Tổng hợp Polymer đóng dấu phân tử cafein - Định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 204 TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN - ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CHỌN LỌC Nguyễn Như Quỳnh*, Phan Văn Hồ Nam* TÓM TẮT Mở đầu: Polymer đóng dấu phân tử như một thụ thể nhân tạo, có tính chọn lọc cao, rất hiệu quả trong việc tách và phân tích các mẫu phức tạp, như dịch sinh học hoặc môi trường. Nhằm góp phần nhân rộng kỹ thuật đóng dấu phân tử tại Việt Nam, đề t|i “Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein để định hướng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc” được thực hiện, với đối tượng cafein, một alkaloid với nhiều tác dụng sinh học, được chọn là phân tử mẫu. Mục tiêu: Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-MIP) có cỡ hạt nano có khả năng lưu giữ thuận nghịch cafein. Đối tượng Cafein-MIP có khả năng hấp phụ thuận nghịch cafein. Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp cafein-MIP bằng phương ph{p kết tủa trong dung môi. Khảo sát khả năng rửa giải và tái hấp phụ cafein của polymer bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis và HPLC. Kết quả: Cafein-MIP dạng hạt được tổng hợp có kích thước khoảng 500 nm, hình cầu, tương đối đồng đều. Khảo sát các tỷ lệ khác nhau giữa acid methacrylic và 4-vinyl pyridine cho thấy khả năng đóng dấu cafein tăng khi tăng h|m lượng 4-vinyl pyridine trong công thức, tuy nhiên nồng độ acid cao lại làm giảm hiệu quả đóng dấu. Với tỷ lệ 1:1, hiệu quả đóng dấu của cafein-MIP gấp 6,8 lần so với polymer không đóng dấu (NIP). Kết luận: Đề tài lần đầu tiên tổng hợp được cafein-MIP với cỡ hạt bằng nano có khả năng lưu giữ thuận nghịch cafein với hiệu quả đóng dấu phân tử cao. Từ khóa: Polymer đóng dấu phân tử cafein, chiết pha rắn chọn lọc ABSTRACT SYNTHESIS OF CAFFEINE-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION Nguyen Nhu Quynh, Phan Van Ho Nam * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 204 - 209 Introduction: Molecularly imprinted polymer is considered as artificial receptors with high selectivity and affinity, that could be used for analyse of sophisticated samples such as biological fluid and environmental ones. To expand the application of this novel method in Vietnam, the study "Synthesis of caffeine-imprinted polymer, directed as the sorbent for selective solid phase extraction" was conducted in which caffeine, an alkaloid having many biological activities, was selected as a template for polymerization reaction. Objectives: Investigating the synthesis of caffeine-imprinted polymer (cafeine-MIP) particles in nano size that is able to retain caffeine reversibly. *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 205 Subjects: cafeine-MIP with ability of reversible caffeine absorption. Study methods: Synthesis of polymer particles based on precipitation method. Study on convertible holding capacity of caffeine-MIP by using UV-Vis and HPLC methods. Results: The spherical caffeine-MIP particles with approximately 500 nm size and relatively uniform was successfully synthesized. Surveying the various ratios between methacrylic acid and 4-vinyl pyridine showed that the imprinted efficiency was increased by