Tổng quan về Bacillus thuringiensis var israelensis

Më §Çu Mét trong nh÷ng t¸c nh©n truyÒn nhòng bÖnh hiÓm nghÌo cho ng­êi nh­ sèt rÐt, sèt xuÊt huyÕt, viªm n·o NhËt B¶n… lµ do muçi g©y ra. Muçi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn rÊt tèt ë nh÷ng vïng cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nhiÒu loµi c«n trïng ph¸t triÓn nh­ nh÷ng vïng nhiÖt ®íi trong ®ã cã ViÖt Nam . Theo thèng kª cña Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO) th× hµng n¨m, trªn ViÖt Nam thÕ giíi cã tíi hµng triÖu tr­êng hîp m¾c c¸c bÖnh do muçi truyÒn. Riªng ë ViÖt Nam , theo thèng kª 6 th¸ng ®Çu n¨m 2001vÉn cßn 126.000 ca sèt rÐt, 8.700 ca sèt xuÊt huyÕt, trong ®ã 20-25% ca tö vong vµ 60-70% ®Ó l¹i di chøng. C¸c bÖnh hiÓm nghÌo do muçi truyÒn ®· cã mÆt ë hÇu hÕt c¸c tØnh thµnh trong c¶ n­íc lµm ¶nh h­ëng ®Õn t×nh h×nh kinh tÕ x· héi. Bªn c¹nh ®ã, sù tiÒm Èn nguy c¬ bïng næ thµnh dÞch do hiÖn t­îng kh¸ng thuèc cña c«n trïng lµm cho c¸c nhµ qu¶n lý ph¶i cã nh÷ng nç lùc ®Ó thanh to¸n c¸c bÖnh trªn. Së dÜ cã nh÷ng nguy c¬ ®ã lµ do mét thêi gian kh¸ dµi tõ tr­íc nh÷ng n¨m ®Çu cña thËp kØ 80, chóng ta ®· sö dông th­êng xuyªn c¸c ho¸ chÊt ®éc thuéc nhãm l©n h÷u c¬, c¸c chÊt thuéc nhãm Pyrethroid ®Ó tÈm nhuém mµn. §iÒu nµy kh«ng nh÷ng ph¸ vì c©n b»ng sinh th¸i, g©y hiÖn t­îng bïng næ c«n trïng do kh¸ng thuèc mµ cßn ¶nh h­ëng tíi søc khoÎ con ng­êi. Loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) ®­îc ph¸t hiÖn vµo n¨m 76 t¹i Israel cã kh¶ n¨ng diÖt muçi ®· më ra mét triÓn väng míi cho viÖc kiÓm so¸t c¸c vect¬ truyÒn bÖnh hiÓm nghÌo cho ng­êi. NhiÒu chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®· ®­îc s¶n xuÊt vµ øng dông thµnh c«ng nh­ Bactimos (BØ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mü)… Theo tæ chøc Y tÕ thÕ giíi th× viÖc sö dông chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi tõ c¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis lµ mét biÖn ph¸p rÊt an toµn vµ hiÖu qu¶. ë n­íc ta, viÖc nghiªn cøu vÒ Bacillus thuringiensis var.israelensis míi chØ b¾t ®Çu tõ mét vµi n¨m gÇn ®©y nh­ng còng ®· thu ®­îc nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng kÓ. NhiÒu chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc cao ®· ®­îc ph©n lËp, mét vµi dßng gen ®· ®­îc nghiªn cøu t¸ch dßng, ®äc tr×nh tù vµ biÓu hiÖn. Chóng ta còng ®· b­íc ®Çu thö nghiÖm thµnh c«ng chÕ phÈm trong ph¹m vi phßng thÝ nghiÖm. Tuy nhiªn viÖc s¶n xuÊt vµ øng dông chÕ phÈm diÖt muçi tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis cÇn ph¶i ®­îc nghiªn cøu thªm n÷a. PhÇn I:Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis 1.1. Tãm t¾t vÒ lÞch sö nghiªn cøu vµ øng dông cña Bacillus thuringiensis LÞch sö vÒ Bacillus thuringiensis b¾t ®Çu tõ khi Loius Pasteur ph¸t hiÖn thÊy mét loµi vi khuÈn cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh cho t»m «ng ®Æt tªn lµ Bacillus bombyces. N¨m 1901, Ishiwata ph©n lËp ra mét lo¹i vi khuÈn tõ Êu trïng t»mbÞ bÖnh vµ ®Æt tªn lµ Bacillus sotto, n¨m 1911, Berliner ®· ph©n lËp ®­îc mét lo¹i vi khuÈn t­¬ng tù tõ x¸c Êu trïng b­ím §ÞaTrung H¶i. §Õn n¨m 1915, vi khuÈn nµy chÝnh thøc mang tªn Bacillus thuringiensis . N¨m 1928, Huszddax ph©n lËp chñng B.thuringiensis (Bt ) tõ Ephestia, thö nghiÖm nã trªn s©u ®ôc th©n ng« ë Ch©u ¢u, ®©y ®­îc coi lµ øng dông ®Çu tiªn cña Bacillus thuringiensis .ChÕ phÈm th­¬ng m¹i ®Çu