Tổng quan về Chitosan và ứng dụng trong bảo quản thịt cá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BM CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ-THỦY SẢN ************************** CHUYÊN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT Giaùo vieân höôùng daãn: ThS. Nguyeãn Thò Hieàn Sinh vieân thöïc hieän : HC07SH Tháng 06/2011 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỊT Thịt 1.1 Khái niệm về thịt Thịt là một trong những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Từ thịt có thể chế biến ra nhiều món ăn thơm ngon và giàu chất bổ. Lượng thịt và các loại thịt được sử dụng trong bữa ăn hàng ngày phản ánh mức sống của xã hội. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại thịt, nhưng phổ biến vẫn là thịt lợn, thịt gà và thịt bò. Thịt gia súc, gia cầm là tổ hợp các loại mô khác nhau như mô cơ, mô mỡ, mô sụn, mô xương … Giá trị của thịt phụ thuộc vào tỉ lệ giữa các mô và chất lượng của chúng. Căn cứ váo cấu tạo thịt được phân thành các loại: bì(da), thịt nạc, thịt mỡ và xương. Về cấu tạo thịt gia súc, gia cầm là giống nhau, nhưng cấu trúc protein trong thịt gia cầm đơn giản hơn, các bó sợi cơ nhỏ ngắn hơn, mô liên kết trong thịt gia cầm ít hơn trong thịt gia súc. Mô mỡ của gia cầm ít xen kẽ giữa các mô cơ và trong thành phần của thịt nạc.[1] 1.1.1. Thành phần dinh dưỡng của thịt Thịt động vật nuôi sau khi giết mổ gồm có các thành phần hóa học như: nước, protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin. Protein có trong thịt tươi khoảng 15-20%, gồm chủ yếu là protein hoàn thiện. Độ đồng hóa của protein thịt là 96-97% . Do vậy thịt là nguồn cung cấp thức ăn protein quan trọng trong khẩu phần của con người. Lipit trong thịt thường ở dưới da, ở khoang bụng, bao quanh nội tạng và có ở xương. Hàm lượng chất béo ở dạng là 0,5-50% (tùy thuộc vào từng loại thịt). Thành phần chất béo trong thịt khá phức tạp, chúng được cấu tạo từ các axit béo khác nhau. Các axit béo này tạo nên giá trị chất béo của thịt, tạo nên màu sâu, nhiệt độ nóng chảy và độ đồng hóa khác nhau.Độ đồng hóa mớ động vật phụ thuộc vào độ nóng chảy của các axit béo tạo nên chúng. Thí dụ: Mỡ lợn có nhiệt độ nóng chảy là 34-440C và có độ đồng hóa là 97-98%; mỡ bò nóng chảy ở nhiệt độ là 45-520C có độ đồng hóa là 90%. Gluxit có trong thịt một lượng rất nhỏ (khoảng 0,4-0,8 %) ở dạng glycogen có chủ yếu trong gan. Khi nấu chất này tan trong nước hết. Muối khoáng khá phong phú trong thịt nói chung. Thịt có nhiều mỡ thì ít muối khoáng. Các muối khoáng trong thịt có: Ca, P, Mg, Zn, Co, Cu, Fe, Se … trong đó có nhiều là Ca, P, Mg. Các chất này tập trung ở trong xương là nhiều nhất. Vitamin có ở trong thịt như vitamin A, B1 , PP, C, B12… Lượng vitamin có thể ở phụ tạng như gan, thận, tim ,não. [1] Giới thiệu khái quát thành phần hóa học của một số loại thịt. Loại thịt  Nước (%)  Protein (%)  Lipit (%)  Chất khoáng (%)  Năng lượng (Kcal)   Thịt bò  75,8  21,0  3,0  1,2  285   Thịt lợn  72,9  21,5  37,5  1,1  406   Thịt bê  78,2  20,0  0,5  1,3  87   Thịt gà  65,6  20,3  13,1  1,0  205   Thịt ngỗng  46,1  14,0  39,2  0,7  422   Thịt vịt  35  11,4  53,0  0,5  540   1.1.2. Cấu trúc của thịt Phụ thuộc vào vai trò ,chức năng và thành phần hóa học ,người ta chia thịt thành các loại mô như sau: mô cơ, mô liên kết , mô xương , mô mỡ, mô máu. Mô cơ: Đây là loại mô chiếm tỉ lệ cao nhất trong cấu tạo của thịt. Nó bao gồm nhiều sợi tơ cơ xếp thành bó, các sợi cơ được cấu tạo từ miozin hoặc actin. Chức năng chủ yếu của nó là thực hiện hoạt động co giản . Thành phần hoá học của mô cơ : nước chiếm tỉ lệ: 72%-75% , protein: 18%-21%. Còn lại là các thành phần khác: glucid, lipit, khoáng, vitamin… mô liên kết: Đây là loại mô được phân bố rộng rãi có vai trò liên kết các sợi tơ cơ ,các bó cơ lại với nhau ,tạo cấu trúc chặt chẽ cho thịt . mô mỡ: Mô mỡ được tạo thành từ các tế bào mỡliên kết với nhau dưới dạng lưới xốp. Lượng mô mỡ trong cấu trúc thịt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống loài, giới tính và điều kiện nuôi dưỡng. Các kiểu hư hỏng của thịt trong giai đoạn trước và sau thu hoạch 1.2.1 giai đoạn của thịt trước và sau thu hoạch Động vật sau khi chết, các tính chất quan trọng của thịt đều thay đổi căn bản.Sự trao đổi chất trong các mô chết ngừng lại và những quá trình hóa sinh thuận nghịch bởi enzyme chuyển thành những quá trình không thuận nghịch. Các quá trình tổng hợp bị đình chỉ và hoạt động phá hủy của các enzyme nổi lên hang đầu. Dựa vào những biểu hiện bên ngoài, ta có thể chia sự biến đổi của thịt sau khi chết thành ba thời kỳ chính: quá trình tê cứng, quá trình tự phân và quá trình phân hủy thối rữa. Quá trình tê cứng: Ngay sau khi chết, mô cơ thịt tươi nóng bị suy yếu, có độ ẩm nhỏ, môi trường pH gần 6,8 mùi thơm và vị thể hiện không rõ ràng. Sau khi động vật đình chỉ sự sống trong mô cơ sự tê cóng sẽ bắt đầu Biểu hiện bên ngoài cứng và có sự co ngắn của mô cơ. Thời gian tê cứng diễn ra phụ thuộc vào đặc tính con vật và nhiệt độ môi trường. Thịt bò ở nhiệt độ 15 - 18o C sự tê cóng hoàn toàn bắt đầu xảy đến sau 10 - 12 giờ, ở nhiệt độ gần 0oC diễn ra sau 18 - 24 giờ. Vào lúc này độ rắn của thịt tăng khoảng 25%, thịt như thế có độ rắn lớn kể cả sau khi nấu. Tê cóng sau khi chết của bắp cơ là