Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 5-Nitrobenzimidazol-2-Thion

Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 24 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-NITROBENZIMIDAZOL-2-THION Ngô Duy Túy Hà*, Ngô Quang Trường**, Đỗ Thị Hồng Tươi**, Nguyễn Lê Thanh Tuyền***, Trương Phương** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cấu trúc benzimidazol-2-thion có mặt trong nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý khác nhau được ứng dụng rộng rãi trong ngành Dược, nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về các dẫn chất benzimidazol- 2-thion có gắn thêm nhóm thế nitro (-NO2) ở vị trí carbon số 5. Chúng tôi lựa chọn tổng hợp trên khung dẫn chất này với mục tiêu sàng lọc thêm được nhiều chất có tác dụng gây độc tốt trên các dòng tế bào ung thư. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp 5-nitrobenzimidazol-2-thion bằng phương pháp Thiocarbanilid từ nguyên liệu chính là 5-nitroorthophenylendiamin và CS2, alkyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2- thion trong các môi trường pyridin, xúc tác chuyển pha CTAB, triethylamin hoặc aceton. Xác định cấu trúc bằng phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR và MS. Thử độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư HEPG2, RD và MDA và 1 dòng tế bào thường LLCPK1. Kết quả: Tổng hợp được và xác định cấu trúc của chín hợp chất mới (1-9) là những dẫn chất của 5-nitrobenzimidazol-2-thion. Không có dẫn chât thử nghiệm nào ức chế được dòng tế bào ung thư HEPG2 và MDA. Dòng tế bào RD bị ức chế bởi 3 chất (4), (5) và (7). Các chất thử nghiệm có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường được thử nghiệm. Kết luận: Phản ứng alkyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion với các alkyl halid trong các dung môi pyridin hay dùng xác tác chuyển pha CTAB thu được sản phẩm tinh khiết. Phản ứng trong triethylamin thu được hỗn hợp 2 đồng phân vị trí, hiệu suất cao. Phản ứng acyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion với anhydrid thực hiện trong dung môi pyridin. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Có 3/9 dẫn chất thử nghiệm ức chế được dòng tế bào ung thư RD. Từ khóa: 5-nitrobenzimidazol-2-thion, dẫn chất acyl, dẫn chất alkyl, gây độc tế bào, tác dụng gây độc tế bào ABSTRACT SYNTHESIS AND EVALUATION THE CYTOTOXIC EFFECTS OF 5-NITROBENZIMIDAZOLE-2-THIONE’S DERIVATIVES Ngo Duy Tuy Ha, Ngo Quang Truong, Do Thi Hong Tuoi, Nguyen Le Thanh Tuyen, Truong Phuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 24 - 31 Background: Although the benzimidazole-2-thione derivatives were visualized about their lots of good biological effects, the other derivatives with a nitro group that attached to fifth position have not been studied much. Therefore, we chose to synthesis of 5-nitro-benzimidazole-2-thione derivatives and screened these substances that have good activity in toxicity on some cancer cell lines. Materials and methods: The 5-nitrobenzimidazole-2-thione was synthesized from 5- nitroorthophenylenediamine and CS2 with thiocarbanilide method. Then, this compound was alkylated at position *Trường Cao đẳng Y Tế Lâm Đồng **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Phương ĐT: 0938525157 Email: nguyetphuong1234@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 25 S in pyridine or CTAB/KOH. When we used triethylamine to alkylize the products, we get the products with one alkyl on S and another on N. Acylation reactions take precedence on position N. These structures were determined by UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR and MS spectra. The antitumor effects were tested on HEPG2, RD and MDA cancer cell lines and LLCPK1 normal cell line. Results: Nine new derivatives (1-9) of 5-nitrobenzimidazole-2-thione were synthesized and determined their structures. There were no tested compounds that inhibited HEPG2 and MDA cancer cell lines. RD cell line were inhibited by substances (4), (5) and (7). Tested substances that had a weak effect on a normal cell line. Conclusion: Nine derivatives of 5-nitrobenzimidazole-2-thione were produced when 5-nitrobenzimidazole- 2-thione was alkylated with alkyl halide in pyridine solvent or in CTAB/KOH. The reaction in triethylamine gave a two-position isomer mixture with high performance. The reaction of 5-nitrobenzimidazole-2-thione acylation with anhydride was carried out in pyridine solvent. All 1: 1 alkyl substitutes were substituted on S, which proved that the S position favoured the alkyl substituent over the N position. There were 3/9 tested derivatives that inhibited RD cancer cell line. Key words: 5-nitrobenzimidazole-2-thione, acyl derivatives, alkyl derivatives, cytotoxicity, cytotoxic effects ĐẶT VẤN ĐỀ Mặc dù cấu trúc benzimidazol-2-thion được tìm thấy trong nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý khác nhau được ứng dụng rộng rãi trong ngành Dược như diệt ký sinh trùng(1), gây độc tế bào ung thư(2,3), chống động kinh(4) và tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn(5). Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc những chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt và dựa trên những kết quả đạt được, chọn hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 5-nitro-benzimidazol-2-thion bởi vì những dẫn chất này chưa được nghiên cứu sâu. Việc tổng hợp và sàng lọc được những dẫn chất có tác dụng tốt trên những dòng tế bào ung thư sẽ tạo nền tảng cho việc phát triển các thuốc kháng ung thư mới. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 5-nitro orthorphenylendiamin, carbon disulfid, allyl bromid, benzyl clorid, 2-clorobenzyl clorid, 2-nitrobenzyl clorid, 2-fluorobenzyl clorid, 4-fluorobenzyl clorid, anhydrid acetic, kali hydroxyd tinh thể, than hoạt tính, dung dịch acid hydrocloric đậm đặc. Bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của Merck. Các hệ dung môi: Hệ (A): toluen: ethyl acetat (4:1); Hệ (B): hexan: aceton (2:1); Hệ (C): cloroform: ethyl acetat (7:3). Nguyên liệu thử độc tế bào Dòng tế bào HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD (tế bào ung thư cơ vân người), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào thận heo) được hoạt hóa và nuôi cấy tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất Môi trường EMEM, môi trường DMEM, huyết thanh bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA; L-glutamin, penicilin-streptomycin (Gibco, Mỹ); PBS, trypan blue, MTT (Sigma-Aldrich, Mỹ); isopropanol (Merck, Đức). Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy tế bào Tế bào HEPG2, LLC-PK1 nuôi trong môi trường EMEM; tế bào RD, MDA-MB-231 nuôi trong môi trường DMEM; bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi đạt độ phủ 70 - 80%, thu và đếm tế bào sống với trypan blue, cấy chuyển hoặc chia vào đĩa nuôi cấy. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 26 Xử lý tế bào Dung dịch mẹ của các mẫu thử được pha trong DMSO chiếu UV và bảo quản ở -20 oC. Tế bào được chia vào các đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ thích hợp. Sau khi ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC, 5% CO2, xử lý tế bào với các mẫu thử ở nồng độ khác nhau (12,5 – 100 µM), nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 1% (tt/tt). Paclitaxel được dùng làm chất đối chứng dương. Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT Tỷ lệ tế bào sống xác định nhờ hoạt tính của enzym succinat dehydrogenase (SDH) có trong ty thể tế bào sống. SDH chuyển MTT [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch tím, đo OD ở 570 nm; giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu thử. Dụng cụ và trang thiết bị Tổng hợp và tinh chế sản phẩm: Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart SB162, cá từ, bếp nung Alma, máy hút chân không, phễu Buchner, máy cô quay Stuart, cột sắc ký. Kiểm nghiệm sản phẩm: Sắc ký bản mỏng GF254, bình triển khai sắc ký, buồng soi UV VilberLourmat, ống mao quản, máy đo điểm chảy Stuart SMP10; máy đo phổ hồng ngoại IR: FTIR 8201 PC (SHIMADZU); máy đo khối phổ MSQ Plus – Thermo; máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500 Bruker (500 MHz). Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp các chất theo Hình 1 sau: Hình 1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa và acyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 27 KẾT QUẢ Tổng hợp 5-nitrobenzimidazol-2-thion (1) Cho 10 g 4-nitro phenylen-1,2-diamin (0,065 mol) và 1,68 g KOH tinh thể (0,03 mol) vào 50 ml ethanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 250 ml. Khuấy trong 15 phút. Thêm 10ml CS2 (0,17 mol) vào bình cầu, đun hồi lưu ở 70 – 80 oC trong 8 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc sẽ thấy hỗn hợp rắn lại, để nguội bình phản ứng, thêm 100 ml nước cất, khuấy và lọc lấy tủa. Hòa tủa trong 100 ml cồn nước 1:1, đun nóng rồi lọc nhanh để lấy dịch lọc. Để nguội sẽ thu được tinh thể, lọc lấy tinh thể, sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Thu được 9,07 g sản phẩm. Hiệu suất 71,16%. Chất (1): 5-nitrobenzimidazol-2-thion C7H5N3O2S. P.t.l: 195,2. Dạng bột màu cam, tan trong ethanol, methanol, aceton, tan ít trong nước lạnh và tan nhiều trong nước nóng, nhiệt độ nóng chảy 271-273 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,35 (B); 0,29 (C); 0,05 (D). UV (λmax) (nm): 402, 388, 297. IR (cm-1): 3111,18 (-NH); 3055,24 (ν – C–H thơm); 1506,41 và 1382,96 (-NO2). Phổ NMR: 1H – NMR (DMSO, 500MHz, δ ppm): 13,123 (s, 1H, H3); 13,034 (s, 1H, H1); 8,077-8,059 (t, J1=9 Hz, J2=2 Hz, 1H, H6); 7,883-7,880 (d, J=2 Hz, 1H, H4); 7,303-7,286 (d, J=9 Hz, 1H, H7). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 171,78 (C2), 142,57 (C5), 137,34 (C8), 132,21 (C9), 118,86 (C7), 109,16 (C4), 104,62 (C6). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M-H]- (C7H4N3O2S)- = 194,0024; giá trị đo được là 194,0017. Tổng hợp các dẫn chất alkyl 5- nitrobenzimidazol-2-thion (2,3,4,5) Phương pháp a Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g chất (1) (5 mmol), sau đó cho thêm 10ml pyridin vào. Thêm 0,01 mol benzyl bromid. Khuấy liên tục trong 24 giờ. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình phản ứng 50 ml nước cất, khuấy mạnh và lọc lấy tủa. Tủa thu được sẽ tinh chế lại bằng hỗn hợp cồn nước 1:1. Thu được 0,719 g sản phẩm. Hiệu suất 57,86%. Phương pháp a’ Cho vào bình cầu 1 g chất (1) (5 mmol), thêm 1 g KOH (0,018 mol), 0,25 g CTAB. Sau đó thêm 10 ml DCM (CH2Cl2) khuấy cho tan. Thêm 1,5 ml benzylbromid (0,013 mol). Đậy nắp bình phản ứng, khuấy bình trong khoảng 8 giờ. Sau phản ứng, mở nắp bình cho bay hơi hết dung môi thu được rắn. Lấy rắn kết tinh lại bằng hỗn hợp cồn nước tỉ lệ 1:1. Lọc thu lấy rắn. Sản phẩm đem sấy ở 60 oC. Thu được 1,21 g. Hiệu suất 77,87%. Các phản ứng với những dẫn chất alkyl clorid khác tiến hành tương tự như phản ứng với benzyl bromid. Hiệu suất phản ứng dao động từ 30 – 60%. Chất (2): 2-(benzylthio)-5-nitrobenzimidazol C14H11N3O2S P.t.l: 285,32 thu được ở dạng bột màu nâu, tan trong ethanol, methanol, aceton, nhiệt độ nóng chảy 156-157 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,63 (B); 0,05 (D); 0,31 (E). UV (max) (nm): 573, 506, 345. IR (cm-1): 3101,54 (-NH); 3028,24 (ν – C–H thơm); 1519,91 và 1338,60 (-NO2). Phổ NMR: 1H – NMR (MeOD, 500 MHz, δ ppm): 8,305-8,301 (d, J=2Hz, 1H, H4); 8,083-8,061 (dd, J1=2Hz J2=9Hz, 1H, H6); 7,500-7,483 (d, J=8,5Hz, 1H, H7); 7,427-7,404 (m, 2H, H2’ H6’); 7,302-7,270 (m, 2H, H3’ H5’); 7,253-7,219 (m, 1H, H4’); 4,566 (s, 2H, S-CH2). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 157,48 (C2); 150,02 (C8); 144,46 (C5); 137,75 (C9); 129,98 (C3’,C5’); 129,69 (C2’,C6’); 128,77 (C1’); 125,50 (C4’); 118,96 (C6); 114,19 (C7); 111,45 (C4); 37,26 (C10). MS: m/z 284 (MH)-. Chất (3): 2-((2’-clorobenzyl) thio)-5- nitrobenzimidazol C14H10N3O2SCl, P.t.l: 319,76 thu được dạng tinh thể óng ánh màu xám, tan tốt trong methanol, ethanol, aceton. Nhiệt độ nóng chảy 121-123 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,76 (B); 0,58 (C); 0,10 (D). UV (max) (nm): 526, 499, 360, 345. IR (cm-1): 3159,40 (-NH); 3095,75 (ν – C–H thơm); 1521,84 và 1338,60 (-NO2); 734,88 (-C-Cl). Phổ Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 28 NMR: 1H – NMR (MeOD, 500 MHz, δ ppm): 8,391 (s, 1H, H4); 8,161-8,139 (dd, J1=2Hz J2=9Hz, 1H, H6); 7,559-7,541 (dd, J1=2Hz, J3=7,5Hz, 2H, H7 H3’); 7,443-7,425 (dd, J4=2Hz J3=7,5Hz 1H, H4’); 7,300-7,266 (dt, J4=1Hz J3=7,5Hz, 1H, H5’); 7,250-7,217 (dt, J3=7,5Hz J4=2Hz, 1H, H6’); 4,724 (s, 2H, S-CH2). ). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 144,63 (C2); 135,72 (C8); 135,31 (C5); 132,25 (C9, C1’); 130,80 (C3’,C5’); 130,62 (C2’,C6’, C4’); 128,32 (C6, C7); 119,07 (C4); 35,21 (C10). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M-H]- (C14H9N3O2SCl)- = 318,0104; giá trị đo được là 318,0128. Chất (4): 2-((2-methylbenzyl)thio)-5-nitro benzimidazol C15H13N3O2S; P.t.l: 299,35; thu được dạng tinh thể óng ánh màu vàng, tan tốt trong methanol, ethanol, aceton. Nhiệt độ nóng chảy 114-117 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,69 (B); 0,58 (C); 0,03 (D). UV (max) (nm): 506, 350. IR (cm-1): 3097,68 (-NH); 3012,81 (ν – C–H thơm), 1525,69 và 1340,53 (-NO2). Phổ NMR: 1H - NMR (MeOD, 500 MHz, δ ppm): 8,384 (s, 1H, H4); 8,164-8,161 (dd, J1=2Hz J2=9Hz, 1H, H6); 7,581- 7,571 (d, J=10Hz, 1H, H7); 7,353-7,338 (d, J=7,5Hz, 1H, H3’); 7,224-7,177 (qd, J3=2Hz, J4=7,5Hz, 2H, H4’ H5’); 7,136-7,103 (dt, J3=2Hz, J4=7,5Hz, 1H, H6’); 4,635 (s, 2H, S-CH2); 2,458 (s, 3H, CH3). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 144,64 (C2); 138,23 (C8); 135,06 (C5); 131,66 (C1’, C9); 130,96 (C3’, C5’); 129,31 (C2’,C6’, C4’); 127,33 (C6, C7); 119,09 (C4); 35,21 (C10); 19,20 (C11). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M-H]- (C15H12N3O2S)- = 298,0650; giá trị đo được là 298,0667. Chất (5): 2-((4-fluorobenzyl)thio)-5-nitro benzimidazol C14H10N3O2SF; P.t.l: 303,31, tinh thể màu vàng nhạt tan trong methanol, aceton, cloroform. Nhiệt độ nóng chảy 105-106 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,60 (B), 0,04 (D), 0,35 (E). UV (max) (nm): 273 nm và 250 nm; IR (cm-1): 3111,18 (-NH); 1508,33 và 1336,67 (-NO2); 1224,80 (-C-F). Phổ NMR: 1H – NMR (MeOD, 500 MHz, δ ppm): 8,366 (s, 1H, H4); 8,147-8,123 (ddd, 1H, H6); 7,566-7,548 (d, J=9Hz, 1H, H7); 7,479-7,451 (m, 2H, H2’, H6’); 7,052-7,017 (dt, 2H, H3’, H5’); 4,589 (s, 2H, S-CH2). 13C – NMR (MeOD, 125 MHz, δ ppm): 162,43 (C4’); 160,50 (C2); 155,84 (C8); 155,31 (C5); 142,21 (C9); 133,57 (C1’); 133,54 (C2’); 131,00 (C6’); 130,94 (C6); 117,53 (C7); 115,38 (C3’, C5’); 115,21 (C4); 34,14 (C10). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M-H]- (C14H9N3O2SF)- = 302,0399; giá trị đo được là 302,0336. Kết quả trên cho thấy các sản phẩm (2,3,5,7) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến. Tổng hợp các dẫn chất S, N dialkyl 5- nitrobenzimidazol-2-thion (6,7,8) trong triethylamin hoặc trong aceton Tiến hành Phương pháp b Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1) (5 mmol), thêm vào 20 ml triethylamin, thêm 0,02 mol các dẫn chất benzyl chlorid tương ứng. Đun hồi lưu liên tục 6 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, thu tủa. Hòa tủa trong 50 ml cồn tuyệt đối. Đun sôi cồn để kết tủa tan hoàn toàn. Để nguội và làm lạnh sẽ thu được kết tủa. Lọc lấy tủa, sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 60 oC. Hiệu suất của phản ứng dao động từ 30-40%. Phương pháp b’ Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1) (5 mmol), thêm 10 ml aceton khuấy cho tan. Cho thêm 5 ml 2-clo benzylclorid (0,043 mol). Khuấy bình trong khoảng 2 giờ. Sau phản ứng, thêm vào khoảng 20 ml nước cất, khuấy đến khi thu được cắn. Lọc thu lấy rắn. Sản phẩm đem sấy ở 60 oC. Thu được 0,68 g. Hiệu suất 35,36%. Tính chất vật lý Các sản phẩm (6,7 và 8) đều là bột màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt, tan tốt trong cloroform, aceton, ít tan trong ethanol, không tan trong nước Chất (6): 