tiªn , Sporeine, ®­îc s¶n xuÊt ë Ph¸p n¨m 1938. N¨m 1951-1956 Steinhaus nghiªn cøu kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng cña Bacillus thuringiensis vµ ®· s¶n xuÊt ë Mü. Trong suèt nh÷ng n¨m 1960, nhiÒu chÕ phÈm th­¬ng m¹i cña Bt ®· ®­îc s¶n xuÊt ë nhiÌu quy m« kh¸c nhau t¹i Mü, Ph¸p, §øc.Sau ®ã Howard Dulmage vµ Clayton Beesle cña viÖn nghiªn cøu N«ng NghiÖp USDA ®· thu thËp ®­îc bé s­u tÇm ®Çu tiªn vÒ c¸c chñng Bt. N¨m 1970, Dulmage ®· ph©n lËp ®­îc chñng HD-1 vµ cho ®Õn nay nã vÉn ®­îc sö dông cho nhiÒu nghiªn cøu vµ trong chÕ phÈm Bt. ThËp niªn 80, nhiÒu c«ng ty s¶n xuÊt thuèc trõ s©u vi sinh ®· ®¨ng ký s¶n xuÊt vµ kinh doanh c¸c chÕ phÈm BT. §Çu nh÷ng n¨m 90 t¹i mét sè quèc gia nh­ Cuba, Trung Quèc, Mü ®É s¶n xuÊt chÕ phÈm BT ë quy m« c«ng nghiÖp. Ngµy nay mét sè l­îng lín th­¬ng phÈm trõ s©u sinh häc BT ®­îc sö dông trong viÖc kiÓm so¸t Êu trïng bé c¸nh vÈy, hai c¸nh vµ c¸nh cøng… 1.2. Sù ph©n bè cña B.thuringiensis Bacillus thuringiensis tån t¹i ë kh¾p mäi n¬i trong ®Êt vµ trªn bÒ mÆt l¸, ë ®Êt rõng, th¶o nguyªn, sa m¹c hay ë m«i tr­êng cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho s©u bä ph¸t triÓn nh­ bôi h¹t tõ c¸c nhµ m¸y xay lóa m×, trong c¸c kho b¶o qu¶n ngò cèc…Sù ph©n bè cña Bt lµ kh«ng liªn quan ®Õn sù ph©n bè cña c«n trïng ®Ých. Tuy nhiªn ,Bt th­êng cã xu h­íng tån t¹i nhiÒu trong m«i tr­ßng cã nhiÒu s©u bä ph¸t triÓn vµ giµu dinh d­ìng.Cã thÓ ph©n lËp Bt tõ nhiÒu lo¹i m«i tr­êng kh¸c nhau. Bt dÔ dµng ph¸t triÓn trong m«i tr­êng thÝ nghiÖm chØ víi mét l­îng tèi thiÓu chÊt dinh d­ìng. MÆc dï bµo tö Bt tån t¹i trong nhiÒu n¨m, nh­ng chóng kh«ng n¶y mÇm vµ nh©n lªn nh­ c¸c tÕ bµo sinh d­ìng trong ®Êt tù nhiªn. §iÒu nµy chøng tá r»ng Bt kh«ng thÝch nghi víi m«i tr­êng ®Êt. 1.3. §Æc ®iÓm sinh th¸i cña B.thuringiensis B.thuringiensis lµ thµnh viªn cña nhãm I, chi Bacillus. §©y lµ lo¹i vi khuÈn sinh bµo tö, Gram d­¬ng, h« hÊp hiÕu khÝ hoÆc hiÕu khÝ kh«ng b¾t buéc. TÕ bµo cã kÝch th­íc 3x6m, cã phñ tiªm mao kh«ng dµy, cã kh¶ n¨ng chuyÓn ®éng , tÕ bµo ®øng riªng rÏ hoÆc xÕp thµnh chuçi. Lµ mét loµi thuéc chi Bacillus nªn khi gÆp ®iÒu kiÖn kh«ng thuËn lîi nh­ thiÕu dinh d­ìng, nhiÖt ®é cao, kh« h¹n…Bt cã kh¶ n¨ng sinh néi bµo tö gióp cho chóng chèng chÞu víi ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt ®ã. Bµo tö cña vi khuÈn cã d¹ng h×nh trøng víi kÝch th­íc 1,5x2 m vµ cã thÓ n¶y mÇm thµnh tÕ bµo sinh d­ìng khi cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi. Sù h×nh thµnh bµo tö diÔn ra ®ång thêi víi sù t¹o thµnh protein tinh thÓ cã kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng. Tinh thÓ cã nhiÒu h×nh d¹ng kh¸c nhau ( h×nh vu«ng, ch÷ nhËt, h×nh th¸p, h×nh «van hoÆc v« ®Þnh h×nh ). Khi tÕ bµo ph©n gi¶i tinh thÓ vµ bµo tö ®­îc gi¶i phãng ra ngoµi. Tinh thÓ cã kÝch th­íc kho¶ng 0,6x0,2 m, vµ cã thÓ chiÕm tíi 30% träng l­îng kh« cña tÕ bµo. Tinh thÓ nµy ®­îc gäi lµ thÓ vïi. Tinh thÓ vµ bµo tö cã thÓ quan s¸t d­íi kÝnh hiÓn vi ®èi pha ë vËt kÝnh ®Çu. Tinh thÓ b¾t mµu sÉm cßn bµo tö kh«ng b¾t mµu nh­ng cã mÐp s¸ng. H×nh d¹ng cña tinh thÓ ®­îc quyÕt ®Þnh bëi gen m· ho¸ cho tæng hîp protein cña tinh thÓ n»m trªn plasmid. 1.4. §Æc ®iÓm sinh ho¸ cña B.thuringiensis Nãi chung B.thuringiensis kh«ng lªn men sinh axÝt ®èi víi arabinoza, xiloza, vµ manitol,khö nit¬rat thanh nit¬rit, cã ph¶n øng víi lßng ®á trøng gµ, ph¸t triÓn ®­îc trong m«i tr­êng th¹ch kÞ khÝ cã chøa 1% lizozym. Sinh tr­ëng tèt nhÊt ë nhiÖt ®é 28-30 0C, pH 6,8-7,2. 