Tổng quan về enzyme ngoại bào bacillus subtislis

llus subtilis: có pH tối ưu 6,0; bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 4 và bị mất hoạt tính 50% ở pH = 8. c) Sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis Amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis là một enzyme cảm ứng với cơ chất là tinh bột hay glycogen. Khi trong môi trường có mặt những cơ chất này thì Bacillus subtilis sẽ tổng hợp nên enzyme amylase để thủy phân các cơ chất về các dạng hợp chất có phân tử lượng thấp có thể đi qua màng tế bào. Khi nuôi cấy vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Hai quá trình này không phải bao giờ cũng trùng khớp với nhau về thời gian, nhất là trong phương pháp nuôi cấy chìm. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân (autolysis). Nhiều tác giả cho rằng quá trình tổng hợp enzyme xảy ra trên màng tế bào (Nomura, 1958), và người ta lập luận rằng ở gần màng tế bào tập trung enzyme phân hủy, nó ở trạng thái không hoạt động khi amylase chưa được tạo thành. Khi bắt đầu tổng hợp amylase, enzyme phân hủy trở nên hoạt động và làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tới độ cho phép các phân tử amylase đứt ra ngoài môi trường. Song, thật ra, amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Trong các tế bào được phân hủy sơ bộ bằng lysozyme chỉ chứa một lượng amylase rất nhỏ, không thể đáp ứng được amylase hoạt động mạnh mẽ như vậy. Các yếu tố ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: nồng độ tinh bột tối ưu cho nuôi cấy chìm là 0,5 - 0,7%. Để có hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột. Tuy nhiên, khi sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis thì việc thay tinh bột bằng maltose đã làm khả năng sinh tổng hợp enzyme tăng 50%. Nhưng Srivastava và cộng sự (1981), lại cho rằng isomaltose và panose mới là cơ chất cảm ứng tốt nhất đối với sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis. Nhiều nghiên cứu đã đi đến khẳng định là các loại đường có phân tử nhỏ dễ hấp thụ, không thúc đẩy mà kìm hãm quá trình sinh tổng hợp. Chất kìm hãm điển hình là glucose, người ta gọi là “hiệu ứng glucose”, cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp α-amylase của glucose là do dư thừa các sản phẩm trao đổi chất từ glucose, có trong tế bào vi sinh vật. Các chất này được tích tụ nhanh, do vậy nhu cầu sản sinh các enzyme tạo thành các chất trên là không cần thiết nữa. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen dinh dưỡng: cho nguồn nitrogen nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitrogen hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của amino acid: amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của vi sinh vật tạo enzyme amylase do amino acid có thể vừa là nguồn cacbon, vừa là nguồn nitrogen, vừa là nguồn năng lượng; một số amino acid riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều amino acid khác và trong quá trình chuyển hóa amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme; phosphore ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của vi sinh vật; Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase của Bacillus subtilis, hoạt động, bảo vệ enzyme khỏi tác dụng của protease; lưu huỳnh kích thích tạo amylase; các ion Zn2+ có trong α-amylase của Bacillus subtilis là cầu nối liên kết tạo thành dimer có phân tử lượng 48.000 Da; cobal kích thích tổng hợp amylase; Mn2+, Cu2+, Hg+ kìm hãm sinh tổng hợp amylase. Ngoài ra, sự tiết amylase vào canh trường nuôi cấy bị ức chế hoàn toàn bởi các chất kìm hãm trao đổi chất như cyanide, chloramphenicol, streomysin, toluen, NH4Cl, (NH4)2SO4 và Urea được xác định là những chất kìm hãm hoạt động của enzyme a-amylase. Nhưng khi thêm một số chất hoạt động bề mặt (Tween 20, Tween 40, Tween 60 và Tween 80) và Sodium lauryl sulphate nồng độ 0,02% đã cho kết quả tăng 2 - 15% trong việc sản xuất enzyme. Tóm lại, nguồn carbohydrate, nguồn đạm nếu dư thừa sẽ ảnh hưởng không tốt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích hoặc kìm hãm không đáng kể với sinh tổng hợp α-amylase (acgine, asparagine, proline) và một số khác ức chế hoàn toàn. Việc sử dụng nguồn nitrogen, nguồn carbohydrate nào là việc làm không thể thiếu trong quá trình nghiên cứu. Xác định tỉ lệ thích hợp giữa các nguồn nguyên liệu bổ sung rất cần thiết. Ngày nay nhờ tối ưu hóa thành phần môi trường đã làm cho quá trình nghiên cứu nhanh chóng thu được kết quả hữu hiệu, hoạt độ enzyme tăng rất nhiều. Do áp dụng phương pháp này mà Macximova và cộng sự (1968) đã làm tăng hoạt độ α-amylase của Bacillus diastaticus lên hai lần, Dzavakhia và cộng sự (1978) đã làm tăng lên 40% hoạt độ α-amylase thu nhận từ Bacillus subtilis. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy: hiện nay tồn tại nhiều ý kiến khác nhau về thành phần môi trường nhân giống. Một số tác giả nhận thấy rằng môi trường nhân giống cần phải giàu dinh dưỡng hơn môi trường lên men mới tạo ra được lượng sinh khối nhiều và khỏe cho quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi môi trường nhân giống giàu dinh dưỡng hơn môi trường lên mên thì sinh khối lớn đã ức chế khả năng xâm nhập của vi sinh vật ngoài môi trường vào và hoạt độ enzyme tăng rất mạnh. Nhưng một số nhà nghiên cứu khác cho rằng môi trường nhân giống và môi trường lên men phải là một. Theo Đỗ Thị Giang (1988) cho rằng việc sử dụng môi trường như nhau sẽ rút ngắn được giai đoạn tiềm phát và chu kỳ sản xuất cũng được rút ngắn. Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α-amylase thích hợp nhất là 6,8 - 7,5. Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi Bacillus subtilis là khoảng 35 – 37oC và tối ưu nhất là 37oC vì ở nhiệt độ này Bacillus subtilis sinh trưởng tốt và α-amylase được sinh tổng hợp nhiều. Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt với sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Đối với chủng Bacillus subtilis thì đây là vi khuẩn hiếu khí cho nên trong quá trình nuôi cấy phải tạo điều kiện để cho tế bào tiếp xúc với oxy. Gracheva và cộng sự (1975) đã công bố mức độ thông khí tối ưu là 1m3 môi trường trong một phút đối với chủng Bacillus subtilis nuôi cấy bằng phương pháp chìm, với tốc độ khuấy 200-300 vòng/phút (tương đương với 28mg O2/l/phút). Theo Bùi Thị Phi (2007) chế độ sục khí liên tục và nuôi cấy trong 48 giờ Bacillus subtilis sẽ phát triển và cho enzyme tốt hơn các điều kiện thí nghiệm còn lại. 2.2.2.2. Enzyme protease a) Đặc điểm và cơ chế tác dụng của enzyme protease của Bacillus subtilis Protease của Bacillus subtilis bao gồm protease kiềm và protease trung tính. Protease trung tính của của Bacillus subtilis thủy phân liên kết peptide tạo thành nhóm carboxyl của Ala, serine hay His và nhóm amin của valine (Val), leucine (Leu) hay phenylalanine (Phe). Tính đặc hiệu của protease kiềm của Bacillus subtilis lại khác, nó thủy phân hàng loạt các peptide. Protein được thủy phân ở mức độ nhiều hơn so với protease trung tính. Protease trung tính có trung tâm hoạt động lớn hơn vào khoảng 21Aº, có thể phân biệt thành sáu phần dưới trung tâm hoạt động, mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với một gốc amino acid trong phân tử cơ chất. Protease trung tính thường không ổn định, các ion Ca2+, Na+ và Cl- có tác dụng làm tăng tính ổn định của các enzyme này, khoảng pH tối thích thường hẹp. Ở điều kiện nhiệt độ 37oC, hoạt tính của protease là 100% thì ở nhiệt độ 50oC, sau 30 phút, hoạt tính của enzyme giảm xuống còn 80%. Sau 30 phút, ở nhiệt độ 60oC, hoạt tính chỉ còn 20% và ở 70oC thì chỉ sau 10 phút, enzyme đã bị mất hoạt tính hoàn toàn. Về vai trò của gốc Tyr trong trung tâm hoạt động của các protease trung tính cũng được Tsuru và cộng sự (1970) xác nhận. Các tác giả cho rằng, có thể có 3 gốc Tyr cùng với nguyên tử Zn tham gia trong trung tâm hoạt động của Bacillus subtilis. Năm 1970, Kerry T.Yasunnobu và Jame Mc Cohn đã nghiên cứu và tách chiết protease trung tính từ môi trường nuôi Bacillus subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận thấy đây là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pH tối ưu từ 6,5 - 7,5; nhiệt độ tối ưu là 57oC. Protease này bị ức chế bởi các ion Cu2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+ và Fe2+ còn khi có mặt ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5 - 10. Nedkov (1966) đã xác định được trung tâm hoạt động của Sutilisin, một enzyme protease kiềm từ Bacillus subtilis là: Asp, Gly, Thr, Ser, Met và Ala. Chất kìm hãm và chất hoạt hóa: hoạt tính của một số enzyme protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác. Một số những chất đó có tác dụng làm tăng hoạt tính, còn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt tính của các enzyme. Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp chất tạo phức và nồng độ urea cao. Ngoài ra nó bị kìm hãm bởi EDTA. Protease kiềm của Bacillus subtilis bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ như p-chloromercuribenzoate (PCMB), đây cũng là điểm đặc trưng đối với tất cả các protease kiềm (Govind và cộng sự, 1981). Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân của protease kiềm thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): Acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước acyl hóa. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme. Subtilisin (EC.3.4.21.62) là một protease kiềm. Phân tử subtilisin được tạo nên bởi một chuỗi polypeptide. Subtilisin có một domain bảo thủ với 7 nếp gấp β được bao bọc bởi 9 vòng xoắn α. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ ba truyền thống của serine protease theo thứ tự là Asp-His-Ser. Theo phân tích trình tự DNA mã hóa subtilisin người ta thấy subtilisin được tổng hợp dưới dạng một tiền enzyme, đoạn peptide sau khi được tổng hợp vẫn chưa thực hiện được chức năng của nó và để trở thành dạng hoạt động nó phải trải qua một quá trình cải biến, cắt bỏ phần pre-pro-peptide. Cấu trúc của tiền enzyme gồm: một đoạn peptide được gọi là prepeptide ở đầu N, có vai trò làm tín hiệu để tiết tiền enzyme ngoại bào. Cuối đoạn peptide này chứa trình tự amino acid tín hiệu cho sự phân cắt của peptidase là Ala-Gln-Ala-Ala. Nối giữa đoạn peptide tín hiệu này với đoạn peptide của subtilisin trưởng thành là propeptide. Propeptide đóng vai trò như một enzyme xúc tác quá trình cuộn xoắn tạo cấu trúc có hoạt tính cho subtilisin trưởng thành. Việc cuộn xoắn không gian là bước đầu tiên để tạo thành subtilisin có hoạt tính. Quá trình này phụ thuộc vào propeptide và đòi hỏi phải có ion Ca2+ để làm bền. Subtilisin là nhóm enzyme với 2 đại diện là subtilisin BPN' và subtilisin Carlberg. Trong đó, Bacillus subtilis có khả năng sinh subtilisin BPN'. Subtilisin BPN' và subtilisin Carlberg khác nhau 58 amino acid nhưng chúng hoạt động tối ưu ở cùng một điều kiện là 60°C và pH 10 (Smith và cộng sự, 1968; Phadarate và cộng sự, 1997; Siezen và Leunissen, 1997). Khác với subtilisin Carlberg độ bền của subtilisin BPN' lại phụ thuộc vào Ca2+. Subtilisin BPN' còn là một enzyme ngoại bào nên có thể dễ dàng thu hồi và tinh sạch hơn các enzyme nội bào, do vậy việc ứng dụng enzyme này ngày một phổ biến. Subtilisin BPN' là một serine protease ngoại bào và là một lớp enzyme đại diện lớn nhất của serine protease có cấu trúc đặc trưng là α/β/α và trung tâm hoạt động gồm Ser221, His64, Asp32. Cấu trúc không gian ba chiều của chúng bền vững trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ (Siezen và Leunissen, 1997; Thomas và cộng sự, 1999). Subtilisin BPN' là một pre-pro-enzyme (Wells và cộng sự, 1983). Trình tự pre- là một chuỗi gồm 30 amino acid có chức năng như một chuỗi peptide tín hiệu trong quá trình tiết subtilisin ra môi trường bên ngoài. Trình tự pro- gồm 77 amino acid được nối với subtilisin chỉ đến khi quá trình gấp nếp kết thúc và sau đó chúng tự động cắt bỏ khỏi phân tử subtilisin trưởng thành. Chính vì thế chuỗi peptide gồm 77 amino acid này được ví như một “foldase” xúc tác cho quá trình gấp nếp của phân tử enzyme. Phân tử subtilisin trưởng thành gồm 275 amino acid và có khối lượng phân tử là 27,5 kDa (Ikemura and Inouye, 1988; Ohta and Inouye, 1990). Đường có tác dụng kích thích enzyme protease ngược lại acid có tác dụng ức chế enzyme protease, acid tartric ức chế mạnh nhất. Chất chát với nồng độ 0,02% có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme protease. Rượu với nồng độ 8% về thể tích không làm giảm hoạt tính enzyme protease. b) Sinh tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ thông khí và thành phần môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp, mỗi loài có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ưu của Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37oC. Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện rất rõ ở các loài thuộc chi Bacillus. pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng hoặc trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH tối ưu cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường có thể chuyển dần về phía acid hoặc kiềm. Tuy nhiên, người ta nhận thấy một số vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy có khả năng tự điều chỉnh pH môi trường. Điều đó được giải thích là do chúng có khả năng tạo ra các enzyme chuyển hóa các acid hữu cơ được tạo ra do phân giải các carbohydrate thành các sản phẩm trung hòa. Bởi vậy chúng đã duy trì được pH thích hợp trong suốt quá trình phát triển của chúng. Chính vì thế khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus trong đó có Bacillus subtilis để sinh tổng hợp enzyme người ta ít khi bổ sung các chất trung hòa vì pH thay đổi không đáng kể (trích Đỗ Thị Giang, 1988). Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme protease của Bacillus subtilis trong môi trường nuôi cấy thì kết quả cho thấy rằng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C và pH ban đầu thích hợp nhất là 6, hoạt tính đạt được trong điều kiện nuôi cấy này là 0,560 HP/ml. Trong khi đó khi nuôi cấy với pH ban đầu là 10 ở các mức nhiệt độ 25oC, 55oC, 60oC chủng này hầu như không sinh enzyme. Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp: Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinh tổng hợp protease. Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976). Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60 - 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian. Hoạt động của protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn. Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt động tốt nhất trong khoảng thời gian 46 - 68 giờ. Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và cả polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Ở vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% thì sẽ làm giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy. Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis, các tác giả đã bổ sung các nguồn carbon khác nhau như tinh bột hòa tan, maltose, lactose, saccharose và dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trường cơ bản thịt-peptone, đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thu enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme. Họ nhận thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon kích thích Bacillus subtilis sinh tổng hợp protease tốt nhất, hoạt tính của enzyme thô (0,156 HP/ml) lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,096 HP/ml) là 1,6 lần. Điều này có lẽ là do trong môi trường có tinh bột đã kích thích chủng này sinh amylase. Chính amylase này (thực chất là nguồn protein) là chất cảm ứng sinh protease Ngược lại, với kết quả này, khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một chủng Bacillus sp. thì S.Mehrotra và cộng sự (1998) đã công bố rằng tinh bột không có vai trò kích thích. Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng này (hoạt tính chỉ đạt được 0,016 HP/ml). Đối với dextrose, nhiều công bố cho rằng dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của Bacillus sp., những công trình khác lại cho là kích thích. S.Mehrotra và cộng sự (1998) cũng đã công bố rằng lactose, saccharose, maltose có tác dụng kìm hãm khả năng sinh protease của Bacillus sp. Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây lại dùng nguồn carbon khác. Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008), khi nghiên cứu về nguồn carbon của chủng Bacillus subtilis 61 với những nguồn carbon khác nhau như: trisodium citrate, casein, glucose và acid citric thì chỉ có trisodium citrate và casein thì khả năng tổng hợp protease của chủng này cao hơn đáng kể so với các nguồn carbon còn lại. Điều đó cho thấy trisodium citrate và casein là những nguồn carbon thích hợp để tổng hợp protease. Trong đó, trisodium citrate cho kết quả cao nhất (0,034 UI/ml). Kết quả này cũng giống như kết quả nghiên cứu của Meire và Wellingta (2004) trisodium citrate là nguồn carbon tốt cho việc tổng hợp protease. Bảng 2.4. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi thay đổi các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy Nguồn carbon Hoạt tính protease (UI/ml) Trisodium citrate 0,034 Casein 0,020 Tinh bột 0,001 Acid citric 0,000 Glucose 0,001 (trích Ngô Thị Thanh Nhàn, 2008) Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối vô cơ. Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3. Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp. Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là 0,038 UI/ml so với các nguồn khác. Bảng 2.5. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau trong môi trường nuôi cấy Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (UI/ml) KNO3 0,038 (NH4)2SO4 0,026 NH4Cl 0,021 NH4NO3 0,019 Cao thịt 0,010 Cao nấm men 0,008 (trích Ngô Thị Thanh Nhàn, 2008) Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như NaCl và vitamin cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251 - 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132 - 63 tới 7- 24%. Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid ức chế trong quá trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của các amino acid lên khả năng sinh enzyme protease của vi khuẩn Bacillus subtilis cho thấy các amino acid làm giảm khả năng sinh enzyme. Trong đó, khả năng làm giảm của Met là ít nhất (0,084 HP/ml), sau đó là proline (0,080 HP/ml), Ala (0,072 HP/ml), ornithine và arginine (0,064 HP/ml). Công bố của D.J. Fairbain và cộng sự cho kết quả ngược lại khi tác giả này nghiên cứu sự ảnh hưởng của amino acid lên khả năng sinh protease của Pseudomonase Fluorescens. 2.2.3. Thu nhận và tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis Chúng ta đều biết rằng để nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzyme thì có 2 phương pháp: phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bề mặt. Ngày nay bằng phương pháp cố định tế bào người ta cũng có thể sinh tổng hợp được enzyme. Tuy nhiên phương pháp này còn tồn tại nhiều nhược điểm và đòi hỏi công nghệ, thiết bị hiện đại. Các chế phẩm enzyme trong môi trường nuôi cấy thu được ở các phương pháp nói trên còn chứa rất nhiều tạp chất. Nồng độ enzyme ở trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt khoảng 0,5 - 1%, còn trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp chìm thì tốt hơn, khoảng 0,01%... Thông thường công nghệ tách chiết enzyme từ chế phẩm nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề mặt phải bao gồm các thao tác chủ yếu sau đây: tách các thành phần của môi trường nuôi cấy và sinh khối để nhận được dịch nuôi cấy cô đặc công nghiệp này làm khô và kết tủa enzyme. Tùy từng lĩnh vực đòi hỏi độ tinh khiết của enzyme mà đặt ra nhu cầu thu nhận enzyme sao cho kinh tế nhất. Ngày nay thường tồn tại hai loại chế phẩm enzyme. Đó là chế phẩm enzyme kỹ thuật và chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao hơn. Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm đã được tách tạp chất, nhưng ngoài enzyme chủ yếu còn có enzyme khác và protid không có hoạt tính sinh học (nồng độ enzyme khoảng 15 - 20%). Chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao thì ngoài enzyme các chất khác chiếm tỉ lệ không đáng kể. Chế phẩm enzyme kỹ thuật có thể là dịch cô đặc có nồng độ chất khô 35 - 50% hoặc dạng bột có hàm lượng chất khô khoảng 90%. 