kết quả của sự phát triển các quá trình hóa sinh phức tạp do enzyme mà đặc trưng của nó khác với các quá trình khi sống. Đó chủ yếu là các quá trình phân giải: glycogen, creatinphosphat, adenosintriphosphat, sự tạo thành phức actomyosin … Quá trình tự phân (chín tới) của thịt Chín tới đó là tập hợp những biến đổi về tính chất của thịt, gây nên bởi sự tựphân sâu sắc, kết quả là thịt có được những biểu hiện tốt về hương thơm và vị,trở nên mềm mại tươi ngon, so với thịt ở trạng thái tê cứng, có độ ẩm lớn hơnvà dễ bị tác dụng của enzyme tiêu hóa hơn. Tốc độ phát triển quá trình tự phân trong thịt không những phụ thuộc vào nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào loài, tuổi, bộ phận trên súc thịt và trạng thái động vật trước khi giết. Quá trình tự phân có thể điều chỉnh được bằng cách thay đổi nhiệt độ bảo quản. Nhiệt độ 1 - 2oC thời gian chín tới hoàn toàn khoảng 10 -14 ngày ; nhiệt độ 10 - 15oC khoảng 4 - 5 ngày ; nhiệt độ 18 - 20oC khoảng 3 ngày. Thịt bảo quản 4 ngày đêm ở 16 - 18oC hoặc 6 ngày đêm ở 8 - 10oC có tính chất cảm quan tương tự thịt bảo quản 14 ngày ở 0oC Quá trình chín tới sinh ra acid lactic, làm giảm môi trường pH xuống khoảng 5 - 6 , hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật có tác dụng tốt đến quá trình bảo quản. Ta có thể dựa vào trị số pH để đánh giá thịt tươi hay không tươi. Trong thực tế, tùy theo mục đích chế biến mà người ta đề nghị thời gian chín tới khác nhau. Thịt dùng để nấu nướng, nên duy trì 10 - 14 ngày ở nhiệt độ 0 - 4oC, khi đó các tính chất cảm quan đạt tới tối thích. Nếu việc chế biến thịt dự định vào thời kỳ đầu của quá trình tự phân (sản xuất xúc xích) hoặc thịt dự định làm lạnh đông, thì duy trì trong thời gian 24 - 48 giờ là đủ. Quá trình phân hủy thối rữa: Sau quá trình tự chín nếu bảo quản không tốt thì đi đến quá trình thối hỏng. Giai đoạn thối rữa do vi sinh vật gây nên, các vi sinh vật hoạt động tạo ra các men phân hủy protein, lipid thành các hợp chất Indol, NH3 , H2S … Sự nhiễm vi sinh vật ở thịt khi động vật còn sống không đáng kể, chủ yếu là do sự nhiễm vi sinh vật trên bề mặt sau khi giết mổ. Mức độ nhiễm vi sinh vật tùy thuộc vào điều kiện vệ sinh khi giết mổ và bảo quản. Vận tốc xâm nhập của vi khuẩn hiếu khí vào lớp sâu 2 ÷ 10cm trong thịt dao động vào khoảng 1 ÷ 2 ngày ở nhiệt độ phòng ; vào lớp sâu 1cm sau 20 ngày ở nhiệt độ 0oC. Sự phân hủy thịt diễn ra theo hai hướng: từ ngoài vào do các vi sinh vật hiếu khí và từ trong ra do các vi sinh vật kỵ khí Sự phân hủy protein là nguyên nhân làm ẩm ướt bề mặt và xuất hiện chất nhầy,đồng thời với sự tiết chất nhầy trên bề mặt thịt phân hủy, màu sắc, mùi, độ chắc và các chỉ tiêu khác của thịt cũng bị biến đổi. Thịt màu đỏ đầu tiên chuyển sang màu nhợt nhạt rồi sang màu xanh nhạt. Các dấu hiệu phân hủy thối rữa ở các mô khác nhau xuất hiện vào các thời kỳ khác nhau. Độ bền vững đối với sự phân hủy thối rữa của các mô tăng lên theo thứ tự như sau: mô máu, mô cơ, mô mỡ, mô liên kết. [1] 1.2.2 Các dạng hư hỏng của thịt Thịt là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sự nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm có thể do động vật bị bệnh, do điều kiện vệ sinh khu vực giết mổ … các vi khuẩn và bào tử nấm có thể xâm nhập và gây hư hỏng thịt. Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hư hỏng thịt là nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu. Sự hư hỏng thịt thường thể hiện qua các dạng thối rữa, hóa nhầy, lên men mốc, đổi màu … Sự thối rữa thịt: Phân hủy thối rữa là sự biến đổi phức tạp đặc trưng nhất xảy ra trong thịt. Trong đó sự phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy thối rữa do hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra và được chia làm 3 giai đoạn: -Quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease do vi sinh vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin. -Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric),rượu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol -Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hóa. Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trường mà các hợp chất đó có thể bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ như CO2 , H2O, NH3 , H2S . Trong điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rượu, amin, trong đó có nhiều chất độc và mùi hôi thối. Quá trình thối rữa càng sâu, thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều. Khi đó mô thịt có màu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, cuối cùng nát vữa, pH cũng chuyển từ môi trường acid yếu đến môi trường kiềm. Các chất khí có mùi khó chịu cũng thoát ra và tăng lên dần. Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh như là Bacterium Vulgaris, Bacterium Paecalis … vi khuẩn yếm khí Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Baccillus Putripiciens, Bacillus Postamus ... Sự hóa nhầy bề mặt: Đây là dạng hư hỏng thường gặp ở thịt bảo quản lạnh, nhất là độ ẩm của không khí cao ( trên 90%) sự hóa nhầy gây ra bởi các giống trực khuẩn chịu lạnh, hiếu khí, không nha bào thuộc giống Achromobacter và Pseudomonas. Nhiệt độ tối ưu cho sự hóa nhầy khoảng 2 ÷ 10oC, ẩm độ thấp thì thịt chóng mất nước. Vì vậy nhiệt độ bảo quản thích hợp là từ 0 ÷ 2oC, ẩm độ tương đối của không khí tương ứng là 85 ÷ 90%. Sự lên men chua: Hiện tượng này thường gặp ở thịt không được làm sạch hết máu khi giết mổ và trong nhiều trường hợp không làm lạnh. Vi khuẩn gây ra quá trình này thường trực khuẩn yếm khí Bacillus Putripacens. Sự lên men chua biểu thị bằng sự xuất là hiện mùi chua khó chịu, thịt bị xám và mềm nhũn. Sự mốc thịt: Sự mốc thịt gây ra do sự phát triển của các loài nấm mốc trên bề mặt thịt. Quá trình mốc thường bắt đầu bằng sự xuất hiện trên bề mặt thịt những vết chấm hoặc những mạng tơ có màu trắng, về sau những vết đó lây lan dần và có màu đậm hơn. Nấm mốc thuộc họ Mucoreadae tạo thành những vệt trắng xám, Clasosporium Herbarium tạo thành những vết đen. Nấm Penicillinium tạo thành vết xanh. Nhiều nấm mốc phát triển ngay cả nhiệt độ - 8oC. Nấm mốc phát triển trên bề mặt thịt không làm cho thịt bị biến đổi sâu sắc, tức thời nhưng nó chuẩn bị cho các vi khuẩn thối rữa hoạt động sau này. Sự biến màu: Màu sắc thịt phụ thuộc vào lượng và dạng của myoglobin, một chất màu với nhiều dạng tồn tại khác nhau. Myoglobin có liên quan với việc lưu trữ và vận chuyển oxy trong mô cơ. Nồng độ myoglobin thay đổi giữa các loài và giữa các loại cơ bắp.[3] Khi oxy được đưa vào hoặc khi thịt được tiếp xúc với không khí, myoglobin bị oxy hóa trở thành oxymyoglobin có màu đỏ hồng đào, màu mà người tiêu dùng mong đợi khi mua sản phẩm. Nếu oxy bị khử, oxymyoglobin phục hồi màu myoglobin sẫm trở lại. Trong một khoảng thời gian và dưới điều kiện không khí có thể thay đổi từ vài giờ đến vài ngày, oxymyoglobin tiếp tục bị oxy hóa mạnh hơn tạo thành metmyoglobin. Đây là sắc tố chịu trách nhiệm về sự biến màu nâu của sản phẩm đồng nghĩa với thịt phi thương phẩm (Kerry et al., 2000). Myoglobin và oxymyoglobin là những protein chứa heme trong đó có mặt Fe2+, trong khi metmyoglobin chứa Fe3+. [16]
Hình: Màu sắc của thịt ở các dạng khác nhau của myoglobin 1.3 Các phương pháp bảo quản thịt 1.3.1 Phương pháp xử lý lạnh Là phương pháp tốt để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự hư hỏng của sản phẩm và duy trì đầy đủ các tính chất tự nhiên ban đầu của thịt. Thường sử dụng hai phương pháp xử lý lạnh sau : -Phương pháp làm lạnh thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống nhưng nhiệt độ đó lớn hơn nhiệt độ đóng băng của dịch mô. Nhiệt độ làm lạnh thường dùng là từ 0 - 40C. -Phương pháp lạnh đông thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống thấp hơn điểm đóng băng của dịch mô. Nhiệt độ tốt nhất để lạnh đông thịt bò từ -15 - -200C thịt heo, bê, cừu từ -12 - -150C với độ ẩm từ 80 - 85%. Phương pháp lạnh đông thường ít được sử dụng vì làm giảm chất lượng thực phẩm, không hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên, do tính chất thời vụ của dự trữ và giết mổ gia súc, buộc phải làm lạnh đông thịt để bảo quản lâu dài. Khi bảo quản lạnh trong súc thịt diễn ra các biến đổi vật lý và hóa học của mô cơ cũng như các quá trình vi sinh vật. Thịt trở nên chắc, mùi vị phát triển dần qua giai đoạn chín tới. Màu sắc súc thịt tiếp tục biến đổi do sự oxy hóa hemoglobin và mioglobin. Bảo quản lạnh lâu sẽ diễn ra sự biến đổi hóa học ở mô mỡ do sự thủy phân và sự oxy hóa chất béo. Bên cạnh đó cũng có thể diễn ra hiện tượng ôi thịt do vi sinh vật, dấu hiệu phát triển vi sinh vật trên súc thịt là sự xuất hiện dịch nhầy, nấm mốc … Để kéo dài thời gian bảo quản thịt lạnh, có thể phối hợp với các biện pháp như :dùng khí cacbonic, khí ozon, tia tử ngoại và chất kháng sinh. Thời gian bảoquản thịt lạnh ở nhiệt độ 00C với nồng độ khí CO2 từ 10 - 20% đạt khoảng 50 ngày, tăng gần 2 lần so với bảo quản trong không khí. Thời gian bảo quản thịt lạnh phối hợp với sử dụng khí ozon đã tăng lên gấp rưỡi so với bảo quản thường 1.3.2 Phương pháp ướp muối: Ướp muối thịt để bảo quản là phương pháp cổ truyền được sử dụng nhiều trong nhân dân. Có thể ướp kéo dài từ vài ngày đến vài tuần hoặc ướp thời gian ngắn(vài giờ). Có thể ướp muối khô hoặc ướp muối ướt hoặc phối hợp cả hai cách.Có thể kết hợp ướp muối với bảo quản lạnh để kéo dài thời gian bảo quản.natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, … Nguyên liệu dùng để ướp muối là NaCl, các chất phụ gia (natrinitrat, kalinitrat,natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, … Tác dụng của muối ăn là làm cho thịt mặn, nâng cao tính chất bền vững của sản phẩm khi bảo quản, xúc tiến các quá trình oxy hóa các thành phần trong thịt làm cho sản phẩm thay đổi màu. Ngoài ra còn tạo áp suất thẩm thấu và giảm độ ẩm của sản phẩm, giảm tỷ lệ oxy hòa tan trong môi trường làm ức chế các vi sinh vật hiếu khí. Trong quá trình ướp muối thường xảy ra một số hiện tượng làm giảm chất lượng sản phẩm như sự mất nước và mất một số thành phần protid tan của thịt. Mức độ ngấm muối phụ thuộc vào tính chất của thịt, nồng độ muối, nhiệt độ và thời gian ướp muối. Thịt nạc thường ngấm muối nhanh hơn thịt mỡ. 1.3.3. Phương pháp xông khói: Xông khói thịt có thể tiến hành ở các khoảng nhiệt độ : từ 18 ÷ 200C gọi là xông khói lạnh ; từ 35 ÷ 500C gọi là xông khói ấm ; từ 70 ÷ 1200C gọi là xông khói nóng. Các chế độ nhiệt của quá trình xông khói có ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do có nhiều biến đổi sâu sắc trong thịt. Nhiên liệu để tạo khói là