1.5.Ph©n lo¹i B.thuringiensis Bt ®­îc chia lµm nhiÒu lo¹i phô dùa trªn c¸c ®Æc ®iÓm sau: + Kh¶ n¨ng h×nh thµnh enzym leucitinase. + CÊu tróc tinh thÓ vµ kh¶ n¨ng g©y bÖnh cho c«n trïng. + §Æc tÝnh huyÕt thanh häc. + Ph¶n øng ng­ng kÕt cña c¸c tÕ bµo sinh d­ìng víi c¸c huyÕt thanh t­¬ng øng. Cho ®Õn nay ph­¬ng ph¸p ph©n lo¹i Bt ®­îc sö dông kh¸ phæ biÕn lµ dùa trªn c¸c ®Æc tÝnh huyÕt thanh häc. §Æc tÝnh huyÕt thanh häc cña chñng Bt ®­îc x¸c ®Þnh chñ yÕu dùa trªn kh¸ng nguyªn tiªn mao H vµ ®­îc tiÕn hµnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt c¸c tÕ bµo sinh d­ìng víi c¸c kh¸ng huyÕt thanh t­¬ng øng. Tuy nhiªn viÖc ph©n lo¹i chØ dùa trªn typ huyÕt thanh vÉn ch­a ph¶n ¸nh ®­îc mèi liªn hÖ gi÷a chñng gièng vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. ViÑc ph©n lËp vµ tuyÓn chän c¸c chñng Bt cã gi¸ trÞ vÉn gÆp khã kh¨n. ChÝnh v× vËy, gÇn ®©y mét sè nhµ khoa häc ®· ®Ò nghÞ ®­a ra ph­¬ng ph¸p ph©n lo¹i míi dùa trªn kÕt qu¶ x¸c ®Þnh typ huyÕt thanh, h×nh d¹ng tinh thÓ, ho¹t lùc diÖt c«n trïng, gen Cry vµ thµnh phÇn protein tinh thÓ, h×nh d¹ng tinh thÓ vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. B¶ng 1: Quan hÖ gi÷a c¸c líp Cry, h×nh d¹ng tinh thÓ, thµnh phÇn protein vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. Líp gen Thµnh phÇn Protein (KDa) H×nh d¹ng tinh thÓ Typ huyÕt thanh Ho¹t lùc diÖt c«n trïng Cry1A Cry1B Cry1C Cry1D Cry1E 131 138 135 133 133 Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i 1 3 6 7 8 C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy Cry2A Cry2B 71 71 Trßn Trßn 3 3 C¸nh vÈy, hai c¸nh C¸nh vÈy Cry3A Cry3B Cry3C Cry3D 73 74 129 73 Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i 8 8 8 8 C¸nh cøng C¸nh cøng C¸nh cøng C¸nh cøng Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D 135 128 78 67 H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu 14 14 14 14 Hai c¸nh Hai c¸nh Hai c¸nh Hai c¸nh Cry5 81 Th¸p ®«i 3 C¸nh vÈy, c¸nh cøng Cry6 ? ? ? Giun trßn CytA 28 14 1.6.C¸c lo¹i ®éc tè do B.thuringiensis sinh ra Trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö Bt cã kh¶ n¨ng sinh ra 4 lo¹i ®éc tè: +a-Exotoxin hay ngo¹i ®äc tè A N¨m 1954 lÇn ®Çu tiªn Tomanaff ph¸t hiÖn thÊy vi khuÈn Bt var.elesti s¶n sinh ra enzym leucintinase. T¸c ®éng ®éc cña enzym nµy liªn quan ®Õn sù ph©n huû mang tÝnh chÊt c¶m øng cña phospholopit trong m« cña c«n trïng, lµm c«n trïng chÕt.Enym nµy lÇn ®Çu tiªn liªn kÕt víi tÕ bµo ruét sau ®ã t¸ch ra vµ ®­îc ho¹t ho¸ bëi mét chÊt kh«ng bÒn nhiÖt. ChÊt nµy cã träng l­îng ph©n tö thÊp, cã thÓ lµ lipit. a-Exotoxin cã kh¶ n¨ng hoµ tan vµo n­íc vµ ®Æc biÖt chØ t¸c ®éng vµo loµi ong xÎ cã pH ®­êng ruét phï hîp víi ho¹t ®«ng cña enzym nµy. a-Exotoxin còng cã hiÖu lùc víi s©u thuéc bé c¸nh cøng, c¸nh vÈy… +b-Exotoxin hay ngo¹i ®äc tè B §äc tè nµy bÒn nhiÖt ë 1200C trong vßng 15 phót vÉn gi÷ ®­îc ho¹t tÝnh. Mét sè Bt kh«ng sinh ra tinh thÓ ®éc nh­ng cã thÓ sinh ra ngo¹i ®éc tè b. Ho¹t tÝnh cña ngo¹i ®éc tè b b¾t ®Çu xuÊt hiÖn trong giai ®o¹n ph¸t triÓn m¹nh tr­íc khi h×nh thµnh bµo tö. Ngo¹i ®éc tè lµ mét nucleotid cã träng l­îng ph©n tö thÊp. Ngo¹i ®éc tè b cßn cã t¸c dông céng h­ëng víi néi ®éc tè d, sau khi cã t¸c dông g©y dËp vì, ph¸ huû hoµn toµn biÓu m« ruét gi÷a cña «n trïng mÉn c¶m, ngo¹i ®éc tè