Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 5-Methoxybenzimidazol-2-Thion

Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 32 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-METHOXYBENZIMIDAZOL-2-THION Trương Phương*, Lê Thị Thùy Trang*, Ngô Duy Túy Hà** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Trong khi các dẫn chất benzimidazol-2-thion thể hiện nhiều tác dụng sinh học tốt thì các dẫn chất có gắn nhóm methoxy trên vị trí carbon số 5 của nó vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Do đó, chúng tôi chọn hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion và sàng lọc những chất có hoạt tính tốt trong việc gây độc trên một số dòng tế bào ung thư nhưng không được gây độc trên dòng tế bào thường. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp 5-methoxybenzimidazol-2-thion bằng phương pháp Thiocarbanilid từ nguyên liệu chính là 4-methoxyorthophenylendiamin (chất này được khử hóa từ 4-methoxy-2- nitroanilin) và CS2, alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion trong môi trường hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1) hoặc acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion trong môi trường pyridin. Xác định cấu trúc bằng các phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR và MS. Thử độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư HEPG2, RD và MDA và 1 dòng tế bào thường LLCPK1. Kết quả: Tổng hợp được và xác định cấu trúc của chín hợp chất mới (1-9) là những dẫn chất của 5-methoxybenzimidazol-2-thion. Hoạt tính gây độc tế bào không đồng đều trong các dẫn chất. Chỉ có 2/9 dẫn chât thử nghiệm (5) và (6) ức chế được dòng tế bào ung thư HEPG2, trong khi đó dòng tế bào RD bị ức chế bởi 7/9 chất thử nghiệm (1), (2), (4), (5), (6) và (7). Dòng tế bào MDA bị ức chế bởi 5/9 chất thử nghiệm (1), (4), (5), (6) và (7). Các chất thử nghiệm (4), (5) và (7) ảnh hưởng trên dòng tế bào thường. Kết luận: Sử dụng hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1) để alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion thu được hỗn hợp các đồng phân, các sản phẩm tinh khiết được tách ra bằng sắc ký cột. Các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S. Phản ứng acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion thu được sản phẩm thế trên N. Trong khi dòng tế bào ung thư HEPG2 bị ức chế bởi 2/9 dẫn chât thử nghiệm, dòng tế bào MDA bị ức chế bởi 5/9 chất thử nghiệm thì dòng tế bào RD bị ức chế bởi 7/9 chất thử nghiệm và có 3 chất thử nghiệm đã gây ảnh hưởng trên dòng tế bào thường. Từ khóa: 5-methoxybenzimidazol-2-thion, dẫn chất acyl, dẫn chất alkyl, gây độc tế bào, tác dụng gây độc tế bào ABSTRACT SYNTHESIS AND EVALUATION THE CYTOTOXIC EFFECTS OF 5-METHOXYBENZIMIDAZOLE-2-THIONE’S DERIVATIVES Truong Phuong, Le Thi Thuy Trang, Ngo Duy Tuy Ha * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 32 - 40 Background: While the benzimidazole-2-thione derivatives were demonstrated about their lots of good biological effects, the other derivatives with a methoxy group that attached to fifth position have not been studied much. Therefore, we chose to synthesis of 5-methoxy-benzimidazole-2-thione derivatives and screened these substances that have good activity in toxicity on some cancer cell lines but not on normal cell lines. Materials and methods: 5-methoxybenzimidazole-2-thione was synthesized from 4-methoxy-2-nitroaniline and CS2 with thiocarbanilide method. Thereafter, this substance was alkylated in the solvent mixture of DCM: TEA (10:1) or was acylated in pyridine solvent. All of synthesized derivatives structures were determined by UV, *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Trường Cao đẳng Y Tế Lâm Đồng Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Phương ĐT: 0938525157 Email: nguyetphuong1234@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 33 IR, 