gỗ, mùn cưa, vỏ bào của các loại gỗ có hương thơm như sồi, trầm, ổi, mít, …không dùng gổ có nhựa như thông vì trong khói có nhiều bồ hóng làm cho sản phẩm có màu sẫm và vị đắng. Độ ẩm nhiên liệu khoảng 30%, nhiệt độ lò đốt 300 ÷ 3500C thì cho khói tốt nhất (khói có màu vàng sẫm). Tác dụng bảo quản của khói chủ yếu là do các hợp chất phenol. Nó được hấp thu chọn lọc và thấm sâu vào súc thịt. Mô mỡ hấp thu nhiều hơn mô cơ. Thịt có độ ẩm cao hấp thu nhiều hơn thịt có độ ẩm thấp. Khói có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn làm hỏng thịt, chống oxy hóa thành phần chất béo không no trong thịt, cải thiện mùi, vị, màu sắc của thịt. 1.4 hệ vi sinh vật trên thịt 1.4.1 nguồn lây nhiễm Sản phẩm thịt tươi lấy từ mô khoẻ được coi là vô trùng và sự lây nhiễm vi sinh vật có hai nguồn chính: - Do bản thân vật: do vật bị ốm, bị bệnh… vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật kí sinh phát triển trên vật đó nên khi mổ xẻ thì lây sang mô thịt. Thức ăn mà các gia súc ăn trước khi giết mổ cũng là nguồn lây nhiễm vi sinh vật từ bên trong cho thịt. - Do môi trường bên ngoài: trong quá trình giết mổ, pha chế, vận chuyển, chế biến. Da và lông có lượng vi sinh vật lớn, ngoài ra có hệ vi sinh vật đường ruột (106-108 tb/kg), khi giết mổ thì vi sinh vật lây nhiễm vào cơ thịt. Trong quá trình vận chuyển vi sinh vật trong đất, không khí, nước, dụng cụ, áo quần công nhân lây nhiễm sang thịt. Trong quá trình sơ chế, chế biến nếu thanh trùng không kỹ thì dạng bào tử vi sinh vật vẫn còn trong sản phẩm thịt, nếu môi trường tốt và có đủ điều kiện bào tử sẽ phát triển thành sợi dinh dưỡng vì vậy thịt cũng bị lây nhiễm. Hay do nguyên liệu ban đầu đã bị nhiễm vi sinh vật. 1.4.2 hệ vi sinh vật trên thịt Vi sinh thấy ở thịt chủ yếu trên bề mặt miếng (hoặc xúc thịt) và dần phát triển tăng số lượng đặc biệt là những miếng thịt giữ ở điều kiện nóng ẩm làm cho số lượng tăng lên nhanh, làm cho thịt chóng bị hư hỏng. Ở đây thường gặp các loại mốc thuộc các giống Cladosporium, Sporotrichum, Oospora (Geotrichum), Thamnidium, Mucor, Penicillium, Antrnaria, Monilia… các giống vi khuẩn Bacillus subtilis, B.mesentericus, B. mycoides, B. megatherium, Clostririum sporogenes, Cl. Putrificus, các dạng khác nhau của cầu khuẩn, các dạng Coliform, Bacterium faecalis ancaligenes, Proteus vulagaris, Pseudomonas liquefaciens, Micrococcus anaerobis… trong các số vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ thấp có Achromobacter, Pseudomonas. Một số nấm men cũng thấy ở thịt. Các vi khuẩn gây bênh cho người có thể thấy ở đây như Brucella, Sulmonella, Streptococcus, Staphyloccus, Mycobacterium tuberculosis……[3] 1.4.3 bệnh liên quan tới vi sinh vật trên thịt Một số bênh của gia súc có thể chuyển qua người như bênh thương hàn, phó thương hàn, bệnh lỵ trực trùng, bệnh tả, bệnh lở mồm long móng, bệnh tai xanh ở lợn, bệnh lao bò, bệnh nhiệt thán (bệnh than), bệnh bò điên, bệnh cúm gia cầm … Các bện này do tác nhân là vi sinh vật có thể truyền từ vật sang người thành bệnh hoặc thành dịch bệnh. [3] 1.4.4 vi sinh vật gây thối 1.4.4.1 Các vi sinh vật tham gia vào quá trình gây thối [2] Các loài vi sinh vật gây thối có enzyme hỗn hợp Loài vi sinh vật thuộc nhóm này có khả năng phân hủy không chỉ protit mà còn phân hủy cả gluxit và lipit. Thông thường các loài vi sinh vật có enzyme hỗn hợp thường phát triển và phân hủy các thành phần dinh dưỡng trên thịt trước. sau đó là sự phát triển của các vi sinh vật khác. các loài vi sinh vật gây thối có enzyme đơn Loài vi sinh vật thuộc nhóm này chỉ có khả năng sinh tổng hợp một vài loại enzyme riêng biệt và chỉ có thể thực hiện một vài phản ứng riêng rẽ. chúng thường phát triển và thực hiện các phản ứng gây thối sau khi nhóm các loài vi sinh vật có enzyme hỗn hợp phát triển. Bảng vi sinh vật gây thối Nhóm vi sinh vật  Dạng phân hủy  Kiểu gây thối     Kỵ khí  Hiếu khí   Nhóm vi sinh vật có enzyme đơn  Phân hủy protein  Bacillus putrificus Bacillus Histolytics Bacillus coligenes  Bacillus pyocyaneum Bacillus mensenterucus    Phân hủy peptit  Bacillus Ventriculosus Bacillus orbiculus     Phân hủy axit amin   Bacillus faccalis Alcaligenes Proteus zenkirii   Nhóm vi sinh vật có enzyme hỗn hợp  Phân hủy protein  B. perfrigenes B. sporogenes  Streptococus Straphylococcus Proteus vulgaris    Phân hủy peptit  B. bifidus B. acidophilus B. butyricus     Phân hủy axit amin   B. lactic aerogenes B. aminophilus B. coligenes   1.4.4.2 Diễn biển của quá trình gây thối [2] Giai đoạn gây thối  Vi sinh vật tham gia  Hiện tượng chuyển hóa   Giai đoạn đầu (0 giờ - 24 giờ )  Thịt nhiễm rất nhiều loại khác nhau. Trong đó đáng kể nhất là: Diplococcus Streptococcus Staphylococcus Coli paracoli  Sinh khối vi sinh vật bắt đầu tăng   Giai đoạn 2 (sau 24 giờ)  Streptococcus và staphylococcus có nhiều hơn cả  Gluxit bị phân hủy nen môi trường trở nên axit   Giai đoạn 3 (đến ngày thứ 3)  E.coli phát triển mạnh khống chế các vi sinh vật khác  Hình thành nhiều amoniac, pH được chuyển sang trung tính.    