nhanh chãng x©m nhËp vµo huyÕt t­¬ng vµ m¸u g©y thay ®æi sinh lý dÉn tíi c¸i chÕt nhanh cña c«n trïng. +g-exotoxin hay ®éc tè tan trong n­íc g-exotoxin thuéc nhãm photpholipaza, nã t¸c ®éng lªn photpholipit vµ gi¶i phãng ra axit bÐo g-exotoxin cã chøa c¸c peptid víi träng l­îng ph©n tö thÊp vµ mét sè axitamin tù do. Ngo¹i ®éc tè nµy tan trong n­íc, kh«ng æn ®Þnh, mÉn c¶m víi ¸nh s¸ng, oxy, kh«ng khÝ vµ nhiÖt ®é. +d-endotoxin (tinh thÓ ®éc) §Æc ®iÓm quan träng nhÊt cña vi khuÈn Bt lµ cã kh¶ n¨ng t¹o thµnh trong tÐ bµo mét lo¹i tinh thÓ cã b¶n chÊt lµ protein ®éc tÝnh ®èi víi nhiÒu lo¹i c«n trïng. Néi ®éc tè dlµ mét lo¹i protein kÕt tinh tõ 1180 gèc axitamin. C¸c axitamin chñ yÕu gåm axit glutamic, axit asparaginic chiÕm trªn 29% tæng sè axitamin trong ph©n tö protein, lµ nguyªn nh©n g©y ®iÓm ®¼ng ®iÖn thÊp. Nguyªn tè cña tinh thÓ, ngoµi C, H, O, N, S cßn thÊy mét sè nguyªn tè kh¸c nh­ lµ Ca, Mg, Si, Fe… víi mét l­îng nhá Ni, Zn, Al… vµ hÇu nh­ kh«ng cã P. Sù tæng hîp tinh thÓ xÈy ra kho¶ng 3 giê sau pha c©n b»ng. Mçi tÕ bµo sinh bµo tö chØ cã thÓ cã tõ 1 ®Õn 3 tinh thÓ ®éc. Tinh thÓ ®éc kh«ng tan trong dung m«i h÷u c¬. Cã nh÷ng tinh thÓ khi míi t¸ch khái bµo tö chØ tan trong pH rÊt kiÒm. Tinh thÓ ®äc rÊt bÒn nhiÖt,ñ 1 giê ë 650C vÉn kh«ng bÞ mÊt ho¹t tÝnh, tÝnh ®éc chØ mÊt ®i nÕu ñ ë 1000C trong 30-40 phót. 1.7. Ph©n lo¹i gen ®éc tè diÖt c«n trïng cña B.thuringiensis Ngµy nay ng­êi ta ®· ph©n tÝch 50 gen ®éc tè cña Bt vµ nhËn thÊy mét sè hoµn toµn gièng nhau, ®¹i diÖn cho cïng mét gen hay biÕn d¹ng tõ mét gen. Trong ®ã cã kho¶ng 20 gen ph©n biÖt chÞu tr¸ch nhiÖm tænh hîp c¸c protein tinh thÓ, nhÊt lµ c¸c protein tinh thÓ ®éc. B¶ng 2. Ph©n lo¹i gen ®éc tè vµ phæ t¸c dông cña Bt Tªn ®éc tè Träng l­îng ph©n tö, kDa C«n trïng ®Ých Chñng Bacillusthuringiensis H×nh d¹ng tinh thÓ Cry1A(a, b, c) Cry1B Cry1C Cry1D, E, F 130-133 138 135 130-134 C¸nh vÈy C¸nh vÈy Hai c¸nh Hai c¸nh B. berliner B. kurstaki KTO B. entomocidus B. aizawai L­ìng th¸p Cry2A Cry2B, C 71 71 C¸nh vÈy Hai c¸nh B. aizawai B. kurstaki HD-1 LËp ph­¬ng Cry3A, B, C, D 66-73 C¸nh cøng B. tenebrionis Thoi dÑt Cry4A, B Cry4C, D 125-140 68 Hai c¸nh B. morrisoni PG14 B. israelensiss CÇu Ch÷ nhËt Cry5A Cry5C 81 Hai c¸nh C¸nh cøng B. kurstaki JHCC L­ìng th¸p Cry6 44 Giun trßn B. thãmponi L­ìng th¸p PhÇn II. Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis var.israelensis 2.1. LÞch sö ph¸t triÓn cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis ®­îc chia lµm nhiÒu loµi phô. Theo bé s­u tËp cña trung t©m Bacillus diÖt c«n trïng Quèc tÕ, ViÖn Pasteur Paris n¨m 1996,®· cã tíi h¬n 69 loµi phô kh¸c nhau nh­: c¸nh vÈy, c¸nh cøng, hai c¸nh. ë mét sè loµi phô cña Bacillus thuringiensis var.berliner, Bacillus thuringiensis var.thompsoni… Kh¸c víi loµi Bacillus thuringiensis, loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis míi ®­îc ph¸t hiÖn gÇn ®©y. Loµi phô nµy cã t¸c dông diÖt Êu trïng muçi. C¸c nhµ khoa häc Goldberg, Margarit lµ nh÷ng ng­êi ®Çu tiªn ph©n lËp, nghiªn cøu loµi vi khuÈn nµy vµ De Bajac ®Æt tªn cho lµ Bacillus thuringiensis var.israelensis. Hä ®· ph©n lËp vµ nu«i cÊy,thö ho¹t lùc diÖt Èutïng muçi víi hµng tr¨m chñng kh¸c nhau. Tuy nhiªn chØ cã mét sè chñng cã ho¹t lùc diÖt c¸c loµi muçi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti vµ Anopheles sergentti… Chñng ®Çu tiªn ®ã ®­îc kÝ hiÖu lµ ORN-60A vµ thuéc typ huyÕt thanh H14. Kh¶ n¨ng sinh ®éc tè vµ t¸c dông diÖt muçi cña vi khuÈn nµy ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh c«ng bè. Ngµy nay ®· cã rÊt nhiÒu chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis ®­îc t×m thÊy vµ ®­îc ph©n lo¹i lµm phong phó thªm bé s­u tËp vÒ Bacillus diÖt c«n trïng. C¸c chñng th­êng ®­îc sö dông trong viÖc s¶n xuÊt chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi víi c¸c tªn gäi kh¸c nhau: Bactimos (BØ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mü)… chÕ phÈm d¹ng láng, d¹ng bét thÊm n­íc, d¹ng viªn, b¸nh næi cã t¸c dông diÖt Êu trïng cña nhiÒu loµi ruåi muçi trong ®ã cã loµi Aedes Aegypti ( lµ vect¬ truyÒn bÖnh sèt xuÊt huyÕt). ChÕ phÈm Bacillus thuringiensis var.israelensis cã t¸c dông tèt trong m«i tr­êng n­íc s¹ch, n­íc kh«ng tï ®äng hoÆc n­íc cã nång ®é muèi lo·ng vµ ®­îc Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi lùa chän ®Ó diÖt trõ c¸c vect¬ truyÒn bÖnh sèt rÐt, sèt xuÊt huyÕt ë c¸c n­íc nhiÖt ®íi. 2.2.§Æc ®iÓm ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis var.israelensis lµ loµi phô cña loµi Bacillus thuringiensis. De Bajac lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis thuéc typ huyÕt thanh H14. Tuy nhiªn vµo n¨m 1988, Ohba vµ Aiawa (NhËt B¶n) ®· ph©n lËp ®­îc hai chñng Bacillus thuringiensis thuéc typ huyÕt thanh H14 nh­ng l¹i kh«ng cã ho¹t lùc diÖt muçi, ruåi ®en. Tr­íc ®ã (n¨m 1982) Pachun vµ céng sù ®· ph©n lËp ®­îc chñng PG-14 thuéc typ huyÕt thanh H8A,B cã ho¹t lùc cao ®èi víi Êu trïng muçi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti vµ Anopheles sergentti… Do ®ã nÕu chØ dùa trªn ®Æc diÓm typ huyªt thanh th× kh«ng thÓ ®¶m b¶o ®­îc ph©n lo¹i mét c¸ch chÝnh x¸c mµ ph¶i dùa trªn nh÷ng ®Æc ®iÓm kh¸c nhau nh­ líp Cry, thµnh phÇn vµ h×nh d¹ng protein tinh thÓ. Hofte vµ Whiteley lµ nh÷ng ng­êi ®Çu tiªn ®­a ra ý t­ëng ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis dùa trªn sù kÕt hîp cña tÊt c¶ c¸c ®Æc ®iÓm: gen Cry, thµnh phÇn vµ h×nh d¹ng protein tinh thÓ, ho¹t lùc diÖt c«n trïng vµ typ huyÕt thanh. ý t­ëng nµy ®½ ®­îc rÊt nhiÒu nhµ khoa häc h­ëng øng vµ ®­îc sö dông chñ yÕu cho ®Õn nay ®Ó ph©n lo¹i Bacillus thuringiensis var.israelensis. B¶ng 3: §Æc ®iÓm ph©n lo¹i cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis (theo Hofte vµ Whiteley, 1989). Líp gen Cry Thµnh phÇn protein(KDa) H×nh d¹ng tinh thÓ Typ huyÕt thanh Ho¹t lùc diÖt c«n trïng Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D Cyt 135 138 78 67 28 H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H14 H14 H14 H14 H14 Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en 2.3.Protein diÖt muçi cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Sù h×nh thµnh protein tinh thÓ Bacillus thuringiensis th­êng xÈy ra trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö vµ nhiÒu nghiªn cøu gÇn ®©y ®· cho thÊy nã cã liªn quan mËt thiÕt tíi sù cã mÆt cña DNA plasmit. Gen m· ho¸ protein ®éc th­êng n»m trªn c¸c pl¸mid cì lín trªn 3 kb gåm mét phÇn lµ genm· ho¸ protein ®éc vµ phÇn cßn l¹i m· ho¸ protein liªn quan ®Õn tÝnh g¾n. Khi nghiªn cøu c¸c c¸ch chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc ®èi víi c«n trïng thuéc bé hai c¸nh, ng­êi ta thÊy protein ®éc cña chóng bao gåm c¸c tiÓu phÇn protein cã träng l­îng ph©n tö: 130 KDa, 128 KDa, 78 KDa, 6 KDa , 28 KDa do c¸c líp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D vµ Cyt m· ho¸ tæng hîp nªn.