Tổng hợp phức chất rutheni(II) polypyridyl ứng dụng làm đầu dò huỳnh quang phát hiện một số phân tử sinh học - Hoàng Thị Thuận

112 Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 21, Số 2/2016 TỔNG HỢP PHỨC CHẤT RUTHENI(II) POLYPYRIDYL ỨNG DỤNG LÀM ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN MỘT SỐ PHÂN TỬ SINH HỌC Đến tòa soạn 28 - 2 - 2016 Hoàng Thị Thuận Khoa Dược, Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông Trần Quang Tùng, Nguyễn Xuân Trường Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội SUMMARY SYNTHESIS OF THE RUTHENIUM(II) POLYPYRIDYL COMPLEX USED AS THE FLUORESCENT PROBE FOR DETECTION OF BIOMOLECULES Ruthenium(II) polypyridyl complex, [Ru(dpq)2(bxbg)]Cl2 where dpq is dipyrido[3,2- d:2',3'-f]quinoxaline and bxbg is bis(o-xylene)bipyridine glycoluril, is synthesized. Intermediates and the final product are confirmed by their melting-point measurements and 1H-NMR characterizations. Molecular spectral of the complex are recorded with UV-Vis and time-resolved fluorescent spectroscopy. It shows that [Ru(dpq)2(bxbg)]Cl2 complex has a basic electronic transition (MLCT) at max = 457 nm, fluorescent lifetime  = 590 ns and Stokes’s shift  = 163 nm. All analyzed photophysical properties reveal the synthesized complex is an appropriate design used as the fluorescent probe for detection of biomolecules. 1. MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, phức chất rutheni(II) polypyridyl nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học bởi vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực quang hóa học[1,2], xúc tác quang hóa[3], pin mặt trời hữu cơ[4] và dùng làm đầu dò huỳnh quang phát hiện một số phân tử sinh học[5-8]. Đặc biệt, phức chất rutheni(II) polypryridyl cho cường độ tín hiệu huỳnh quang lớn, thời gian phát xạ huỳnh quang “dài” và độ dịch chuyển Stokes lớn nên chúng được xem là lựa chọn tối ưu để thiết kế làm đầu dò 113 quang học phát hiện phân tử sinh học: amino axit, peptit, protein và AND[9,10]. Phức tris(bipyridyl)rutheni(II) chloride – Ru(bpy)3Cl2 từ lâu được xem là “chất chuẩn” để so sánh với các loại phức rutheni(II) polypyridyl. Ion kim loại chuyển tiếp trung tâm Ru2+ có cấu hình electron d6 ở trạng thái spin thấp tạo thành phức bát diện với ba phối tử 2,2’-bipyridyl (bpy). Phối tử bpy vừa có khả năng cho electron (-donor) do có cặp electron tự do ở nguyên tử N, vừa có khả năng nhận electron (-acceptor) do orbital  không định vị ở vòng thơm. Orbital phản liên kết * của bpy có mức năng lượng thấp hơn orbital phản liên kết * của Ru2+, nên ở trạng thái cơ bản phức Ru(bpy)3Cl2 rất dễ hấp thụ năng lượng để chuyển lên trạng thái kích thích do bước chuyển dời điện tử kim loại-phối tử. Do đó phức chất của rutheni(II) có khả năng phát xạ huỳnh quang với hiệu suất lượng tử huỳnh quang lớn. Mặt khác, phụ thuộc vào bản chất và cấu hình điện tử của phối tử, tính chất quang hóa & quang lý của phức chất rutheni(II) polypyridyl sẽ khác nhau. Người ta chia phức chất ruteni(II) polypyridyl thành hai loại phụ thuộc vào khả năng cho/nhận electron của phối tử sử dụng so với