Cuối giái đoạn này lại thấy sự phát triển của nhiều vi sinh vật,xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn rất rõ  Bắt đầu giai đoạn hóa peptone. Thịt mềm, nhớt, pH trở về trung tính và kiềm, bắt đầu có mùi thối   Giai đoạn 4 (đến ngày thứ 5)  Giai đoạn phát triển nhiều vi khuẩn kỵ khí. Trong đó thấy B. perfrigenes phát triển rất nhiều  Thịt có mùi ammoniac hydrosulfua rất rõ. Gluxit bị phân hủy, lipit bị xà phòng hóa protit phân hủy mạnh làm tăng pepton   Giai đoạn 5 (tuần lễ thứ 2)  Vi sinh vật phát triển mạnh là B. putrificus, Proteus vulgari  Bắt đầu quá trình thối rữa. Hàm lượng peptone và axit amin đều tăng. Ngoài ra còn thấy có NH3, axit béo tự do, phenol, indol, skatol mercaptan.   Giai đoạn 6 (tuần lễ thứ 3)  Vi khuẩn kỵ khí chuyển thành nha bào  Hiện thượng thịt thối ở mức độ cao nhất. Amoniac tạo thành ức chế nhiều loài vi sinh vật. Khối thịt trở nên nhão   2 Chitosan 2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn.Do đó, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, và phương pháp hoá học để biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp nhiều khó khăn.[6] Còn chitosan chính là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn,xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan được xem là polymer tự nhiên quan trọng nhất. Với đặc tính có thể hoà tan tốt trong môi trường acid, chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm ... Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất của cấu trúc quang học…Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan đã được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược ,y học, xử lý nước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, hay tác nhân ổn định… Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng,chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan.[5]
Hình: 1)Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose Như hình vẽ trên, thì sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và cellulose là nhóm amin (-NH2) ở vị trí C2 của tritosan thay thế nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose. [10] Chitosan tích điện dương do đó nó có khả năng liên kết hóa họcvới những chất tích điện âm như chất béo, lipid, cholesterol, protein và các đại phân tử. Chitin và chitosan rất có lợi ích về mặt thương mại cũng như là một nguồn vật chất tự nhiên do tính chất đặc biệt của chúng như tính tương thích về mặt sinh học, khả năng hấp thụ, khả năng tạo màng và giữ các ion kim loại. 2.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitosan 2.2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [10] Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit.
Công thức cấu tạo của chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin và chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp.[10] 2.2.2 Tính chất lý hoá của chitosan Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng lien quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. [9] 2.2.3 khả năng chống oxi hóa của chitosan Các sản phảm thực phẩm chứa một hàm lượng cao các chất béo chưa bão hòa, dễ bị mất hương vị, tạo mùi ôi. Darmadji và Izumimoto (1994) nhận thấy rằng 1% chitosan thêm vào thịt dẫn đến một sự suy giảm 70% trong 2-thiobarbituric acid (TBA) giá trị sau 3 ngày kể từ ngày lưu trữ ở 4 0C.[15] Thịt bò băm được xử lý với 5000 ppm of N-carboxymethylchitosan thì làm giảm 93% giá trị TBA St Angelo và Vercellotti (1989) . Shahidi et al. (1999) nhận thấy cơ chế của quá trình này liên quan tới sự chelation các ion sắt tự do 2.3. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế chính xác của hoạt động kháng VSV của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế được quan tâm:[11] Cơ chế thứ nhất Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài ( tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon, 1999). Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm chống lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn. Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli do mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn. Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm candida albicans. Cả chitosan phân tử lượng 50kDa và 5kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ với ATP chitosan 5kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn.Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh đựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng. Và nó tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+ . Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.03-0.25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối lượng phân tử của chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào.Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan 470 KDalton có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus sp. , trong khi với vi khuẩn Gram âm chitosan có khối lượng 1106 KDalton mới có ảnh hưởng. Hoạt tính kháng khuẩn tăng khi gia tăng nồng độ chitosan. [18] Tóm lại khả năng kháng khuẩn của chitosan đối vi khuẩn Gram âm mạnh hơn so với vi khuẩn Gram dương (Chung et al. 2004; No et al., 2002). Trong khi đó vi khuẩn Gram dương lại nhạy cảm hơn, có thể do vi khuẩn Gram âm có lớp màng chắn bên ngoài (Zhong et al., 2008). [13]
Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên E.coli (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan.
Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên S.aureus (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan.