rising the concentration of 4-vinyl pyridine in the formula, and was reduced by high acid content. In case of 1:1 rate, caffeine-MIP can hold caffeine than 6.8 times the NIP (non-imprinted polymer). Conclusions: The caffeine-MIP particles in nano size with reversibly and high imprinted efficiency was first time synthesized. Keywords: Caffeine-imprinted polymer, selective solid-phase extraction ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1930, những nghiên cứu đầu tiên về kĩ thuật đóng dấu phân tử đƣợc công bố(3). Từ đó đến nay, kĩ thuật này ngày càng phát triển mạnh mẽ và chứng minh tính ứng dụng cao của mình trong những ngành khoa học khác nhau. Polymer đóng dấu phân tử (MIP – Molecular Imprinting Polymer) đƣợc hình thành dựa trên kĩ thuật đóng dấu phân tử MIT (Molecular Imprinting Technology), trong đó một phức hợp đƣợc hình thành giữa mẫu (chất khảo sát – template) và monomer chức năng trong dung môi của phản ứng polymer. Cho mẫu, monomer, chất liên kết chéo (cross- linker), tác nhân mồi phản ứng vào ống nghiệm, sau phản ứng một mạng lƣới polymer không gian ba chiều đƣợc hình thành. Tiếp theo, mẫu đƣợc rửa giải khỏi polymer để lại những “lỗ hổng” với hình dạng, kích thƣớc và chức năng hóa học phù hợp với phân tử chất khảo sát. Kết quả, polymer nhận diện và gắn một cách có chọn lọc với mẫu(2,4,5). Chúng rất hữu ích cho việc phân tích các mẫu phức tạp nhƣ dịch sinh học và mẫu môi trƣờng. Ở Việt Nam, kỹ thuật này vẫn còn khá mới lạ. Bên cạnh đó, cafein l| một alkaloid phổ biến trong cuộc sống, ngƣời ta hầu nhƣ dễ dàng bắt gặp các chế phẩm có cafein trên thị trƣờng. Cafein có tác dụng g}y hƣng phấn thần kinh, lợi tiểu, giãn nở phế quản(1). Cafein đƣợc chọn làm phân tử mẫu trong nghiên cứu n|y để từ đó phát triển hơn kỹ thuật đóng dấu phân tử trong tƣơng lai. Chính vì vậy, đề t|i “Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định hƣớng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách cafein có tính chọn lọc cao” đƣợc thực hiện nhằm góp phần nhân rộng kỹ thuật này, giúp tiết kiệm thời gian, chi phí, công sức, không chỉ trong công tác kiểm nghiệm cafein m| còn trong c{c lĩnh vực khác. ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Cafein-MIP. Chất đối chiếu Cafein khan (số lô 394541AX20, xuất xứ Germany, h|m lƣợng 99,92%). Hóa chất – dung môi Dung môi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh khiết tùy mục đích sử dụng: Dung môi tổng hợp, rửa giải polymer, pha chế dung dịch: ethanol, methanol, acid acetic, cloroform, n- butanol, n-hexan, diethyl ether, xuất xứ Trung Quốc; Hóa chất tổng hợp polymer: acid metacrylic (MAA), 4-vinylpyridin (4-VP), ethylen glycol dimethylacrylate (EDMA), azobisisobutyronitril (AIBN) (Aldrich-sigma); Dung môi sắc ký lỏng: MeOH (J.T.Baker), acid acetic băng (Merck). Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 206 224D (Sartorius, Đức), m{y đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Probe 2550 (Shimadzu – Nhật) Phƣơng pháp nghiên cứu Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và polymer trắng (non-imprinted polymer - NIP) Pha các dung dịch Cafein mẹ nhƣ sau: DD C1: 5 mg /ml cafein trong aceton, DD C2: 5 mg/ml cafein trong acetonitril, DD C3: 5 mg/ml cafein trong cloroform. Thực hiện tổng hợp MIP theo các công thức kh{c nhau nhƣ Bảng 1. Cho các thành phần vào eppendorf, lắc rung hỗn hợp trên trong 10 gi}y. Sau đó cách thủy hỗn hợp ở 74 oC cho đến khi hỗn hợp hình thành trạng thái gel, ngay lập tức lắc rung hỗn hợp trong 30 giây. Với mỗi công thức MIP, thực hiện tổng hợp NIP song song để đối chiếu trong đó th|nh phần tổng hợp tƣơng ứng không có dung dịch cafein. Bảng 1: Công thức thành phần tổng hợp polymer Thành phần B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 DD C1 (µl) 200 - - - - - - - - - - DD C2 (µl) - 200 - 200 200 200 200 200 200 200 200 DD C3 (µl) - - 200 - - - - - - - - EDMA (mg) 160 160 160 140 120 140 150 150 150 160 160 MAA (mg) 14 14 14 35 50 35 30 20 10 40 40 4-VP(mg) - - - - - - 10 20 30 - - AIBN (µl) 35 35 35 35 35 40 35 35 35 35 35 Aceton (ml) 1 - - - - - - - - - - ACN (ml) - 1 - 1 1 1 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Cloroform (ml) - - 1 - - - - - - - - Acid acetic (µl) - - - - - - - - 20 - - NaOH 0,1N (µl) - - - - - - - - - 20 - Tạo hạt Sau khi tổng hợp polymer đến trạng thái gel, lấy 500 µl polymer dạng gel này cho vào ống nghiệm có nắp đậy. Thêm vào ống nghiệm 5 ml ethanol. Khuấy trong 4 giờ trên bếp từ. Sau đó đem ly t}m với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu lấy cắn. Kiểm tra sự lưu giữ cafein của cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis và HPLC (Sơ đồ 1) Hạt polymer (MIP hoặc NIP) sau khi tổng hợp theo công thức B7, B8, B9, B11 (Bảng 1) đƣợc rửa sạch cafein với dung môi thích hợp bằng cách cho vào ống nghiệm 5 ml dung môi rủa giải, đậy nắp ống nghiệm, lắc rung trong 2 phút, để lắng trong 1 phút v| đem ly t}m với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch thu đƣợc pha loãng thành 25 ml. Tiến h|nh đo quang để kiểm tra sự hiện diện của cafein. Quy trình đƣợc thực hiện với dung môi rửa giải methanol, thu đƣợc dung dịch A, dung môi rửa giải methanol – acid acetic (9:1) thu đƣợc dung dịch B. Sơ đồ 1: Quy trình kiểm tra sự lưu giữ cafein của cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis và HPLC Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 207 Tái hấp phụ cafein: cho 1ml dung dịch cafein pha trong ACN có nồng độ 1 mg/ml vào hạt polymer đã rửa sạch ở trên (MIP hoặc NIP). Lắc rung trong 2 phút, để ổn định 1 phút rồi đem ly t}m. Tiếp tục cho vào cắn trên 5 ml dung dịch methanol, lắc rung trong 2 phút, để ổn định 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Thực hiện 3 lần, gộp các dịch thu đƣợc pha loãng bằng methanol thành 25 ml (dung dịch C). Cho 4 ml dung dịch methanol- acid (9:1) cắn còn lại. Lắc rung trong 2 phút, để lắng 1 phút rồi đem ly t}m 5000 vòng/phút trong 10 phút. Lặp lại bƣớc trên 3 lần nữa. Sau đó, gộp các dịch thu đƣợc pha loãng với methanol-acid (9:1) thành 25 ml (dung dịch D). Lọc các dung dịch A, B, C, D thu đƣợc qua màng lọc 0,45 µm, tiến h|nh định lƣợng cafein bằng phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quy trình ph}n tích HPLC để x{c định nồng độ cafein trong dịch rửa giải sử dụng c{c điều kiện sắc ký là: Cột sắc kí CC 125/4 Nucleosil 100- 5C18 (125 × 4 mm, 5 µm); Pha động l| Nƣớc - methanol - acid acetic (69:28:3); Nhiệt độ cột là 45oC; Tốc độ dòng 1ml/phút; Thể tích tiêm mẫu 10 µl; Bƣớc sóng phát