§©y còng chÝnh lµ ®Æc ®iÓm quan träng nhÊt ®Ó ph©n biÖt loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis víi c¸c loµi kh¸c. Nhãm Cry4 m· ho¸ tæng hîp c¸c protein tinh thÓ cã träng l­îng 130, 128, 78 vµ 67 KDa, cã kÝch th­íc th«ng th­êng kho¶ng tõ 0.7-1.2 m. Nhãm gen Cry4 m· ho¸ tæng hîp c¸c protein tinh thÓ cã träng l­îng 130, 128, 78vµ 67 kDa cã kÝch th­íc th«ng th­êng ®¹t tõ 0.7-1.2 m. Nhãm gen Cyt bao gåm hai líp CytA vµ CytB th­êng tån t¹i ë c¸c chñng Bacillus thuringiensis mang nhãm gen Cry4 vµ tæng hîp c¸c protein cã träng l­îng ph©n tö kho¶ng 28 kDa. C¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis th­êng tæng hîp c¸c tinh thÓ protein h×nh cÇu chØ g©y ®éc ®èi víi bé c«n trïng hai c¸nh. Tinh thÓ ®éc cña Bti gåm ba lo¹i thÓ vïi protein kh¸c nhau g¾n víi nhau b»ng c¸c líp vá bäc. Mçi thÓ vïi ®­îc b¶o qu¶n bëi mét hay nhiÒu líp nguyªn liÖu gièng thµnh phÇn vá bäc mµ ®©y còng lµ mét ®Æc ®iÓm chØ cã vá Bacillus thuringiensis var.israelensis gióp cho tinh thÓ ®éc vÉn gi÷ ®­îc tÝnh ®éc víi c«n trïng d­íi t¸c dông cña proteaza cïng mét sè ho¸ chÊt kh¸c mµ cô thÓ nh­ sau : Protein 28kDa cã trong thÓ vïi lín nhÊt (chiÕm kho¶ng 40-50% tinh thÓ). Nã thÓ hiÖn râ trªn gen polyarclamide (SDS-PAGE) bëi tÝnh hßa tan cña nã cao h¬n h¼n c¸c protein kh¸c. §èi víi protein nµy d­íi t¸c dông cña enzyme proteaza, nã bÞ thuû ph©n thµnh protein cã träng l­îng chØ cßn lµ 25kDa vµ ho¹t tÝnh diÖt Êu trïng muçi rÊt thÊp. Protein 67kDa cã trong thÓ vïi líp thø hai chiÕm kho¶ng 15-20% tinh thÓ. Còng gièng nh­ tiÓu phÇn 28 kDa th× protein nµy còng bÞ thuû ph©n thµnh c¸c tiÓu phÇn nhá h¬n 31kDa, 35kda bëi enzyme proteaza vµ ho¹t tÝnh ®èi víi Êu trïng muçi còng kÐm. Cuèi cïng c¸c protein 128kDa vµ 135kDA cã trong thÓ vïi nhá nhÊt, bÞ ph©n huû thµnh c¸c nh©n ®éc 58-73 kDa d­íi t¸c dông cña proteaza nh­ng cã ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi cao nhÊt. HiÖn nay protein nµy ®ang ®­îc tËp trung nghiªn cøu nhiÒu nhÊt vµ ng­êi ta cho r»ng hai protein nµy lµ thµnh phÇn quan träng ®èi víi ho¹t lùc diÖt Êu trïng cña tinh thÓ. C¸c thö nghiÖm thùc tÕ b»ng c¸ch t¸ch riªng rÏ tõng lo¹i protein tinh thÓ cña Bacillus thuringiensis var.israelensis cho thÊy r»ng c¸c protein 28, 67, 128, 135 kDa ®Òu cã ho¹t tÝnh ®éc ®èi víi Êu trïng muçi. Tuy nhiªn , Chichott vµ Ellar ®· chøng minh r»ng viÖc sö dông c¶ 4 lo¹i protein tinh thÓ sÏ cho hiÖu qu¶ cao h¬n do cã sù t¸c ®éng qua l¹i gi÷a 2 hay nhiÒu protein. B¶ng 3: So s¸nh ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi Aedes aegypti cña protein riªng rÏ vµ hçn hîp protein ( theo Chichott vµ Ellar ,1988 ) ChÕ phÈm LC50 (g/ml ) Hçn hîp tinh thÓ 0,32 Tinh thÓ hoµ tan 1,0 Protein 130 kDa 32,0 Protein 67 kDa 4,0 Protein 28 kDa 115,0 PhÇn III . C¬ chÕ g©y ®éc cña protein tinh thÓ do Bacillus thuringiensis var.israelensis tæng hîp Knowles ®· nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña mét sè chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis lªn tÕ bµo c«n trïng th× cã thÓ thÊy r»ng c¬ chÕ ho¹t ®éng cña tinh thÓ ®éc chñ yÕu diÔn ra trong ruét cña c«n trïng. Bëi khi nuèt ph¶i tinh thÓ (hay gäi lµ tiÒn ®éc tè) d­íi t¸c dông cña pH cao vµ enzyme proteaza cña ®­êng ruét mµ tinh thÓ ®­îc hoµ tan, thuû ph©n vµ ho¹t ho¸ thµnh c¸c nh©n ®éc cã ho¹t tÝnh. Sau ®ã c¸c nh©n tè ®éc nµy b¸m dÝnh