bpy. Loại A là phức chứa phối tử với -donor yếu nhưng -acceptor mạnh hơn bpy, chẳng hạn như 2,2’- bipyrazine; 2,2’-bipyrimidine; và 2,2’- biquinoline. Ngược lại, loại B là phức chứa phối tử với -donor mạnh nhưng - acceptor yếu hơn bpy, chẳng hạn như 2- (pyridin-2-yl)-imidazole; 3-(pyridin-2-yl)- pyrazole; và 3-(pyridin-2-yl)-l,2,4-triazole. Phức rutheni(II) polypyridyl với phối tử loại A có khả năng tương tác chọn lọc với một số phân tử sinh học như amino axit, peptit, protein và ADN thông qua phản ứng cho nhận electron. Hơn nữa, bằng cách mang những nhóm chức hoạt tính phụ trợ lên phối tử, phức rutheni(II) polypyridyl được thiết kế như những chiếc “kẹp” gắn kết ở cấp độ phân tử cho một số phân tử sinh học[11]. Như vậy với mục đích thiết kế phức ruteni(II) polypyridyl ứng dụng làm đầu dò huỳnh quang cho một số phân tử sinh học và tham khảo tài liệu hiện có, trong bài báo này chúng tôi nghiên cứu đưa ra quy trình tổng hợp phức rutheni(II) polypyridyl với phối tử loại A gồm dipyrido[3,2-d:2,3-f]quinoxaline (dpq) và bis(oxylene)bipyridineglycoluril (bxbg) (phức bis(heteroleptic)). Đặc điểm của các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng được nghiên cứu, chứng minh bằng phương pháp đo điểm chảy và các phương pháp phân tích phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phổ huỳnh quang phân tử. 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là tinh khiết của hãng Sigma-Aldrich gồm: 1- 10-Phenanthroline, KBr, HNO3 65%, H2SO4 98%, NaOH, CHCl3, MgSO4, ethanol, ethylene diamine, methanol, urea, toluen, trifluoroacetic acid, diethyl ether, RuCl3.xH2O, LiCl, DMF, acetone, DMSO, KOH, 1,2-bis(bromomethyl)benzene, NaCl bão hòa, ethylene glycol. 2.2. Dụng cụ và thiết bị Các loại cốc thủy tinh, bình nón, sinh hàn, bình cầu (1, 2 và 3 cổ), nhiệt kế, 114 bếp điện, bình khí Ar, máy hút chân không, máy cô quay chân không, tủ sấy. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của các sản phẩm được ghi trong môi DMSO-d6 trên máy JEOL 400MHz tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và máy BRUKER 500MHz tại Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam. Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis ghi trên máy Agilent 8453 và phổ huỳnh quang phân tử ghi trên hệ thiết bị huỳnh quang phân giải thời gian tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. 2.3. Sơ đồ tổng hợp phức chất Rutheni(II) polypyridyl Hình 1: Sơ đồ tổng hợp phức chất Rutheni(II) polypyridyl - [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 115 2.4. Cách tiến hành tổng hợp Giai đoạn (1), tổng hợp 1,10- Phenanthroline-5,6-dione[12]: Cho 1,10-phenanthroline (2.5792g, 14.3mmol) và KBr (2.5348g, 21.3mmol) vào bình 3 cổ có gắn sinh hàn đun hồi lưu. Nhỏ từ từ hỗn hợp axit (25ml HNO3 65% và 25ml H2SO4 98%) đã được làm lạnh vào bình 3 cổ. Đun hỗn hợp ở nhiệt độ 110°C trong 6h. Hỗn hợp được làm lạnh bằng nước đá sau đó được trung hòa bởi NaOH đến pH = 5. Chiết lấy sản phẩm bằng CHCl3, sau đó làm khô bằng MgSO4. Làm bay hơi dung môi ta thu được sản phẩm hữu cơ. Sản phẩm hữu cơ sau đó được kết tinh lại trong ethanol. Giai