1H-NMR, 13C-NMR and MS spectra. The antitumor effects were tested on HEPG2, RD and MDA cancer cell strains and LLCPK1 normal cell strain. Results: Nine new compounds (1-9) of 5-methoxybenzimidazole-2-thione were synthesized and determined their structures. The result of this research showed that 2 derivatives ((5) and (6)) have good affect on MDA, 7 derivatives ((1), (2), (4), (5), (6) and (7)) inhibited the RD cancer cell strain, 5 derivatives ((1), (4), (5), (6) and (7)) inhibited the MDA cancer cell strain. Three derivatives ((4), (5) and (7)) endamaged on a normal tested cell strain. Conclusion: The DCM: TEA (10: 1) solvent mixture was used in the 5-methoxybenzimidazole-2-thione alkylization in order to obtain a mixture of the two new isomers, the pure products were separated by the column chromatography. The 5-methoxybenzimidazole-2-thione was alkylated at S position with ratio 1:1. The 5-methoxybenzimidazole-2-thione acylation reaction created the products which substituted in N positions. While the HEPG2 cancer cell strain was inhibited by 2/9 tested compounds, the MDA cancer cell strain was inhibited by 5/9 tested substances, the RD cancer cell strain was inhibited by 7/9 test substances, there were three experimental substances that have influenced the tested normal cell strain. Key words: 5-methoxybenzimidazole-2-thione, acyl derivatives, alkyl derivatives, cytotoxicity, cytotoxic effects ĐẶT VẤN ĐỀ Hóa trị liệu là một phương pháp điều trị ung thư sử dụng một hoặc nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào. Đây là một phần của phác đồ trị liệu ung thư chuẩn. Vì vậy, việc tìm ra và lựa chọn các loại thuốc hóa trị không có độc tính lên các tế bào bình thường nhưng lại có tác dụng tốt trên tế bào ung thư rất có ý nghĩa. Các dẫn xuất của benzimidazol-2-thion là một trong các nhóm dẫn xuất quan trọng nhất của dị vòng benzimidazol. Đây là nhóm các hợp chất đã được chứng minh có hoạt tính sinh học hết sức phong phú như kháng khuẩn(1), kháng nấm(2), kháng histamin, giảm đau(2), kháng virus(3), đặc biệt là tác dụng gây độc tế bào ung thư(4,5). Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc những chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt và dựa trên những kết quả đạt được, chọn hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion, đây là một hướng biến đổi khá triển vọng trên khung dẫn chất này để tiếp tục sàng lọc thêm được nhiều chất có tác dụng sinh học tốt. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 4-methoxy-2-nitroanilin, carbon disulfid, allyl bromid, benzyl clorid, 2-clorobenzyl clorid, 2-methylbenzyl clorid, 2-fluorobenzyl clorid, 4- fluorobenzyl clorid, anhydrid acetic, kali hydroxyd tinh thể, than hoạt tính, dung dịch acid hydrocloric đậm đặc... Bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của Merck. Các hệ dung môi A cloroform : aceton (19:1) B toluen : ethyl acetat (2:1) C n-hexan : aceton (2:1) D n-hexan : ethyl acetat (1:1) E toluen : ethyl acetat (3:1) F n-hexan : ethyl acetat (2:1) Nguyên liệu thử độc tế bào Dòng tế bào HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD (tế bào ung thư cơ vân người), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào thận heo) được hoạt hóa và nuôi cấy tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất Môi trường EMEM, môi trường DMEM, huyết thanh bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA; L-glutamin, penicilin-streptomycin (Gibco, Mỹ); PBS, trypan blue, MTT (Sigma-Aldrich, Mỹ); isopropanol (Merck, Đức). Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 34 Nuôi cấy tế bào Tế bào HEPG2, LLC-PK1 nuôi trong môi trường EMEM; tế bào RD, MDA-MB-231 nuôi trong môi trường DMEM; bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi đạt độ phủ 70 - 80%, thu và đếm tế bào sống với trypan blue, cấy chuyển hoặc chia vào đĩa nuôi cấy. Xử lý tế bào Dung dịch mẹ của các mẫu thử được pha trong DMSO chiếu UV và bảo quản ở -20 oC. Tế bào được chia vào các đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ thích hợp. Sau khi ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC, 5% CO2, xử lý tế bào với các mẫu thử ở nồng độ khác nhau (12,5 – 100 µM), nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 1% (tt/tt). Paclitaxel được dùng làm chất đối chứng dương. Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT Tỷ lệ tế bào sống xác định nhờ hoạt tính của enzym succinat dehydrogenase (SDH) có trong ty thể tế bào sống. SDH chuyển MTT [3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch tím, đo OD ở 570 nm; giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu thử. Dụng cụ và trang thiết bị Tổng hợp và tinh chế sản phẩm: Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart SB162, cá từ, bếp nung Alma, máy hút chân không, phễu Buchner, máy cô quay Stuart, cột sắc ký. Kiểm nghiệm sản phẩm: Sắc ký bản mỏng GF254, bình triển khai sắc ký, buồng soi UV VilberLourmat, ống mao quản, máy đo điểm chảy Stuart SMP10; máy đo phổ hồng ngoại IR: FTIR 8201 PC (SHIMADZU); máy đo khối phổ MSQ Plus – Thermo; máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500 Bruker (500 MHz). Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp các chất theo Hình 1 như sau: Hình 1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa và acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 35 KẾT QUẢ Tổng hợp 5-methoxybenzimidazol-2-thion (1) Giai đoạn 1 Khử hóa 4-methoxy-2-nitroanilin Trong bình cầu 2 cổ 250 ml, cho 20 g 4-methoxy-2-nitroanilin (117 mmol), 40 ml ethanol tuyệt đối, 12 ml KOH 30% (6 mmol). Đặt bình phản ứng lên bếp từ, trong thau nước đá và gắn với sinh hàn hồi lưu. Khuấy cho đến khi hỗn hợp trong bình tan hết. Cho từng phần 3 g bột kẽm vào bình cầu, khuấy đều, tổng lượng kẽm sử dụng là 32 g (492 mmol). Sau 3 giờ, lọc hỗn hợp dịch phản ứng qua phễu Buchner với ethanol tuyệt đối. Dịch lọc thu được thêm 0,72 g natri dithionit (4 mmol). Lưu ý: phản ứng khử xảy ra mãnh liệt do đó cần giữ nhiệt độ phản ứng ở khoảng 15 °C. Giai đoạn 2 Đóng vòng benzimidazol Trong bình cầu, cho toàn bộ dịch lọc thu được ở giai đoạn khử hóa, 2,5 g KOH tinh thể (45 mmol), 12 ml carbondisulfid (199 mmol) và khuấy đều. Đun hồi lưu hỗn hợp trong 8 giờ. Cô quay hỗn hợp phản ứng còn khoảng 40 ml. Để nguội, thêm từ từ 100 ml nước cất, khuấy kỹ thấy tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa bằng phễu Buchner, rửa tủa với 100 ml nước cất thu được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol: nước (1:2), lọc và sấy ở 45 – 50 °C. Thu được 8,28 g sản phẩm tinh khiết (46 mmol), hiệu suất đạt 39,3%. Chất (1): 5-methoxybenzimidazol-2-thion C8H8N2OS. P.t.l: 180,23. Bột kết tinh màu vàng, tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton, nhiệt độ nóng chảy 261 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): A (0,4), C (0,2), D (0,3); IR (cm-1): 3296,35 ( N – H amin); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 12,376 (s, 1H, H3); 12,336 (s, 1H, H1); 7,034-7,017 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 6,731-6,708 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 6,671-6,667 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 3,740 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 167,75 (C2); 155,69 (C5); 133,00 (C9); 126,32 (C7); 109,89 (C8); 109,65 (C6); 94,41 (C4); 55,50 (C10); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C8H9N2OS) + = 181,0436; [M-H]- (C8H7N2OS) - = 179,0279, giá trị đo được là 181,0506 và 179,0675. Tổng hợp các dẫn chất alkyl 5- methoxybenzimidazol-2-thion (2,3,4,5,6,7) Trong bình cầu 100 ml, cho 1 g 5-methoxybenzimidazol-2-thion (3) (5 mmol), 11 ml hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1), 1 ml benzyl bromid (8,5 mmol). Khuấy và đun hồi lưu ở nhiệt độ 40 oC trong 3 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng chuyển sang cốc có mỏ và khuấy trực tiếp trên bếp từ có gia nhiệt đuổi dung môi. Ngừng gia nhiệt khi hơi bay lên không làm xanh giấy quỳ ẩm, hỗn hợp phản ứng rắn lại. Hòa tan rắn bằng lượng tối thiểu ethanol tuyệt đối (10ml), thêm từ từ dung dịch HCl 10% cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa. Thêm dần 100 ml nước cất vào hỗn hợp. Lọc qua phễu Buchner thu tủa, rửa tủa với 100 ml nước cất thu sản phẩm thô. Sản phẩm thô được kết tinh lại trong ethanol và dung dịch HCl 10%, lọc và sấy ở 45 – 50 °C. Thu được 1,15 g sản phẩm (4,3 mmol), hiệu suất đạt 85%. Sản phẩm thu được sau phản ứng có thể gồm 1 hoặc 2 chất có Rf khác nhau và không thể tách bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi. Do đó, sử dụng phương pháp sắc ký cột để tách và tinh chế 2 sản phẩm. Các phản ứng với những dẫn chất alkyl clorid khác tiến hành tương tự như phản ứng với benzyl bromid. Hiệu suất các phản ứng dao động từ 30 - 85% (Bảng 1). Chất (2): 2-(benzylthio)-5-methoxybenzimidazol C15H14N2OS. P.t.l: 270,35. Bột kết tinh màu trắng, tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton, nhiệt độ nóng chảy 192 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,61), C (0,38), D (0,53); IR Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 36 (cm-1): 3317,56 ( N – H amin); 3003,17 ( C – H nhân thơm); 1496,76 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,542-7,524 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 7,468-7,451 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H2’, H6’); 7,329-7,299 (dd, J1 = 6,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, 2H, H3’, H5’); 7,276-7,261 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H4’); 7,103-7,098 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 7,015-6,992 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 4,777 (s, 2H, H11); 3,815 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 157,10 (C5); 147,79 (C2); 136,22 (C9); 134,77 (C1’); 128,84 (C8); 128,66 (C3’ & C5’); 128,47 (C2’ & C6’); 127,83 (C4’); 114,15 (C7); 113,92 (C6); 96,04 (C4); 55,74 (C10); 36,44 (C11); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C15H15N2OS) + = 271,0905; giá trị đo được là 271,0939. Bảng 1. Phản ứng alkyl hóa tạo dẫn chất thế alkyl Chất R Cấu tạo Hiệu suất 2 85 % 3 43 % 4 42 % 5 46 % 6 32 % 7 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 37 Chất (3): 2-((2-chlorobenzyl) thio)-5- methoxybenzimidazol C15H13ClN2OS. P.t.l: 304,79. Bột màu trắng, tan trong ethanol, methanol, aceton, cloroform, ít tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 194 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,55), C (0,33), D (0,43); IR (cm-1): 2991,59 ( C – H alkan); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1506,41 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 8,453-8,435 (dd, J1 = 1 Hz, J2 = 8 Hz, 1H, H3’); 8,402-8,385 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 8,334-8,315 (dd, J1 = 1 Hz, J2 = 8 Hz, 1H, H6’); 8,186-8,152 (td, 1H, H4’); 8,124-8,092 (td, 1H, H5’); 7,954-7,950 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 7,882-7,859 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 5,678 (s, 2H, H11); 4,657 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 157,33 (C5); 146,94 (C2); 134,52 (C1’); 133,63 (C9); 133,25 (C8); 131,20 (C2’); 130,10 (C3’); 129,75 (C4’); 128,15 (C6’); 127,61 (C7); 114,40 (C5’); 114,25 (C 6); 96,00 (C4); 55,79 (C10); 35,07 (C11); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C15H14ClN2OS)+ = 305,0515; giá trị đo được là 305,0490. Chất (4): 1,3-di(2-chlorobenzyl)-5-methoxy- benzimidazol-2-thion C22H18Cl2N2OS. P.t.l: 429,36. Tinh thể hình kim, màu nâu nhạt tan trong cloroform, aceton, ít tan trong nước, ethanol, có nhiệt độ nóng chảy 178 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,74), E (0,8), F (0,85); IR (cm-1): 2991,59 ( C – H alkan); 3064,89 ( C - H nhân thơm); 1496,76 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,569-7,544 (m, 2H, H3’, H3”); 7,359-7,321 (m, 2H, H4’, H4”); 7,286-7,244 (m, 2H, H5’, H5”); 7,207-7,190 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 6,995-6,991 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 6,857-6,835 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 6,800-6.765 (m, 2H, H6’, H6”); 5,684 (s, 2H, H11); 5,661 (s, 2H, H12); 3,721 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 169,83 (C2); 156,65 (C5); 133,10 (C9); 133,02 (C2’); 132,53 (C2’’); 131,77 (C8); 131,73 (C6’ & C6”); 129,54 (C1’); 129,08 (C3’ & C3”); 129,03 (C1’’); 127,46 (C5’); 127,35 (C5”); 127,28 (C4’); 125,60 (C4’’); 110,44 (C7); 110,41 (C6); 95,47 (C4); 55,78 (C10); 45,38 (C11); 45,34 (C12), MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C22H19Cl2N2OS)+ = 429,0595; giá trị đo được là 429,0593. Chất (5): 2-((2-methylbenzyl) thio) -5- methoxybenzimidazol C16H16N2OS. P.t.l: 284,38. Bột kết tinh màu trắng, tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton; có độ nóng chảy 189 °C. SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,58), C (0,3), D (0,25). UV (λmax) (nm): . IR (cm-1): 3377,36 ( N – H amin); 2937,59 ( C – H alkan); 1458,18 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,579-7,561 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 7,370-7.356 (d, J = 7 Hz, 1H, H3’); 7,234-7,188 (m, 2H, H5’, H6’); 7,128-7,124 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 7,113-7,095 (dd, J1 = 1,5 Hz, J2 = 7 Hz, 1H, H4’); 7,060-7,037 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 4,794 (s, 2H, H11); 3,833 (s, 3H, H10); 2,411 (s, 3H, H12); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 157,32 (C5); 147,58 (C2); 136,93 (C1’); 133,21 (C9); 130,60 (C2’); 129,67 (C8 & C3’); 128,35 (C6’ & C4’); 126,20 (C5’); 114,32 (C7); 114,14 (C6); 95,98 (C4); 55,79 (C10); 35,47 (C11); 18,72 (C12); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C16H17N2OS) + = 285,1061; giá trị đo được là 285,1010. Chất (6): 1,3-di(2-methylbenzyl)-5- methoxybenzimidazol-2-thion C24H24N2OS. P.t.l: 388,53. Bột kết tinh màu nâu, tan trong cloroform, aceton, ít tan trong ethanol, nước; có nhiệt độ nóng chảy 173 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,8), E (0,9), F (0,78); IR (cm-1): 3020,53 ( C – H nhân thơm); 1458,18 ( C = C nhân thơm); 2920,23 ( C – H alkan); 1H- NMR (400 MHz, DMSO, δ ppm): 7,27 – 7,24 (m, 2H, H4 & H7); 7,20 – 7,16 (tdd, J1 = 1 Hz, J2 = 3, J3 = 7,5, J4 = 7,5), 2H, H3’ & H5’); 7,12 – 7,08 (m, 3H, H5’’, H3’’ & H6’); 6,85 – 6,84 (d, J=2, 1H, H6’’); 6,81 – 6,78 (dd, J1=2, J2 = 8,75 1H, H6); 6,63 – 6,60 (dd, J1=1, J2 = 3, J3 = 7,5, 2H, H4’ &4’’); 5,59 (s, 2H, H11); 5,58 (s, 2H, H12); 3,68 (s, 3H, H10); 2,43 (s, 3H, H13); 2,42 (s, 3H, H14); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 170,20 (C2); 156,86 (C5); Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 38 135,94 (C9); 135,92 (C1’ & C1”); 134,25 (C8); 133,15 (C2’ & C2”); 130,81 (C3’ & C3”); 127,57 (C7); 126,43 (C4’ & C4”); 126,33 (C5’); 125,77 (C6’); 125,66 (C5’’); 111,09 (C6’’); 110,42 (C6); 96,17 (C4); 56,23 (C10); 46,23 (C11); 46,18 (C12); 19,35 (C13 & C14). MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C24H25N2OS) + = 389,1687; giá trị đo được là 389,1581. Chất (7): 2-((4-fluorobenzyl) thio)-5- methoxybenzimidazol C15H13FN2OS. P.t.l: 288,34. Bột kết tinh màu trắng. tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 185 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,7), C (0,42), D (0,6); IR (cm-1): 3415,93 ( N – H amin); 1456,26 ( C = C nhân thơm). 