Hình: E. coli xử lý với 300 mg/l OCNP(hạt nano chitosan) trong 30 min. A. 0 phút, B. 5 phút, C. 15 phút, D. 30 phút (Xing et al., 2009b) Theo Ming Kong và các cộng sự (2008) tất cả các vi khuẩn gram âm có một màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS). trong đó đóng góp vào sự ổn định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation hóa trị hai như vậy như Mg2+ (Hình).Giống như EDTA, chitosan loại bỏ các cation. Việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài.[12] Cơ chế của hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Zheng & Zhu, 2003). Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác động của chitosan trên S. aureus (Gram dương) và Escherichia coli (Gram âm). Đối với S. aureus Gram dương, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan. Bên cạnh đó, với Gram âm E. coli, hoạt động kháng khuẩn tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử. Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của S. aureus, các chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các chất dinh dưỡng đi vào tế bào và, (2) Đối với, E. coli, chitosan trọng lượng phân tử thấp sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa. [14]
Hình : Cấu tạo màng ngoài của vi khuẩn Gram âm

Ảnh hưởng của chitosan đối với E.coli sau 30 phút (kong và các cộng sự 2008) Cơ chế thứ hai Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992).[11] Các cơ chế khác Chitosan kích hoạt một số hàng rào phòng thủ trên tế bào chủ, chitosan tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các emzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, (-1,3-glucanse, từ đó tiêu diệt vi sinh vật. Cơ chế này không còn đúng trong trường hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật. Chitosan hoạt động như một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim loại dạng vết do đó ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trưởng vi sinh vật (Cuero, Osuji, và Washington, 1991b). 2.3. Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N- carboxybutyl chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh. Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những loài này. ở nồng độ 0.1% và pH 5.6 chúng kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin-ß-glucan. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn cao của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự nhiên. Ở pH 5.5, với nồng độ 0.5-1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài S. aureus, E. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở pH 6.5 chỉ có S. aureus bị ức chế ở nồng độ đó trong khi các loài khác vẫn phát triển ở nồng độ 2.5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu)[10]. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan đến các loại vi khuẩn: - (Shahidi et al, 1999.). Wang (1992) quan sát thấy rằng nồng độ chitosan (1-1,5%) ngừng hoạt động hoàn toàn của Staphylococcus aureus sau 2 ngày kể từ ngày ủ ở pH 5,5 hoặc 6,5. -Chang et al. (1989) tìm thấy nồng độ chitosan 0,005% bất hoạt hoàn toàn S. aureus. Điều này đã được tìm thấy bởi Darmadji và Izumimoto (1994)về ảnh hưởng của chitosan trong bảo quản thịt. -Simpson et al. (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan vào sự phát triển của vi khuẩn vào tôm nguyên liệu. Họ tìm thấy vi khuẩn Bacillus cereus bị ức chế bởi chitosan nồng độ 0,02%, trong khi Eschcoli và Proteus vulgaris erichia tăng trưởng tối thiểu tại 0,005% và bị ức chế sự tăng trưởng ở nồng độ lớn hơn 0,0075%. -Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan tăng trưởng E. coli. Wang (1992) sau khi ủ ngày 2 với 0,5% hoặc 1% chitosan ở mức độ pH là 5,5.Nồng độ Chitosan 1% trong nước cũng ức chế hoàn toàn E. coli [10] Một số nghiên cứu đã xem xét tác động của chitosan bất hoạt của một số loại nấm: -EL-Ghaouth et al. (1992b) đã nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan lên sự phát triển của nấm ở quả dâu tây sau thu hoạch.Các tác giả thấy rằng chitosan với 7,2% NH2 làm giảm sự phát triển của Botrytis cinerea và Rhizopus stolonife. -Trong một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, et al EL-Ghaouth.(1992b) đã quan sát các dấu hiệu của nhiễm trùng trong trái cây phủ chitosan sau 5 ngày lưu trữ tại 13OC so với 1 ngày so với một ngày không sử dụng Chitosan. Sau 14 ngày lưu trữ, chitosan phủ (tại 15 mg / ml) giảm sự hư hỏng của dâu gây ra bởi các loại nấm Fang et al. (1994) [10] 2.4 Độc tính của chitosan Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy Chitosan được thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18-21 gam) chia 5 đợt, với liều lượng tăng dần 0,0025-0,020 g/ngày cho mỗi chuột. Theo dõi liên tục trong 72 giờ. Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết. Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02g một ngày cho một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thường. Độc tính cấp Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lượng 9g/kg cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là 250g theo đường uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn. Độc tính tại chỗ Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy chitosan không gây tồn thương các tổ chức, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giản mạch tại chỗ trên thỏ và chuột cống thực nghiệm. Độc tính bán trường diễn Dùng chitosan trên thỏ thực nghiệm, ở dạng bột trộn thức ăn với liều lượng 2g/kg cân nặng, liên tục trong 4 tuần lễ. Theo dõi ảnh hưởng của chitosan trên các chức năng gan, thận và tạo máu, chưa thấy có độc tính bán trường diễn trên thỏ thực nghiệm. Kết quả Chitosan được thử trên xúc vật thực nghiệm( chuột nhắc, chuột cống, thỏ), kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, độc tính bán trường diễn,không ảnh hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trong nước tiểu của súc vật thực nghiệm[21] 2.5 Các chất kết hợp bảo quản 2.5.1 Chitosan và nitrite Youn et al. (1999) khám phá rằng có thể thay 50% nitrite bằng chitosan 0,2 % trong xúc xích hàn quốc. Đối với xúc xích bào quản bằng nitrite nồng độ 150 ppm thì sau 4 ngày lượng vi khuẩn tăng hơn 2 log CFU/g và hơn 3 log CFU/g sau 7 ngày bảo quản ở 300C. Trong khi sử dụng hỗn hợp chitosan và nitrite thì sau 7 ngày lưu trữ ở 300C thì lượng vi khoảng 30 000 đến 120 000 Da thì màu đỏ, hệ nhủ tương, độ cứng của xúc xích vẫn được giữ nguyên, chitosan có trọng lượng phân tử cao có thế ảnh hưởng đến cảm quan [10]. 2.5.2 Chitosan and benzoate Sự kết hợp giữa chitosan và benzoate đã được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bởi (Sagoo et al., 2002b), ba chủng nấm men gây hỏng Sac. exiguus, Scd. ludwigii và T. delbrueckii, đã bị ức chế bởi 0.05 và 0.005% chitosan glutamate và 0.025% sodium benzoate trong dung dịch nước muối 0,9% tại pH 6.2 và 4.5. Phương thức tương tác giữa chitosan và benzoate chưa có nghiên cứu rõ ràng, và đang được nghiên cứu, là một đại phân tử chitosan không thể di vào vách của tế bào nấm men khác với benzoate tác động lên các thành phần nội bào. Các kết quả nghiên cứu trong phòng cần được khẳng định trong thực phẩm trước khi đưa vào thực tiễn sản xuất tận dụng khả năng kết hợp giữa chitosan và benzoate [10]. 2.5.3 Chitosan và sulfite Sulfite là một yếu tố không thể thiếu trong xúc xích thịt lợn vì ngoài khả năng kháng các vi khuẩn Gram âm nó còn mang lại màu hồng có tính cảm quan cho sản phẩm. Do đó các nghiên cứu được xoay quanh vấn đề là lượng sulfite tối thiểu đơn lẻ hoặc kết hợp với chitosan để ứng dụng vào thực phẩm dựa trên các chỉ tiêu vi sinh vật, nấm men, vi khuẩn lactic, các vi khuẩn đường ruột, pH, mùi. Ví dụ như kết quả được minh họa trong hình.