đoạn (2), tổng hợp bipyridine- glycoluril (bpg)[13]: Hỗn hợp 1,10-phenanthroline-5,6-dione (0.4378g, 2.1mmol) và urea (0.2534g, 4.2mmol) được cho vào bình 3 cổ chứa 10ml toluen. Thêm tiếp 0,7ml CF3COOH rồi khuấy đều và đun sôi hỗn hợp 16h trong khí quyển Ar. Sau khi làm nguội, chất rắn màu nâu được lọc ra và đun sôi với 10ml ethanol trong vòng 1h. Sau khi làm lạnh, kết tủa được lọc, rửa bằng ethanol (25ml) và diethyl ether (25ml), sau đó sấy khô chân không. Giai đoạn (3), tổng hợp phối tử bis(oxylene)bipyridineglycoluril (bxbg)[13]: Sục khí Ar vào 10ml DMSO trong bình 3 cổ trong vòng 30 phút, thêm tiếp KOH (300mg, 5.3mmol) rắn và khuấy đều trong vòng 30 phút, thêm tiếp bpg (300mg, 1mmol) và 1,2- bis(bromomethyl) benzene (540mg, 2mmol) đồng thời giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 15°C. Hỗn hợp được khuấy đều trong vòng 16h ở nhiệt độ phòng. Rót hỗn hợp vào 150ml NaCl bão hòa, sau đó chiết với CH2Cl2 (2x200ml), phần hữu cơ sau đó được rửa bằng dung dịch NaCl bão hòa (150ml), nước (150ml) và làm khô bằng MgSO4 khan. Làm bay hơi dung môi rồi kết tinh sản phẩm trong methanol. Giai đoạn (4), tổng hợp phối tử dipyrido[3,2-d:2,3-f]quinoxaline (dpq)[14]: Cho 1,10-phenanthroline-5,6-dione (0.5050g, 2.4mmol) và ethylene diamine (0.2325g, 3.9mmol) vào bình 3 cổ chứa ethanol (175ml). Đun hỗn hợp trong vòng 2h ở 50°C. Làm bay hơi dung môi thu được sản phẩm để qua đêm. Sản phẩm dpq tinh khiết được kết tinh từ hỗn hợp methanol/nước (tỉ lệ 1:9), sau đó kết tinh lại bằng methanol. Giai đoạn (5), tổng hợp tiền phức chất Ru(dpq)2Cl2[11]: Cho RuCl3.xH2O (0.1761g) và LiCl (0.2015g) vào bình 3 cổ chứa DMF (10ml). Hỗn hợp phản ứng được đun nóng trong vòng 20 phút ở 80°C trong khí quyển Ar. Thêm tiếp phối tử dpq (0.3248g) rồi đun tiếp hỗn hợp trong vòng 14h. Làm lạnh hỗn hợp tới nhiệt độ phòng, sau đó rót vào bình đựng acetone (50ml) giữ ở -4°C qua đêm. Kết tủa được lọc và rửa bằng acetone (20ml) và nước cất đến khi nước lọc trở nên không màu, thu được sản phẩm có màu đen tím đem sấy khô. 116 Giai đoạn (6), tổng hợp phức chất [Ru(dpq)2bxbg]Cl2[11]: Cho Ru(dpq)2Cl2 (0.1464g) và phối tử bxbg (0.1083g) vào bình 3 cổ chứa ethylene glycol (50ml). Hỗn hợp được đun sôi trong vòng 8h, khi đó dung dịch chuyển từ màu đen sang đỏ thẫm. Lọc nóng hỗn hợp sau phản ứng, phần nước lọc được làm nguội đến nhiệt độ phòng. Làm bay hơi dung môi thu được chất rắn màu đỏ. Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột (alumina, acetone/methanol theo tỉ lệ 1:1). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm vật lý của các chất đã tổng hợp Bảng 1: Đặc điểm vật lý của các chất đã tổng hợp Hợp chất Dạng bề ngoài Khối lượng sản phẩm (mg) Hiệu suất % Nhiệt độ nóng chảy (Mp – 0C) 1,10-Phenanthroline-5,6-dione Chất rắn màu vàng 20669 70 271 Bipyridine glycoluril (bpg) Chất rắn màu vàng 320,6 60 > 400 Bis(oxylene)bipyridine glycoluril (bxbg) Chất rắn màu vàng 108,3 31 354 Dipyrido[3,2-d:2,3- f]quinoxaline (dpq) Chất rắn màu kem 429,5 70 331 Ru(dpq)2Cl2 Chất rắn màu đen tím 292,5 62 - [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 Chất rắn màu đỏ đô 90,25 55% - 3.3. Đặc điểm phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR của các chất đã tổng hợp được Bảng 2: Độ chuyển dịch hóa học (δ - ppm) của phối tử dipyrido[3,2-d:2,3- f]quinoxaline (dpq) và tiền phức chất Ru(dpq)2Cl2 Chất 1H - NMR dipyrido[3,2-d:2,3- f]quinoxaline (dpq – sp2 ) Ru(dpq)2Cl2 – sp 4 H1, H1’ 9.45 ÷ 9,41 9.48 ÷ 9.47 H3, H3’ 9.22 ÷ 9.19 9.23 H4, H4’ 9.14 9.19 H2, H2’ 7.94 ÷ 7.90 7.97 117 Phân tích phổ cộng hưởng từ proton của dipyrido[3,2-d:2,3-f]quinoxaline (dpq) và phức chất Ru(dpq)2Cl2: Trên phổ 1H-NMR của dpq xuất hiện tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học δ = 9.45 ÷ 9.41 ppm tách thành 2 nhóm 2 vạch (dạng doublet doublet – dd) với hằng số tương tác J = 1.8 Hz và J = 7.8 Hz được quy kết cho proton H1 và H1’. Proton H3 và H3’ có tín hiệu ứng với δ = 9.22 ÷ 9.19 ppm (dd) với J = 1.8 Hz và J = 4.6 Hz. Tín hiệu phổ một vạch (dạng singlet) cường độ lớn với δ = 9.14 ppm được quy kết cho proton H4 và H4’. Tín hiệu xuất hiện tại δ = 7.94 ÷ 7.90 ppm dạng dd với J = 7.8 Hz và J = 4.6 Hz được quy kết cho proton H2 và H2’. Phổ 1H-NMR của phức tạo thành giữa ruteni(II) và phối tử dpq (Ru(dpq)2Cl2) có các tín hiệu đặc trưng với độ chuyển dịch hóa học giống như của phối tử dpq (Bảng 2). Bảng 3: Độ chuyển dịch hóa học (δ - ppm) của bipyridine glycoluril (bpg) và phối tử bis(oxylene)bipyridine glycoluril (bxbg) Chất 1 2 3 1' 2' 3' 1H - NMR bipyridine glycoluril (bpg – sp3) Bis(oxylene)bipyridineglycoluril (bxbg – sp5) H1, H1’ 8.70 ÷ 8.67 8.90 H3, H3’ 8.04 ÷ 8.02 8.75 H2, H2’ 7.53 ÷ 7.48 7.55 H(N) 8.27 - Ha - 7.35 Hb - 7.20 H(NCH2Ar) - 5.07; 4.96; 4.70; 4.52 118 Phân tích phổ cộng hưởng từ proton của bipyridine glycoluril (bpg) và phối tử bis(oxylene)bipyridine glycoluril (bxbg): Trên phổ 1H-NMR của bpg xuất hiện tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học δ = 8.70 ÷ 8.67 ppm dạng dd với hằng số tương tác J = 1.8 Hz và J = 4.6 Hz được quy kết cho proton H1 và H1’. Tín hiệu phổ một vạch cường độ lớn với δ = 8.27 ppm được quy kết cho proton liên kết với N. Proton H3 và H3’ có tín hiệu ứng với δ = 8.04 ÷ 8.02 ppm (d) với J = 7.8 Hz. Tín hiệu xuất hiện tại δ = 7.53 ÷ 7.48 ppm dạng dd với J = 4.6 Hz và J = 7.8 Hz được quy kết cho proton H2 và H2’. Phổ 1H-NMR của phối tử bxbg cũng xuất hiện những tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học tương tự cho các proton H1&H1’, H2&H2’, H3&H3’ (Bảng 3). Mặt khác, trên phổ 1H-NMR của bxbg không còn thấy xuất hiện tín hiệu tại δ  8.27 ppm, điều này phù hợp do không còn proton liên kết với N. Bên cạnh đó, tín hiệu dạng phổ chân rộng (broad-br) xuất hiện tại δ = 7.35 ppm được quy kết cho proton Ha. Proton Hb có tín hiệu ứng với δ = 7.20 ppm (br). Ngoài ra, các tín hiệu xuất hiện tại δ = 5.07 (br); 4.96 (d); 4.70 (d); 4.52 (d) ppm với J  16 Hz được quy kết cho các proton của nhóm –CH2 liên kết với vòng thơm và N. Bảng 4: Độ chuyển dịch hóa học (δ - ppm) của phức chất [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 1H-NMR Phức chất [Ru(dpq)2bxbg]2+ sp6 H1 9.54 (d) Ha 8.31 (d) H4 9.39 (br) Hc 7.92 (br) H3 8.31 (d) Hb 7.86 (br) H2 7.92 (br) Hd 7.27 (br) He 7.20 (br) H(NCH2Ar) 4.61 (d); 4.01 (s) Phổ 1H-NMR của phức tạo thành giữa ruteni(II) với hai phối tử dpq và bxbg ([Ru(dpq)2bxbg]Cl2) có các đặc trưng phổ (Bảng 4) là sự kết hợp của phối tử dpq (Bảng 2) và bxbg (Bảng 3). Tuy nhiên phổ phức tạp và có sự giảm độ chuyển dịch hóa học của hầu hết các proton do sự tạo thành liên kết giữa kim loại-phối tử. 3.4. Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của phức Ru(dpq)2Cl2 và[Ru(dpq)2bxbg]Cl2 Phổ hấp thụ phân tử của phức Ru(dpq)2Cl2 và [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 đượcchỉ ra ở Hình 2. Bước chuyển dời điện tử -* của phối tử dpq và bxbg tại bước sóng  = 258 nm. Bước chuyển dời điện tử đặc trưng kim loại-phối tử (MLCT) của phức chất quan sát thấy tại 119  = 457 nm với [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 nhưng không rõ ràng với Ru(dpq)2Cl2. 100 200 300 400 500 600 700 800 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Ru(dpq)2Cl2 A bs or ba nc e wavelength / nm [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 Hình 2: Phổ hấp thụ phân tử của phức Ru(dpq)2Cl2 và [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 trong nước 3.5. Phổ huỳnh quang phân tử của phức chất [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 Phổ phát xạ huỳnh quang phân giải thời gian của [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 được chỉ ra ở Hình 3. Phức chất có thời gian phát xạ huỳnh quang (lifetime) là tương đối “dài”,  = 590 ns và độ dịch chuyển Stokes lớn,  = 163 nm. Phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 tổng hợp được phù hợp cho ứng dụng làm đầu dò huỳnh quang. 2.0x10-6 4.0x10-6 6.0x10-6 8.0x10-6 1.0x10-5 0.000 0.002 0.004 In te ns ity / V Time / s Hình 3: Phổ huỳnh quang phân tử của phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 trong nước. ex = 460 nm; obs = 620 nm. 4. KẾT LUẬN Thực hiện quy trình gồm 6 giai đoạn tổng hợp thành công phức chất [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 nhằm ứng dụng cho nghiên cứu làm đầu dò huỳnh quang phát hiện một số phân tử sinh học. Đặc điểm của các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng được nghiên cứu, chứng minh dựa trên nhiệt độ nóng chảy, đặc trưng phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR và phổ hấp thụ phân tử UV-Vis. Phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 có bước chuyển dời điện tử kim loại-phối tử (MLCT) tại max = 457 nm, thời gian phát xạ huỳnh quang  = 590 ns và độ dịch chuyển Stokes  = 163 nm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Zhang, M.-T. and L. Hammarström (2011), J. Am. Chem. Soc., 133, p. 8806–8809. [2] Zhang, M.-T., et al. (2011), J. Am. Chem. Soc. , 133, p. 13224–13227. [3] Lei, P., et al. (2008), J. Am. Chem. Soc.,130, p. 26-27. [4] Freys, J.C., et al. (2012), Dalton Trans., 41, p. 13105-13111. [5] Lo, K.K.-W., A.W.-T. Choi, and W.H.-T. Law (2012), Dalton Trans., 41, p. 6021-6047. [6] Ryan, E., Thesis 1991, Dublin City University: Dublin. [7] Friedman, A.E., et al. (1990), J. Am. Chem. Soc. , 112, p. 4960-4962. (xem tiếp trang 126)