hiện 273 nm. Quy trình đã đƣợc kiểm tra tính tƣơng thích hệ thống và thẩm định đạt yêu cầu ph}n tích định lƣợng theo hƣớng dẫn của ICH. KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và polymer trắng (non-imprinted polymer - NIP) Quan sát cảm quan hạt MIP/NIP thu đƣợc từ các công thức B1, B2, B3, hạt polymer tạo thành trong dung môi cloroform trong suốt không màu, hầu nhƣ không thể quan s{t đƣợc điểm gel của phản ứng. Bên cạnh đó cafein tan trong acetonitril tốt hơn trong aceton, nên dung môi acetonitril đƣợc chọn làm dung môi phản ứng polymer (công thức B2). Nồng độ AIBN trong MIP càng cao, thời gian tổng hợp càng nhanh. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ AIBN lên quá cao, polymer sẽ đông khối trƣớc khi kịp cho vào dung môi tạo hạt. Do đó, công thức B4 phù hợp hơn so với B6. So sánh công thức B2, B4, B5 có tỷ lệ chất liên kết chéo - monomer (EDMA - MAA) kh{c nhau. Lƣợng chất liên kết chéo càng lớn, hạt càng to, không đồng đều, tủa nhanh chóng và vón cục, tuy nhiên nếu hạt nhỏ quá sẽ không phù hợp nhồi cột SPE. Vậy nên tỷ lệ EDMA - monomer trong công thức đƣợc chọn là 80:20 (công thức B4). Sự hiện diện của NaOH làm phản ứng polymer hóa kéo dài trên 24 giờ. Vậy cuối cùng chỉ có các công thức B7, B8, B9, B11 đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng lƣu giữ của cafein-MIP. Tạo hạt Hình 1: Hình dạng hạt dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100x, mỗi vạch nhỏ nhất trên thước trắc vi tương ứng 400 nm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 208 Polymer ở dạng gel đƣợc kết tủa trong ethanol, thu đƣợc các hạt nhỏ có kính thƣớc h|ng micromet khi quan s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100x (Hình 1) Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử dụng quang phổ UV-Vis Sau khi tổng hợp MIP và NIP rồi tạo hạt với ethanol, tiến hành rửa giải với lần lƣợt các dung môi theo thứ tự: n-butanol, isopropanol, ethanol, methanol, methanol- acid acetic (9:1) rồi đo quang phổ UV-Vis ta thu đƣợc kết quả nhƣ Bảng 2. Kết quả cho thấy sau khi dùng n-butanol rửa giải cafein, các dung môi phân cực hơn không thể rửa giải nốt lƣợng cafein còn lƣu giữ trong cafein-MIP ngoại trừ hỗn hợp methanol-acid acetic (9:1). Hiện tƣợng sảy ra tƣơng tự khi tiến hành tái hấp thu cafein. Tuy nhiên khi tái hấp thu, NIP cho kết quả tƣơng tự MIP. Bảng2: Kiểm tra sự lưu giữ cafein của polymer dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis (kết quả được trình bày theo MIP/NIP của từng công thức tương ứng) B7 B8 B9 B11 Dung môi tạo hạt +/- +/- +/- +/- n-butanol +/- +/- +/- +/- Isopropanol -/- -/- -/- -/- Ethanol -/- -/- -/- -/- Methanol -/- -/- -/- -/- Methanol-acid (9:1) +/- +/- +/- +/- Tái hấp phụ cafein n-butanol +/+ +/+ +/+ +/+ Iso propanol -/- -/- -/- -/- Ethanol -/- -/- -/- -/- Methanol -/- -/- -/- -/- Methanol-acid (9:1) +/+ -/- +/+ -/- Chú thích: (+) l| dương tính, có hiện diện cafein, (-) là âm tính, không có hiện diện cafein Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử dụng phƣơng pháp HPLC Lƣợng cafein trong các dịch rửa giải MIP/NIP ở c{c giai đoạn kh{c nhau đƣợc trình bày trong Bảng 4. Bảng 3: Lượng cafein (mg) thu hồi trong các dịch rửa giải MIP/NIP ở c{c giai đoạn khác nhau với lượng cafein thêm vào mỗi giai đoạn là 1 mg. Dung dịch B 11 B7 B8 B9 MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP A 0,6144 0 0,3846 0 0,6351 0 0,5612 0 B 0,0031 0 0 0 0 0 0,0000 0 C 0,9127 0,9199 0,9234 0,9222 0,7141 0,7359 0,7317 0,6294 D 0,0015 0,0017 0 0 0,0040 0,0006 0 0 BÀN LUẬN Từ kết quả Bảng 3 cho thấy, khi dùng methanol để rửa giải, polymer B7 và B9 không có khả năng lƣu giữ cafein, trong khi polymer B8 và B11 chỉ bị rửa giải thêm bởi hỗn hợp methanol-acid acetic (9:1). B11 với monomer chỉ gồm acid methacrylic có thể đã tạo liên kết hydro với cafein nên cả MIP v| NIP đều có thể lƣu giữ cafein, lƣợng cafein còn lại chƣa đến 9%, tuy nhiên không có sự khác biệt, nhƣ vậy, liên kết này yếu hoặc quá ít nên việc đóng dấu không thành công. B8 là công thức giúp polymer có khả năng lƣu giữ thuận nghịch cafein. So sánh công thức của B8 với 3 công thức còn lại, sự khác biệt có thể đến từ h|m lƣợng tổng cộng của acid là thấp nhất. Nhƣ vậy có thể nhóm chức – COOH của acid methacrylic và acid acetic cản trở hình thành ái lực giữa polymer và cafein. B8 với monomer gồm acid methacrylic và 4-VP có 2 nhóm chức khác nhau là –COOH và nhóm pyridin có khả năng tƣơng hỗ tốt hơn để tạo ái lực tốt hơn với cafein, vốn là một base hữu cơ rất yếu, do vậy B8 lƣu giữ đƣợc nhiều cafein hơn, v| tạo là sự khác biệt giữa MIP và NIP, MIP có thể giữ cafein gấp 6,8 lần so với NIP (0,40% so với 0,06%). Hiệu quả đóng dấu phân tử này là rất cao so với các tài liệu tham khảo tìm thấy. Tuy nhiên ái lực này quá cao khiến cho cafein không thể rửa giải hoàn toàn với dung môi methanol-acid acetic (9:1). Tổng lƣợng cafein thu hồi đƣợc chỉ vào khoảng 70% so với 90% của B11. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 209 KẾT LUẬN Đề tài lần đầu tiên tổng hợp đƣợc cafein- MIP có khả năng lƣu giữ thuận nghịch cafein mà hiệu quả đóng dấu l|m tăng 6,8 lần so với không đóng dấu phân tử, bên cạnh đó cũng tổng hợp thành công hạt polymer với kích thƣớc nano tƣơng đối đều, đồng nhất. Từ kết quả n|y, đề t|i cũng mở ra những hƣớng nghiên cứu tiếp theo để cafein-MIP có đƣợc hiệu quả đóng dấu tối ƣu, phù hợp với định hƣớng l|m pha tĩnh cafein-MISPE. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Institute of Medicine (2014). Caffeine in Food and Dietary Supplements: Examining Safety: Workshop Summary. Leslie P, Ann LY, Diana P Washington DC, The National Academies Press. 2014. 2. Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R, Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010). Artificial receptor layers for detecting chemical and biological threats. Procedia Engineering. 5(Supplement C):381-384. 3. Öpik A, Menaker A, Reut J, Syritski V (2009). Molecularly imprinted polymers: A new approach to the preparation of Functional materials. Proceedings of the Estonian Academy of Sciences. 58(1):3-11. 4. Phan N, Sussitz H, Lieberzeit P (2014). Polymerization Parameters Influencing the QCM Response Characteristics of BSA MIP. Biosensors. 4(2):161-171. 5. Vasapollo G, Sole RD, Mergola L, Lazzoi MR, Scardino A, Scorrano S, Mele G (2011). Molecularly imprinted polymers: present and future prospective. International journal of molecular sciences. 12(9):5908-5945. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018