Hình ảnh hưởng của sự kết hợp chitosan 0,6% và 170 ppm sulfite (() và các nồng độ riêng lẻ, kết hợp chitosan và sulfite trên xúc xích thịt lợn tươi ở 40C Roller et al. (2002). Cơ chế của sự bảo quản kết hợp giữa chitosan và sulfite theo 2 bước sau. Thứ nhất chitosan có vai trò phân tán chậm sulfite, do đó giúp ngăn ngừa quá trình thái hóa sớm của sulfite. Thứ 2 chitosan ức chế nấm men thực vật, ngăn ngừa việc tổng hợp acetaldehyde, một chức gây mất hoạt tính đối với sulfite (Roller et al., 2002)[10]. 2.6. Các nghiên cứu bảo quản trên thịt 2.6.1 ứng dụng chitosan bảo quản thịt bò băm [15] Chitosan nồng độ 0,5 - 1,0% ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng trên thịt bò băm ở 300C trong thời gian là 48 giờ và 40C trong thời gian là 10 ngày.Ngoài ra chitosan còn ngăn cản quá trình oxy hóa lipid,tăng tính cảm quan và giữ màu thịt trong thời gian bảo quản. 2.6.1.1 vật liệu phương pháp Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này là Lactobacillus plantarum IAM 1216,Pedicoccus pentosaceus IAM 12296, Micrococcus varians IFO 3765, Staphylococcus aureus IAM 1011, Escherichia coli RB, Bacillus subtilis IFO 3025 và Pseudomonas fragi IFO 3458. Các vi khuẩn này được nuôi trong môi trường dịch triết peptone glucose (YPG) gồm 5g dịch triết nấm men, 10g peptone, 10g glucose 1g Tween 80, 0,1 g L-cystein trong 1 lít nước, pH 6,8 (Nakae etal., 1987). Tác dụng kháng khuẩn của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn với nồng độ 0%, 0.2%, 0.5%, 1% chitosan được xác định bằng máy đo OD bước sóng 660 nm sau 24 giờ trên môi trường YPG lắc chậm ở 300C Thịt bò tươi được mua vào ngày tiến hành thí nghiệm. Thịt được cắt và thái nhỏ thành miếng khoảng 4mm. Cứ 10g thịt sẽ được trộn với chitosan với nồng độ lần lượt 0%, 0.2%, 0.5%, 1% mỗi loại 3 mẫu. Sau đó các mẫu được bọc lại bằng Sarawrap và chia thành 2 lô. Lô thứ nhất ủ ở 300C trong thời gian 0, 12, 24 và 48 giờ. Lô thứ 2 được làm lạnh ở 40C trong thời gian 0, 3, 5 và 10 ngày. Các mẫu này được dùng để phân tích vi sinh vật,xác định giá trị TBA (2-thiobarbituric acid) và VBN (volatile basal nitrogen). Chitosan được thu nhận từ Katokichi Co. Ltd., Japan. Phân tích hóa học TBA được xác định bằng phương pháp chưng cất hơi nước(Ando & Yamauchi, 1968) và được sửa đổi bởi Izumimoto et al. (1990) số mg malonaldehyde/kg thịt. Giá trị VBN đo bằng phương pháp của Conway's method (Kousaka, 1983). Phân tích màu sắc Mỗi 40g mẫu được để trong đĩa petri kích thước 60 x 15 mm (Corning, Iwaki Co. Ltd), ép chặt và bọc lại bằng Saranwrap sau đó đóng đĩa petri. Giá trị màu sắc được đo bằng máy đo màu Minolta (CM-1000, Minolta Co.Ltd) thể hiện qua các giá trị như L* (màu sắc), a* (đỏ), b* (vàng) Phân tích cảm quan Mỗi 40g mẫu đối chứng và mẫu chứa chitosan được cho vào 100g patty( bánh bao)có đường kinh 10cm, dày 1cm chiên trong dầu ở 1900C, mỗi mặt chiên trong 4 phút. Sau đó cắt thành khối nhỏ 1-5 cm. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan ngẫu nhiên 2.6.1.2 kết quả và bàn luận Từ hình ta thấy chitosan (0,01%) ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn gây hỏng như Bacillus subtilis IFO 3025, Escherichia coli RB, Pseudomonas fragi IFO3458 và Staphylococcus aureus IAM 1011. Ở nồng độ cao hơn (0.1 và 1,0%), nó ức chế sự tăng trưởng của Lactobacillus 1216 01:00 plantarium, Pediococcus pentosaceus IAM 12296 và Micrococcus varians IFO 3765
Hình: ảnh hưởng của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn gây hỏng ở 30°C. Trong for 24 giờ. Lp: Lactobacillus plantarum IAM t216 Pp: Pediococcus pentosaceus IAM 12296 My: Micrococcus varians IFO 3765 Pf: Pseudomonasfragi IFO 3458 Sa: Staphylococcus aureus IAM 1011 Ec: Escherichiacoli RB Bs: Bacillus subtilis IFO 3025 Sự tăng trưởng của Staphylococci, Coliform, Gram-negative bacteria,Micrococci và Pseudomonas trên thịt trong thời gian lưu trữ ở 300C và 40C trong 10 ngày thể hiện ở 2 bảng sau Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 300C, 48 giờ
Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 40C, 10 ngày
Giá trị VBN Trong thời gian lưu trữ ở 300C trong 24 giờ và 48 giờ, giá trị VBN của thịt có chứa chitosan thấp hơn so với mẫu đối chứng. Một số vi khuẩn gây hư hỏng như speudomonas tiết ra các enzyme phân hủy protein. Quá trình này có thể làm ảnh hưởng đến sự thối rửa và làm hóa hơi nitơ. Tuy nhiên chitosan cho thấy khả năng kháng sự phát triển của vi khuẩn này
Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên thịt 300C, 48 giờ
Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên thịt 40C, 10 ngày Giá trị TBA Sự thay đổi của giá trị TBA của thịt trong quá trình bảo quản ở 300C chứng tỏ tốc độ oxi hóa lipid trong thịt giảm khi ta bổ xung chitosan vào, giá trị TBA phụ thuộc vào nồng độ của chitosan, ở nồng độ 0.2, 0.5, 1% chitosan giá trị TBA giảm lần lượt 10, 25, 40%. Tại 4oC giá trị TBA giảm khoảng 70% sau 3 ngày bảo quản, sau 10 ngày thì giá trị TBA của mẫu thịt chứa chitosan bằng với giá trị TBA ở 0 ngày, trong khi đó giá trị TBA của mẫu không chứa chitosan lại tăng mạnh. Cơ chế ức chế chitosan trên giá trị TBA vẫn chưa rõ, và hiện đang được nghiên cứu chi tiết hơn trong phòng thí nghiệm. Các mẫu 0 giờ ở 300C và 40C cho giá trị TBA như nhau ở các mẫu có và không có chitosan, điều này làm sáng tỏ chitosan trơ với các chất phản ứng TBA. Nó gợi ý rằng chitosan có tính chất chống oxy hóa, (Pasquel & Babbit 1991) Thịt tôm có chứa chất chống oxy hóa tự nhiên và trong thịt tôm có thể chứa chitosan.
Hình: ảnh hưởng của chitosan đến giá trị TBA trên thịt bảo quản ở 300C trong 48 giờ
Hình: sảnh hưởng của chitosan đến giá trị TBA trên thịt bảo quản ở 40C trong 10 ngày Đặc tính cảm quan Đánh giá cảm quan được tiến hành trên thịt bảo quản ở 40C tại 0, 3, 5, 10 ngày. Như thể hiện ở bảng thịt có chứa chitosan được chấp nhận nhiều hơn thịt không chứa chitosan. Gía trị TBA và VBN thấp cho thấy sự giảm bớt mùi ôi,thối trên thịt có chứa chitosan so với thịt không chứa chitosan. Bảng: cảm quan trên thịt chứa chitosan bảo quản ở 40C, từ 0 đến 10 ngày
Màu sắc Ảnh hưởng của chitosan lên màu của thịt trong thời gian bảo quản tại 300C trong 24 giờ và 40C trong 10 ngày được biểu hiện ở bảng sau.Tại thời điểm ban đầu chitosan không ảnh hưởng tới các giá trị như L* (màu sắc), a* (đỏ), b* (vàng). Trong thời gian bảo quản giá trị L của mẫu chứa chitosan giảm so với mẫu đối chứng, nó có thể do sự cố định nước, làm giảm sự rỷ dịch. Kết quả là làm tăng độ trong suốt và giảm màu sắc. Nhìn chung giá trị a* và b* tăng trong suốt thời gian bảo quản, mẫu đối chứng tăng chậm hơn mẫu chứa chitosan . Quan sát này thấy rằng thịt bò chứa chitosan cho kết quả cảm quan tốt về màu sắc 2.6.2 ứng dụng chitosan bảo quản thịt heo 2.6.2.2 ứng dụng olygoglucosamin từ chitosan để bảo quản thịt heo [4] 2.6.2.2.1 nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Olygoglucosamin là chất màu vàng nhạt, có vị chát, không mùi và có khả năng tan trong nước. Olygoglucosamin là hợp chất hữu cơ được sản xuất từ chitosan, có tính chất tương tự như chitosan, nhưng có một số tính chất khác biệt là tan trong nước.Theo một số tài liệu nghiên cứu gần đây thì olygoglucosamin có một số tác dụng như hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, chống oxy hoá acid béo, chống phát triển của tế bào ung thư, là thực phẩm chức năng và là hoạt chất sinh học mạnh. Thịt heo được giết mổ vào lúc 5giờ sáng, sau đó thịt heo được đem về xử lý lúc 6giờ và phân lô thí nghiệm. Các mẫu thịt heo tươi sống được nhúng trong các dung dịch có các nồng độ lần lượt 0,5%; 1%; 1,5% và 2% Olygoglucosamin với thời gian 3 giây.Thịt được giữ tươi ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ tủ lạnh (8 C÷10 C), tiến hành lấy mẫu theo thời gian: Ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ lấy mẫu một lần, còn ở nhiệt độ dương lạnh thì 24 giờ lấy mẫu một lần. Tiến hành xác định chất lượng cảm quan, vi sinh vật tổng số và NH3. Mẫu đối chứng không xử lý olygoglucosamin, đem giữ tươi và tiến hành như các mẫu thí nghiệm. Xác định chất lượng cảm quan của thịt theo phương pháp cảm quan-Áp dụng theo tiêu chuẩn TCVN3215-79 Xác định hàm lượng NH3 bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước Xác định vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt bằng phương pháp TCVN 5119/90. 2.6.2.2.2 kết quả và bàn luận Ảnh hưởng của olygoglucosamin đến chất lượng cảm quan của thịt heo tươi ở nhiệt độ phòng được trình bày ở đồ thị và bảng: Đ C Q 20 Mẫu đối chứng Olygoglycosamin 0.5 % Olygoglycosamin 1 % Olygoglycosamin 1.5 % Olygoglycosamin 2 % 0 6 12 18 24 giờ Hình : biến đổi điểm cảm quan của thịt theo thời gian ở nhiệt độ phòng Bảng: nhận xét cảm quan thịt tươi có chứa olygoglucosamin ở nhiệt độ phòng Nồng Độ Thời gian  0 đối chứng  0.5%  1%  1.5%  2%   0 giờ  Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc  Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc