,22 (1H, d, J = 6,1 Hz, CH=); 3,35 (3H, s, CH3) (a’) Phổ 13C-NMR δ (ppm) 168,5 (C=O); 141,9 (S-CH=); 113,5 (CH=); 29,6 (CH3) (b) 172,0 (C=O); 143,8 (S-CH=); 114,9 (CH=); 31,2 (CH3) (b’) Phổ IR (cm-1) MCT 3075 (ν=C-H), 1641 (νC=O), 1528 (νC=C), 1296 (νC-N). 1659 (νC=O) Khối phổ MS (C4H4ClNOS) [M+H]+ dự kiến: 149,9780; [M+H]+ tìm thấy: 149,9744 [M]: 151,0 (37Cl); 149,0 (35Cl) Phổ 1H-NMR δ (ppm) 6,44 (1 H, s, CH=); 3,35 (3H, s, CH3) (c) 6,20 (1H, s, CH=); 3,29 (3H, s, CH3) (c’) Phổ 13C-NMR δ (ppm) 168,8 (C=O); 147,6 (CCl); 113,9 (CH=); 30,5 (CH3) (d) 166,9 (C=O); 145,3 (CCl); 114,3 (CH=); 29,9 (CH3) (d’) (a) 500 MHz, D2O; (a’) 200 MHz, CD3OD; (b) 125 MHz, DMSO-d6; (b’) 50 MHz, CD3OD; (c) 500 MHz, D2O; (c’) 200 MHz, CDCl3; (d) 125 MHz, D2O ; (d’) 50 MHz, CDCl3 Xác định độ tinh khiết và hàm lượng 2-methylisothiazol-3(2H)-on, 5-cloro-2- methylisothiazol-3(2H)-on bằng phương pháp sắc ký lỏng Chuẩn bị mẫu thử Cân chính xác khoảng 10 mg MIT thêm vừa đủ 20 mL methanol, thực hiện tương tự với MCT. Điều kiện tiến hành Như phần phương pháp nghiên cứu. Khảo sát tính phù hợp hệ thống Tiêm 6 lần mẫu thử MIT và MCT. Hệ thống sắc ký đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống để phân tích mẫu MIT và MCT (Bảng 2). Xác định độ tinh khiết và hàm lượng của mẫu thử Sắc ký đồ cho thấy hai sản phẩm có độ tinh khiết cao. Với MIT, kể cả khi quan sát ở bước sóng thấp 210 nm cũng chỉ thấy một đỉnh tạp rất nhỏ, chiếm tỉ lệ không đáng kể (Hình 2). Còn sản phẩm MCT chỉ có một pic duy nhất trên sắc ký đồ khi quan sát ở cả hai bước sóng (Hình 3). Dựa theo phần trăm diện tích pic, có thể kết luận độ tinh khiết sắc ký của hai sản phẩm đạt 100%. Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC Tên chất Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối 0,8 ≤ AS ≤ 1,5 Diện tích (µV × giây) RSD ≤ 2% Số đĩa lý thuyết N ≥ 2000 MIT 10,7 (RSD = 0,2%) 1,4 6798502 (RSD = 0,1%) 5264 MCT 9,6 (RSD = 0,07%) 1,5 10741092 (RSD = 0,2%) 11627 Hình 2. Sắc ký đồ của MIT (I) bước sóng 210 nm; (II) bước sóng 274 nm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 45 Hình 3. Sắc ký đồ của MCT (III) bước sóng 210 nm; (IV) bước sóng 274 nm KẾT LUẬN Từ nguyên liệu đầu là acid 3- mercaptopropionic và các tác nhân phản ứng đơn giản, đã tổng hợp thành công 2- methylisothiazol-3(2H)-on và 5-cloro-2- methylisothiazol-3(2H)-on quy mô phòng thí nghiệm qua các giai đoạn oxy hóa, amid hóa, đóng vòng và clor hóa. Hai sản phẩm đạt độ tinh khiết sắc ký 100% khi kiểm tra bằng phương pháp HPLC, cột pha đảo Phenomenex C8, đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 210 và 274 nm. Độ tinh khiết của sản phẩm thu được phù hợp với tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm mỹ phẩm. Với các kết quả nghiên cứu bước đầu, có thể tiếp tục khảo sát để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng nhằm nâng cao hiệu suất của quy trình tổng hợp và tiến hành thiết lập chất đối chiếu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Taubert K, Kraus S, Schulze B (2002). Isothiazol-3(2H)-ones, part I: synthesis, reaction and biological activity. Journal of Sulfur Reports, 23(1):79-121. 2. Cục Quản lý Dược (2018). Biên bản cuộc họp ACSB 27, ACC 27 và phụ lục Hiệp định mỹ phẩm ASEAN thống nhất sau cuộc họp ACC 27. URL: https://dav.gov.vn/bien-ban-cuoc- hop-acsb-27-acc-27-va-phu-luc-hiep-dinh-my-pham-asean- thong-nhat-sau-cuoc-hop-acc-27--n779.html (access on 24/05/2020). 3. Easton J (1985). Syntheses of β-Lactams by ring contraction ofisothiazolidinones. Journal of the Chemical Society, I: 153 – 157. 4. Kim JM, Kim JS (2002). Process for preparation of 3- isothiazolone mixture and composition comprising the mixture. US Patents 6376680B1. 5. Viện Le Hoa, Vo Hung, Do Trang, Thai Thu, Dinh Le (2019). Development and validation of an HPLC method for simultaneous assay of MCI and MI in shampoos containing plant extracts. International Journal of Analytical Chemistry, 2019(6):1-10.. 6. Sanchez R (2003). Studies of chemical selectivity of hapten, reactivity, and skin sensitization potency. Synthesis and studies on the reactivity toward model nucleophiles of the 13C-labeled skin sensitizers, 5-chloro-2-methylisothiazol- 3-one and 2-methylisothiazol-3-one. Chem Res Toxicol, 16(5):627-636. Ngày nhận bài báo: 04/02/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/04/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020