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,567-7,549 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 7,532-7,503 (m, 2H, H2’ & H6’); 7,165-7,129 (m, 2H, H3’ & H5’); 7,118-7,113 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 7,050-7,027 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 4,798 (s, 2H, H11); 3,824 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 162,61 (C4’); 160,67 (C5); 157,35 (C2); 147,53 (C9); 134,20 (C1’); 132,46 (C8); 131,01 (C2’); 130,94 (C6’); 127,77 (C7); 115,63 (C3’); 115,45 (C5’); 114,39 (C6); 95,94 (C4); 55,79 (C10); 35,75 (C11); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C15H14FN2OS) + = 289,0810; giá trị đo được là 289,0794. Kết quả trên cho thấy các sản phẩm (2,3,4,5,6,7) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến. Tổng hợp các dẫn chất thế acyl của 5-methoxybenzimidazol-2-thion Trong bình cầu 100 ml, cho 1g 5- methoxybenzimidazol-2-thiol (5 mmol), 2 ml pyridin, 6 ml anhydrid acetic (55 mmol) (trong tổng hợp sản phẩm (8)) hoặc 3 ml benzoyl clorid (26 mmol) (trong tổng hợp sản phẩm (9)). Khuấy và đun hồi lưu ở nhiệt độ 70 - 80 oC trong 3 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng để nguội, thêm từ từ 100 ml nước cất, khuấy kỹ thấy tủa xuất hiện. Lọc thu tủa qua phễu Buchner, rửa tủa với 100 ml nước cất thu sản phẩm thô. Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol: nước (1:2), lọc và sấy ở 45-50°C. Thu được 1,04 g sản phẩm tinh khiết (4,7 mmol), hiệu suất đạt 85% (sản phẩm 8) và 1,76 g sản phẩm tinh khiết (4mmol), hiệu suất đạt 82% (sản phẩm 9). Chất (8): 1-acetyl-5-methoxy-benzimidazol-2- thion C10H10N2O2S. P.t.l: 222,26. Bột kết tinh màu nâu sậm, tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 186,5 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,6), C (0,35), D (0,5); IR (cm-1): 1678,07 ( C = O amid); 3020,53 ( C – H nhân thơm); 1402,25 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 13,192 (s, 1H, H3); 7,905- 7,887 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 6,810-6,787 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 6,671-6,666 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 3,774 (s, 3H, H10); 2,973 (s, 3H, H12); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 171,58 (C11); 169,95 (C2); 157,20 (C5); 131,97 (C9); 124,68 (C8); 116,4 (C7); 109,92(C6); 94,15 (C4); 55,44 (C10); 27,77 (C12); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C10H11N2O2S)+ = 223,0541; [M-H]- (C10H9N2O2S) = 221,0384; giá trị đo được lần lượt là 223,0440 và 221,0392. Chất (9): 1,3-dibenzoyl-5-methoxybenzimidazol- 2-thion C22H16N2O3S. P.t.l: 388,44. Bột kết tinh màu vàng, tan trong cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 160 oC; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,7), D (0,75), E (0,85); IR (cm- 1): 1598,99 ( C = O amid); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1492,90 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,924-7,885 (m, 4H, H2”, H6”, H2’, H6’); 7,657-7,610 (m, 2H, H4’, H4”); 7,509-7,465 (m, 4H, H3”, H5”, H3’, H5’); 7,304-7,286 (d, J = 9 Hz, 1H, H7); 6,902-6,897 (d, J = 2 Hz, 1H, H4); 6,864-6,841 (dd, J1 = 2 Hz, J2 = 9 Hz, 1H, H6); 3,796 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,19 (C2); 168,98 (C11); 168,91 (C12); 157,94 (C5); 134,57 (C9); 132,53 (C1”); 132,36 (C1’); 132,28 (C2” & C6”); 130,71 (C2’ & C6’); 130,61 (C3’ & C5’); 128,91 (C3” &C5”); 128,81 (C9); 127,75 (C4’ &4’’); 125,44 (C7); 112,83 (C8); 112,08 (C6); 97,14 (C4); 55,98 (C10); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C22H17N2O3S)+ = 389,0959; giá trị đo được là 389,0935. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 39 Bảng 2. Kết quả thử tính gây độc tế bào TB UNG THƯ TB THƯỜNG HEPG2 RD MDA LLCPK1 Mẫu IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 SD (1) > 100 27.29 1.33 43.05 1.35 > 100 (2) > 100 38.15 0.93 > 100 > 100 (3) > 100 > 100 > 100 > 100 (4) > 100 23.88 0.64 31.75 0.23 58.30 (5) 27.70 0.55 21.30 0.25 18.66 1.05 97.56 (6) 48.48 1.54 10.71 0.34 21.56 0.48 88.57 (7) > 100 53.01 1.44 80.45 2.10 > 100 (8) > 100 > 100 > 100 > 100 (9) > 100 > 100 > 100 > 100 BÀN LUẬN Phản ứng tạo 5-methoxybenzimidazol-2-thion từ nguyên liệu ban đầu là 4-methoxy-2-nitroanilin theo phương pháp thiocarbanilid dễ thực hiện, cho sản phẩm tinh khiết. Đây gần như là một trong những phương pháp tối ưu để có thể tổng hợp những hợp chất chứa dị vòng benzimidazol-2-thion. Tuy nhiên việc thực hiện phản ứng với CS2 phải cẩn thận do CS2 rất dễ cháy nổ. Phản ứng alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2- thion với các alkyl halid trong hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1) thu được sản phẩm tinh khiết sau khi tách bằng sắc ký cột, dễ thực hiện. Điều này giúp việc nghiên cứu tổng hợp thêm nhiều hoạt chất mới với những alkyl halid khác sẽ trở nên dễ dàng hơn. Phản ứng acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2- thion với anhydrid acetic hay benzoyl clorid trong dung môi pyridin thu được sản phẩm dễ dàng, đạt hiệu suất cao. Tất cả các sản phẩm thế 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế hơn vị trí N; tuy nhiên, khi thế hai nhóm thì lại không vào S, các bằng chứng trên phổ đều cho thấy thế di alkyl lại vào 2 vị trí N, N. Điều này có thể được suy đoán là lúc đầu, nhóm thế alkyl 1 ưu tiên vào S, sau đó nhóm thế alkyl 2 gắn vào N, sản phẩm sẽ bị chi phối động học, tự động chuyển thành đồng phân có độ bền cao hơn (tạo thành sản phẩm bền động học), 2 nhóm thế đẩy nhau cực mạnh, tự chuyển sang nối N,N để giảm sức căng nội phân tử, tạo sản phẩm bền. Đặc biệt là nhóm thế có gắn thêm – CH3 hoặc –Cl khi nằm gần nhau sẽ có độ bền nhiệt động học kém hơn. Ở đây là chênh lệch về độ bền gây ra sự chuyển vị chưa đủ (không phải là hổ biến). Hoạt tính gây độc tế bào không đồng đều trong các dẫn chất. Chỉ có 2 dẫn chât thử nghiệm (5) và (6) ức chế được dòng tế bào ung thư HEPG2. Dòng tế bào RD bị ức chế bởi 7 chất thử nghiệm (1), (2), (4), (5), (6) và (7). Dòng tế bào MDA bị ức chế bởi 5 chất thử nghiệm (1), (4), (5), (6) và (7). Các chất thử nghiệm (4), (5) và (7) ảnh hưởng trên dòng tế bào thường. KẾT LUẬN Phản ứng alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol- 2-thion với các alkyl halid trong hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1), sau đó tách hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột thu được sản phẩm tinh khiết. Phản ứng acyl hóa 5- methoxybenzimidazol-2-thion thu được sản phẩm dễ dàng. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Trong lúc các dòng tế bào ung thư bị ức chế bởi từ 2 đến 7 dẫn chất tổng hợp thì 3 chất trong số đó đã có ảnh hưởng lên dòng tế bào thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Gurrala S, Babu YR, Rao GV, Latha BM (2011). Symmetrical coupling of 2-mercapto benzimidazole derivatives and their antimicrobial activity. Int J Pharma Pharma Sci, 3(2):217-220. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 40 2. Singh GS, Mmolotsi BJ (2005). Synthesis of 2-azetidinones from 2-diazo-1,2-diarylethanones and N-(2- thienylidene)imines as possible antimicrobial agents. Il Farmaco, 60(9):727-730. 3. Asif H, Varshney MM, Rashid M, Ravinesh M, Afroz A (2011). Benzimidazole: A valuable insight into the recent advances and biological activities. Journal of Pharmacy Research, 4(2):413-419. 4. Rao A, Chimirri A, De Clercq E, Monforte AM, Monforte P, Pannecouque C, Zappala M (2002). Synthesis and anti-HIV activity of 1-(2,6-difluorophenyl)-1H,3H-thiazolo[3,4- a]benzimidazole structurally-related of 1,2- substitutedbenzimidazoles. Il Farmaco, 57(10):819-823. 5. Banik BK, Becker FF, Banik I (2004). Synthesis of anticancer beta-lactams: mechanism of action. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12(10):2523-2528. Ngày nhận bài báo: 05/02/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/04/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020