lªn tÕ bµo th­îng b× ruét, lµm ph¸ huû cÊu tróc tÕ bµo ruét vµ t¹o nªn c¸c lç rß rØ. V× vËy, trong ruét c«n trïng cã sù chªnh lÖch ¸p suÊt thÈm thÊu gi÷a ruét c«n trïng víi m«i tr­êng ngoµi t¹o ®iÒu kiÖn cho c¸c ion còng nh­ n­íc khuÕch t¸n tõ ngoµi vµo g©y nªn sù ph×nh cña tÕ bµo ruét. Cuèi cïng c«n trïng ngõng ¨n sau 1 giê vµ sau 4 giê xö lý th× c«n trïng trë nªn chËm ch¹p vµ chÕt h¼n sau 6 giê. PhÇn IV .H­íng më Gen Cry4 ®­îc cÊu thµnh tõ nhãm gen kh«ng ®ång nhÊt gåm c¸c gen Cry4A, B, C, D m· hãa cho sù tæng hîp c¸c protein cã träng lu¬îng ph©n tö kh¸c nhau 133,4 kDa ;127,8kDa; 77,8kDa vµ 72,4kDa. Hai gen Cry4A, Cry4B m· ho¸ tæng hîp protein cã träng l­îng ph©n tö xÊp xØ 130kDa. Protein nµy d­íi t¸c dông cña enzyme protease sÏ ph©n gi¶i thµnh c¸c nh©n tè ®éc 53-67 kDa cã ho¹t lùc diÖt muçi rÊt cao. VÞ trÝ ph©n gi¶i cña protein nµy vÉn ch­a ®­îc x¸c ®Þnh. Gen Cry4C m· hãa tæng hîp protein 77,8 kDa vµ mét sè t­¬ng ®ång víi ®Çu 5’ cña gen Cry4A, Cry4B. Khi g¾n gen nµy vµo vi khuÈn Bacillus sudtilÝ hoÆc mét trong thÓ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®ét biÕn kh«ng ®éc th× gen nµy trùc tiÕp tæng protein ®éc tè 58 kDa, t­¬ng tù protein ®éc tè 58kDa cña Bacillus thuringiensis var.israelensis. Gen Cry4D m· hãa tæng hîp protein 72,4 kDa lµ thµnh phÇn chñ yÕu trong tinh thÓ cña Bacillus thuringiensis var.israelensis . D­íi t¸c dông cña enzyme protease, protein nµy ph©n gi¶i thµnh nh©n ®éc30 kDa vµ vÞ trÝ ph©n gi¶i còng ch­a ®­îc x¸c ®Þnh. Gen Cry4A, B, C cã sù t­¬ng ®ång rÊt lín, trong khi ®ã møc ®é t­¬ng ®ång víi gen Cry4D rÊt thÊp. C¸c gen Cry4A, B, C, D ph©n lËp tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®Òu ®· ®­îc nghiªn cøu biÕn n¹p riªng rÏ vµo E.coli. C¸c thÓ t¸i tæ hîp mang c¸c gen Cry ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp protein ®éc tè nh­ng chØ cã protein do gen Cry4B cã tÝnh ®éc cao ®èi víi Êu trïng. Bacillus megaterium còng ®­îc sö dông nh­ chñng chñ ®Ó biÕn n¹p gen Cry4D, tæng hîp protein 70 kDa. Tuy nhiªn tÝnh ®éc cña thÓ t¸i tæ hîp vÉn thÊp h¬n chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis ban ®Çu. Nh÷ng thÓ t¸i tæ hîp Bacillus thuringiensis var.israelensis (chñng ®ét biÕn kh«ng cã tinh thÓ, kh«ng ®éc) mang gen Cry4D tæng hîp protein 70 kDa cña chñng Bacillus thuringiensis morrisoni Pg14 biÓu hiÖn tÝnh ®éc cao. Gen Cry4D còng ®· ®­îc t¸ch vµ biÓu hiÖn trong tÕ bµo Bacillus subtilis vµ Bacillus sphaericus 2362. §iÒu ®¸ng chó ý lµ khi thö nghiÖm ®éc tè cña thÓ t¸i tæ hîp víi Aedes aegypty th× kÕt qu¶ thu ®­äc cho thÊy ®éc tè cña thÓ t¸i tæ hîp cã tÝnh ®éc gÊp 100 lÇn so víi chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis. Thùc chÊt sù t¨ng tÝnh ®éc mét c¸ch bÊt th­êng cña thÓ t¸i tæ hîp nµy lµ do mét m×nh protein 128 kDa hay lµ cã sù t­¬ng t¸c gi÷a protein nµy víi thµnh phÇn bµo tö cña hai chñng Bacillus subtilis vµ Bacillus sphaericus 2362 ®Õn nay vÉn ch­a ®­îc lý gi¶i. DelÐcluse cïng céng sù (1993) ®· tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen Cry4A, B trªn chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis t¸i tæ hîp 4Q2-81. KÕt qu¶ cho thÊy chñng t¸i tæ hîp khi mang gen Cry4B th× s¶n sinh c¸c thÓ vïi nhá h¬n so víi chñng gèc cßn khi mang gen Cry4A th× hÇu nh­ kh«ng nh×n thÊy thÓ vïi. Tuy nhiªn dÞch nu«i cÊy bµo tö trong c¶ hai tr­êng hîp ®Òu g©y ®éc ®èi víi Êu trïng muçi. Kh«ng chØ dõng ë viÖc biÓu hiÖn gen Cry4 trªn c¸c chñng vi khuÈn, nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi ®· tiÕn hµnh biÓu hiÖn gen m· hãa protein diÖt muçi trªn t¶o lam.§©y lµ mét h­íng nghiªn cøu cã rÊt nhiÒu triÓn väng ®èi víi viÖc s¶n xuÊt chÕ phÈm bëi v× nã sÏ kh¾c phôc ®­îc nh÷ng nh­îc ®iÓm cña chÕ phÈm th«ng th­êng nh­ : l¾ng nhanh trong m«i tr­êng n­íc dÉn tíi hiÖu qu¶ tiªu thô cña Êu trïng muâi khong cao, nhanh chãng mÊt ho¹t l­c bëi tia tö ngo¹i trong ¸nh n¾ng mÆt trêi… Nh÷ng nghiªn cøu ban ®Çu ®èi víi chñng t¶o lam Anabaena PCC7120 cho thÊy tao lam ®­îc chuyÓn gen m· hãa protein diÖt muâi thu ®­îc tõ c¸c chñng Bti cã thÓ giÕt t¬i 91% sè Êu trïng muçi Aedes aeggypti ®em ®i thö nghiÖm trong vßng 24 giê. Khi tiÕn hµnh chuyÓn gen Cry4A, Cry11A vµo t¶o lam Anabaena PCC7120 (mét nguån thøc ¨n quan träng cña Êu trung muçi )th× htÊy ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi vÉn ®­îc b¶o vÖ khái ¶nh h­ëng cã h¹i cña tia UV-B trong ¸nh s¸ng mÆt trêi (nh÷ng tia tö ngo¹i cã b­íc sãng 280-330nm vµ kh«ng bÞ h¸p thô bëi tÇng ozone ). Ngoµi viÖc nghiªn cøu t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen Cry4 cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis , c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn viÖc biÓu hiÖn cña gen Cry4 còng ®­îc nghiªn cøu. Theo b¸o c¸o gÇn ®©y nhÊt cña Trung t©m Quèc tÒ vÒ c«ng nghÖ Gen vµ c«ng nghÖ sinh häc (ICGEB) th× sù biÓu hiÖn cña gen Cry4 ®­îc biÓu hiÖn cña gen Cry4A bÞ ®iÒu khiÓn bái nh÷ng nh©n tè dinh d­ìng nh­ glucose vµ phosphat v« c¬ th«ng qua con ®­êng ®iÒu hoµ tæng sè cña sù øc chÕ dÞ hãa. Trong vi khuÈn Gram (+) th× sù øc chÕ dÞ hãa bÞ gi¸n tiÕp bëi mät phosphoprotein – Hpr ho¹t ®éng nh­ lµ mét ph©n tè ®iÒu hßa phiªn m· trong suèt qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen. Nghiªn cøu vÒ sù phosphoryl hãa vµ dophosphoryl hãa phô thuéc glucose vµ mèi t­¬ng quan víi sù biÓu hiÖn cña gen Cry4A còng ®· ®­îc tiÕn hµnh. ThÝ nghiÖm víi chñng Bti ®ét biÕn kh«ng s¶n sinh Hpr th× thÊy chñng nµy Ýt nh¹y c¶m víi glucose vµ phosphat v« c¬ h¬n so víi chñng gèc ban ®Çu. HiÖu qu¶ ®­îc quan s¸t ë c¸c møc ®é protein vµ mRNA ®· chøng minh r»ng sù phosphoryl hãa Hpr gi÷ mét vai trß quan träng trong sù øc chÕ glucose trong suèt qu¸ tr×nh biÓu hiÖn cña gen Cry4A. KÕt luËn Do thêi gian lµm tiÓu luËn cßn nhiÒu h¹n hÑp, cïng víi kiÕn thøc cßn nhiÒu h¹n chÕ nªn tiÓu luËn cña em cßn nhiÒu thiÕu sãt kh«ng tr¸nh khái. Em mong thÇy chØ b¶o tËn t×nh, gióp em söa ch÷a c¸c sai sãt Êy ®Ó em cã thªm nh÷ng kiÕn thøc bæ Ých vÒ Bacillus thuringiensis nãi chung vµ Bacillus thuringiensis var.israelensis nãi riªng. Em xin ch©n thµnh c¶m ¬n ! tµi liÖu tham kh¶o 1. Ng« §×nh Quang BÝnh, NguyÔn Quúnh Ch©u, NguyÔn V¨n Th­ëng, NguyÔn ¸nh NguyÖt, TrÞnh ThÕ C­êng, Ng« §×nh Anh TrÝ, Jasser Mohamad Jamil, NguyÔn Hoµi Tr©m, 2000. Nghiªn cøu sù ph©n bè vµ ®a d¹ng sinh häc cña B.thuringiensis ph©n lËp tõ mét sè tØnh ë ViÖt Nam. Nh÷ng vÊn ®Ò nghiªn cøu c¬ b¶n trong sinh häc. NXB §¹i häc Quèc gia Hµ Néi. 2. NguyÔn L©n Dòng, 1981. Vi sinh vËt häc. NXB khoa häc kü thuËt. 3. Vâ ThÞ Thø vµ céng sù, 1999. Ph©n lËp vµ tuyÓn chän chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc cao víi Êu trïng muçi Aedes Aegypti. Héi nghÞ C«ng nghÖ Sinh häc toµn quèc. 4.Hofte.H and Whiteley H.R, 1989. Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. Microbiol.Rev. Môc lôc