3-(2-clorobenzyl)-2-((2-clorobenzyl) thio)-5-nitrobenzimidazol: C21H15Cl2N3O2S, P.t.l: 443,02 thu được ở dạng bột màu nâu, tan tốt trong methanol, aceton, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 29 cloroform. Nhiệt độ nóng chảy là 108-109 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,70 (C); 0,33 (D); 0,87 (F). UV (max) (nm): 506, 402, 340. IR (cm-1): 3061,03 (ν – C - H thơm), 1512,59 và 1332,81 (-NO2); 756,10 và 732,95 (-C-Cl). Phổ NMR 1H – NMR (MeOD, 500 MHz, δ ppm): 8,303 (s, 1H, H4); 8,072-8,046 (m, 1H, H6); 7,517-7,450 (m, 3H, H7, H3’, H3”); 7,375-7,360 (t, 2H, H4’, H4”); 7,277-7,262 (m, 2H, H5’, H5”); 7,236-7,165 (m, 2H, H6’, H6”); 4,692 (s, 2H, H11, N-CH2); 4,669 (s, 2H, H10, S-CH2). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 144,44 (C2); 140,57 (C8); 136,61 (C5); 135,52 (C9); 135,24 (C1’’); 135,08 (C6’, C4’); 132,17 (C2’, C5’); 132,15 (C2’’, C6’’); 131,08 (C3’’); 130,71 (C5’’); 130,52 (C3’); 128,37 (C1’); 128,23 (C4’’); 118,97 (C6); 114,23 (C7); 111,55 (C4); 44,17 (C11); 35,15 (C10). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M-H]- (C21H14Cl2N3O2S)- = 442,0183; giá trị đo được là 442,0103. Chất (7): (7A)1-(2-methylbenzyl)-2-((2- methylbenzyl) thio)-5-nitrobenzimidazol và (7B)3-(2-methylbenzyl)-2-((2-methylbenzyl) thio)-5-nitrobenzimidazol C23H21N3O2S P.t.l: 403,14 là chất rắn màu cam, tan trong methanol, aceton. Sản phẩm thu được là hỗn hợp 2 chất với tỉ lệ 1:1. Nhiệt độ nóng chảy 110-112 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,16 (D); 0,60 (E); 0,83 (F). UV (max) (nm): 360, 346. IR (cm- 1): 1508,33 và 1338,60 (-NO2). Phổ NMR 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz,  ppm): 8,641và 8,637 (s, 1H, Har); 8,194-8,172 (dd, J1=2 Hz J2=9 Hz, 1H, Har); 8,071-8,049 (dd, J1=2 Hz J2=9 Hz, 1H, Har); 7,958-7,954 (d, J=2 Hz, 1H, Har); 7,782-7,765 (d, J=9 Hz, 1H, H7); 7,380 (s, 1H, Har); 7,365 (s, 1H, Har); 7,254-7,166 (m, 4H, 4Har); 7,144-7,115 (m, 1H, Har); 7,077-7,039 (2H, Har); 7,032-7,015 (d, J=9 Hz, 1H, Har); 6,554-6,532 (dd, 2H, Har); 5.260 (d, 4H, 2N-CH2); 4,720 và 4,696 (s, 4H, N-CH2,S-CH2); 2,431và 2,410 (s, 6H, 2CH3); 2,346 (s, 3H, CH3); 2,314 (s, 3H, CH3). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 158,68 (C2); 156,97 (C2); 147,69 (Car); 143,66 (Car); 143,04 (Car); 142,86 (Car); 140,48 (Car); 137,18 (Car); 137,15 (Car); 135,67 (Car); 135,28 (Car); 135,24 (Car); 133,54 (Car); 133,31 (Car); 132,13 (Car); 131,94 (Car); 130,90 (Car); 130,83 (Car); 130,71 (Car); 130,68 (Car); 130,27 (Car); 128,44 (Car); 128,37 (Car); 128,31 (Car); 128,26 (Car); 126,66 (Car); 126,63 (Car); 126,39 (Car); 126,34 (Car); 125,85 (Car); 125,64 (Car); 118,48 (Car); 118,15 (Car); 117,95 (Car); 114,68 (Car); 109,90 (Car); 105,93 (Car); 46,27 (CH2); 46,23 (CH2); 35,58 (CH2); 19,23(CH3); 19,16 (CH3). MS: m/z 404 (MH)+. Chất (8A): 1-(4-fluorobenzyl)-2-((4-fluoro benzyl)thio)-5-nitrobenzimidazol và (8B): 3- (4-fluorobenzyl)-2-((4-fluorobenzyl)thio)- 5-nitrobenzimidazol C21H15N3O2SF2 P.t.l: 411,08 là chất rắn dạng bột có màu vàng tươi. Sản phẩm rắn là hỗn hợp 2 chất với tỉ lệ 1:1, tan tốt trong aceton, ethanol, methanol. Nhiệt độ nóng chảy 128-130 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,87 (B); 0,68 (C); 0,04 (D). UV (max) (nm): 526, 402, 352. IR (cm -1): 1500,62 và 1334,74 (-NO2); 1220,94 và 1157,29 (-C-F). Phổ NMR 1H – NMR (DMSO, 500 MHz,  ppm): 8,554 và 8,550 (s, 1H, H4); 8,463-8,458 (d, J=2 Hz, 1H, H7); 8,129-8,117 (dd, J1=2 Hz, J2=9Hz, 1H, Har); 8,111-8,099 (dd, J1=2 Hz, J2=9Hz, 1H, Har); 7,757-7,739 (d, J=9 Hz, 1H, Har); 7,533-7,496 (m, 4H, Har); 7,220-7,182 (m, 4H, Har); 7,162-7,119 (m, 8H, Har); 5,516 (s, 2H, CH2); 5,446 (s, 2H, CH2); 4,682 và 4,666 (s, 4H, 2CH2). 13C – NMR ( MeOD, 125 MHz, δ ppm): 162,49 (C4’); 160,56 (C4’’); 157,90 (C2); 147,37 (Car); 142,87 (Car); 142,29 (Car); 142,11 (Car); 140,56 (Car); 133,13 (Car); 131,78 (Car); 131,70 (Car); 131,14 (Car); 131,09 (Car); 131,08 (Car); 131,03 (Car);129,33 (Car); 129,17 (Car); 117,88 (Car);117,77 (Car); 115,69 (Car);115,52 (Car); 115,39 (Car); 115,39 (Car); 115,21 (Car); 115,19 (Car); 113,51 (Car); 110,21 (Car); 106,53 (Car); 46,43 (C11); 46,27 (C11); 34,95 (C10); 34,91 (C10). MS: Giá trị tính toán m/z dự kiến [M+H]+ (C21H16N3O2SF2)+ = 412,0931; giá trị đo được là 412,0961. Nhận xét: Triethylamin là một dung môi có tính base, giúp cho phản ứng trở nên dễ dàng Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 30 hơn. Các chất (6), (7), (8) đều có 2 nhóm thế gắn vào vị trí S và vị trí N3 của vòng Imidazol. Kết quả trên cho thấy các sản phẩm (6), (7), (8) có là hỗn hợp có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến. (7A, 7B) và (8A, 8B) là một hỗn hợp đồng phân có Rf trùng nhau, khảo sát trên nhiều hệ dung môi, tạm thời chưa tách được. Tổng hợp các dẫn chất acetyl 5- nitrobenzimidazol-2-thion (9) trong pyridin Cho 1 g 5-nitrobenzimidazol-2-thion (5 mmol) cùng với 10ml pyridin (đã được làm khan) vào một bình cầu đáy tròn 100ml. Thêm vào bình cầu 2 ml anhydrid acetic (0,021 mol). Đun hồi lưu ở 110-115 oC trong 4 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội bình phản ứng rồi thêm 100 ml nước cất, khuấy và lọc lấy tủa. Hòa tủa trong 30 ml cồn nước 1:1, đun nóng rồi lọc nhanh để lấy dịch. Để nguội sẽ thu được tinh thể sản phẩm, lọc lấy tinh thể, sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Thu được 0,27 g sản phẩm. Hiệu suất 27,29%. Chất (9): 3(acetyl)-5-nitrobenzimidazol Bảng 1. Kết quả thử tính gây độc tế bào TB UNG THƯ TB THƯỜNG HEPG2 RD MDA LLCPK1 Mẫu IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD (1) > 100 > 100 > 100 > 100 (2) > 100 > 100 > 100 > 100 (3) > 100 > 100 > 100 > 100 (4) > 100 83,14 2.62 > 100 > 100 (5) > 100 92,68 1.79 > 100 > 100 (6) > 100 > 100 > 100 > 100 (7) > 100 91,43 1.44 > 100 > 100 (8) > 100 > 100 > 100 > 100 (9) > 100 > 100 > 100 > 100 (10) > 100 > 100 > 100 > 100 C9H7N3O3S; P.t.l: 237,23 thu được dạng bột màu đen tan ít trong methanol, ethanol, tan tốt trong DMF, DMSO. Nhiệt độ nóng chảy 196-198 oC. Sắc kí lớp mỏng: 0,61 (B); 0,02 (D); 0,26 (E). UV (λmax) (nm): 366, 296. IR (cm-1): 3180,62 (-NH); 1691,57 (-C=O). Phổ NMR: 1H - NMR (DMSO, 500 MHz, δ ppm): 13,780 (s, 1H, H1); 8,737-8,732 (d, J=2Hz, 1H, H4); 8,215-8,193 (dd, J1=2Hz J2=9Hz, 1H, H6); 7,305-7,287 (d, J=9Hz, 1H, H7); 2,980 (s, 3H, CH3). 13C– NMR ( DMSO, 125 MHz, δ ppm): 172,55 (C10); 171,84 (C2); 142,93 (C5); 136,25 (C9); 130,58 (C8); 121,80 (C7); 110,77 (C6); 109,31 (C4); 27,85 (C11). MS: m/z 236 (MH)-. BÀN LUẬN Phản ứng tạo 5-nitrobenzimidazol-2-thion theo phương pháp thiocarbanilid dễ thực hiện, cho sản phẩm tinh khiết, hiệu suất cao. Đây là một trong những phương pháp tối ưu để có thể những hợp chất chứa dị vòng benzimidazol-2- thion. Tuy nhiên việc thực hiện phản ứng với CS2 phải cẩn thận do CS2 rất dễ cháy nổ. Phản ứng alkyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion với các alkyl halid trong dung môi pyridin hay trong xúc tác chuyển pha thu được sản phẩm tinh khiết. Phản ứng alkyl hóa trong triethylamin hoặc aceton tạo ra một hỗn hợp đồng phân vị trí, dễ thực hiện. Điều này giúp việc nghiên cứu tổng hợp thêm nhiều hoạt chất mới với những alkyl halid khác sẽ trở nên dễ dàng hơn. Phản ứng acyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion với anhydrid acetic trong dung môi pyridin thu được sản phẩm dễ dàng. Tuy nhiên hiệu suất của phản ứng còn thấp, nên nghiên cứu thêm những dung môi phản ứng khác để giúp phản ứng đạt hiệu suất cao. Tất cả các sản phẩm thế 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế hơn vị trí N. Hoạt tính gây độc tế bào không đồng đều trong các dẫn chất. Không có dẫn chât thử nghiệm nào ức chế được dòng tế bào Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 31 ung thư HEPG2 và MDA. Dòng tế bào RD bị ức chế bởi 3 chất (4), (5) và (7). Các chất thử nghiệm có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường (IC 50 >100 µM). KẾT LUẬN Phản ứng alkyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion với các alkyl halid trong pyridin hay trong xúc tác chuyển pha CTAB thu được sản phẩm tinh khiết. Phản ứng acyl hóa 5-nitrobenzimidazol-2-thion thu được sản phẩm dễ dàng. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Có 3/9 dẫn chất thử nghiệm ức chế được dòng RD (tế bào ung thư cơ vân người). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kelley JM, Elliott TP, Beddoe T, Anderson G, Skuce P, Spithill TW (2016). Current threat of triclabendazole resistance in Fasciola hepatica. Trends in Parasitology, 32(6):458-469. 2. Pérez-Villanueva J, Hernández-Campos A, Yépez-Mulia L, Méndez-Cuesta C, Méndez-Lucio O, Hernández-Luis F, Castillo R (2013). Synthesis and antiprotozoal activity of novel 2-{[2-(1H-imidazol-1-yl) ethyl] sulfanyl}-1Hbenzimidazole derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 23(14):4221-4224. 3. Xiang P, Zhou T, Wang L, Sun CY, Hu J, Zhao YL, Yang L (2012). Novel benzothiazole, benzimidazole and benzoxazole derivatives as potential antitumor agents: synthesis and preliminary in vitro biological evaluation. Molecules, 17(1):873-883. 4. Shingalapur RV, Hosamani KM, Keri RS, Hugar MH (2010). Derivatives of benzimidazole pharmacophore: Synthesis, anticonvulsant, antidiabetic and DNA cleavage studies. European Journal of Medicinal Chemistry, 45(5):1753-1759. 5. Gurrala S, Babu YR, Rao GV, Latha BM(2011). Symmetrical coupling of 2-mercapto benzimidazole derivatives and their antimicrobial activity. Int J Pharma Pharma Sci, 3 (2): 217-220. Ngày nhận bài báo: 26/01/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/04/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020