2.2.3.1. Thu nhận và tách chiết enzyme α-amylase của Bacillus subtilis Trong một số ngành công nghiệp nhiều khi đòi hỏi phải có những chế phẩm có độ tinh khiết cao. Trong thập kỷ 70 của thế kỷ này đã xuất hiện lĩnh vực khác nhau sử dụng các chế phẩm enzyme tinh khiết. Trong quá trình sinh tổng hợp amylase đồng thời cũng xảy ra quá trình sinh tổng hợp protease. Trong trường hợp cần loại bỏ protease ra khỏi chế phẩm amylase người ta cho amylase hấp phụ lên tinh bột, công trình này đã được nêu trong chế phẩm Patent của Mỹ. Trong Patent người ta cũng đã nêu lên việc ứng dụng calci acetate với tỷ lệ từ 2 - 10% (W/V) vì calci acetate đã góp phần hoạt hóa enzyme. Sau đó bổ sung dung môi hữu cơ với nồng độ khoảng từ 0,6 - 1,0 Vdung môi/Vban đầu khi đó amylase bị kết tủa khi bổ sung dung môi. Theo Molodova (1966) để loại bỏ protease ra khỏi α-amylase của nấm mốc Aspergillus và Rhizopus sử dụng hạt trao đổi anion, có thể sử dụng nhựa phenolformadehyde, polystiren và các dẫn xuất của cellulose Người ta đã thu nhận được trên 90% α-amylase. Quá trình thu nhận và làm sạch như sau: Chế phẩm enzyme thô thu được sau lên men phải xử lý sơ bộ bằng các phương pháp hóa học như điều chỉnh pH, thêm các chất ổn định 0,1% CaCl2 so với dịch lên men để tạo kết tủa dẫn đến lắng cặn hoạt hóa enzyme và lọc để loại bỏ tạp chất. Việc này làm mất hoạt tính của enzyme khoảng 2%. Quá trình lọc bỏ tạp chất cũng gặp những khó khăn vì sinh khối tế bào lớn bịt kín các lỗ loc khiến tốc độ lọc chậm dần và thời gian lọc dài dẫn đến tổn thất enzyme rất lớn, cho nên khi lọc người ta còn bổ sung bột trợ lọc, hoặc lọc bằng màng hoặc sử dụng máy li tâm có tốc độ cao 5000 - 6000 vòng/phút, 96 - 97% sinh khối được tách. Bổ sung các chất trợ lọc như: diatomit của Nhật, filtroperlit của Liên Xô (cũ). Sau khi có chế phẩm enzyme khá sạch ở dạng lỏng người ta tiến hành cô đặc. Thông thường người ta hay cô chân không ở nhiệt độ thấp 28 – 30oC để tránh hiện tượng bất hoạt enzyme đây là giai đoạn rất thuận lợi đối với các chế phẩm nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt vì chế phẩm này có nồng độ chất khô cao hơn so với chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm. Trong trường hợp thực hiện cô đặc chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm thường hay dẫn đến một số biến đổi hóa học, bất lợi cho hoạt động của enzyme làm ảnh hưởng đến tính bền vững của enzyme. Trong vấn đề này Vexelov (1970) đã có nhiều thành tựu, ông cô đặc enzyme bằng phương pháp đóng băng nhiều lần. Ngày nay với thành tựu của công nghệ màng siêu lọc, phương pháp cô đặc dịch lên men đã được thực hiện đơn giản hơn, hiệu quả hơn. Để ứng dụng được phương pháp này có hiệu quả người ta làm sạch enzyme, chọn nguyên liệu và kích thước màng sao cho phù hợp. Phương pháp này không những chỉ cô đặc enzyme mà còn làm cho chế phẩm sạch hơn, hoạt tính của enzyme bị giảm không đáng kể trong quá trình lọc. Sau khi có được chế phẩm enzyme cô đặc người ta tiến hành sấy phun để thu enzyme khô ở nhiệt độ 120 - 130oC rồi giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 - 65oC. Trước khi sấy phun có thể thêm các chất như NaCl nồng độ 200 mg/l hoặc CaSO4, MgSO4 nồng độ 30 - 60 mg/l. Trong quá trình sấy phun hoạt tính enzyme giảm khoảng 10%. Đây hiện là một phương pháp hữu hiệu nhất để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật. Tuy nhiên để sấy phun có hiệu quả thì việc xử lý chế phẩm trước sấy phun là việc quan trọng. Độ ẩm của chế phẩm thu được là yếu tố quyết định tác dụng và độ bền vững của enzyme. Chế phẩm thu được có thể bảo quản được 2 năm, sấy phun đơn giản hơn và hạ giá thành sản phẩm. Để thu nhận được chế phẩm có độ tinh khiết cao người ta có thể tiến hành như sau: kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, muối trung tính để tách enzyme ra khỏi dung dịch, sau đó tách α-amylase ra khỏi hỗn hợp enzyme đã được kết tủa bằng màng siêu lọc, hoặc phương pháp hấp phụ enzyme trên tinh bột. Sắc ký trao đổi ion hoặc dùng phương pháp đẳng điện, rồi kết tinh và sấy khô. Kvesitadze (1984) đã đưa ra bảng quá trình làm sạch và kết tinh α-amylase của Bacillus subtilis như sau: Lọc chế phẩm Hấp phụ tinh bột Muối tách M/30 Na2HPO4 Tẩy màu trên nhựa Đayrut A2 Kết tủa bằng (NH4)2SO4 đến 70% bão hòa Hòa tan kết tủa trong calci acetate M/500 Thêm aceton ở 00C đến 60% bão hòa Hòa tan kết tủa trong calci acetate 0,01M Chỉnh pH đến 6,0 Bảo quản trong lạnh Kết tinh Tuy nhiên, theo các nghiên cứu gần đây, quá trình kết tủa enzyme lại dùng cồn 96%. Theo Nguyễn Thanh Thủy (2007) khi khảo sát tỷ lệ tủa enzyme α-amylase bằng cồn 96% và tủa bằng (NH4)2SO4 đã cho kết quả như sau: Bảng 2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Tỷ lệ enzyme/cồn 96% Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) Theo bảng 2.6 thì ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn thấp chỉ tủa được một lượng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt tính α-amylase thấp. Nhưng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lượng protein thu nhận được cao hơn, song hoạt tính thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt tính α-amylase giảm. Bảng 2.7. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,683 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72.29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) Theo bảng 2.7 thì tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt tính cao nhất. Ở độ bão hòa 70%, hoạt tính α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein. Từ các kết quả trên, tác giả đã kết luận kết tủa bằng cồn 96% ở tỷ lệ enzyme/cồn 1:3 hoạt tính của α-amylase thu hồi được cao hơn khi kết tủa bằng (NH4)2SO4. Như vậy, quá trình tách và làm sạch enzyme là một quá trình phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất tinh khiết và rất tốn kém. Người ta đã đề nghị một số ngành sử dụng enzyme nếu không cần tinh khiết thì có thể sử dụng enzyme thô như công nghệ thuộc da và sản xuất rượu bia Ngày nay trên thị trường tồn tại khá nhiều chế phẩm enzyme. Trong ngành công nghiệp sản xuất bia người ta đã sử dụng khá nhiều loại enzyme kỹ thuật. Hãng Novo - Nordish của Đan Mạch đã đưa vào thị trường Việt Nam một loại chế phẩm enzyme cho khá nhiều ngành công nghiệp trong đó có ngành công nghệp sản xuất bia. 2.2.3.2. Thu nhận và tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis a) Thu nhận enzyme protease của Bacillus subtilis Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được dịch enzyme protease thô. Để đảm bảo cho dịch enzyme protease thô không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô dịch bằng máy sấy chân không. Độ ẩm cần đạt được sau quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 40oC. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người phải tiến hành như sau: Toàn bộ khối lượng enzyme protease thô được nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Khi nghiền người ta thường sử dụng các chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Đây là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và tăng khả năng ma sát, trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. b) Tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch. Quá trình kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa như: cồn 96%, sulphate ammon, muối (NH4)2SO4 Khi tiến hành tủa, phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải tiến hành từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulphate ammon với liều lượng như sau: cứ một phần dung dịch enzyme thô cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulphate ammon. Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là từ 4 - 7oC) theo thời gian, các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận tủa (độ ẩm lớn hơn 70% trọng lượng). Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, sấy kết tủa enzyme protease ở 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 - 8% trọng lượng (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài enzyme khác lẫn vào. CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS 3.1. Ứng dụng trong thực phẩm 3.1.1. Trong công nghệ sản xuất bia Bia là một loại giải khát mát bổ, có nồng độ cồn thấp, có độ mịn xốp và có hương vị đặc trưng. Hương liệu của bia là do các chất chiết từ nguyên liệu, cồn và CO2 và sản phẩm lên men khác nhau tạo nên. Đặc biệt, CO2 bão hòa trong bia có tác dụng giải khát rất tốt. Nhờ những ưu điểm này mà bia được sản xuất khắp nơi trên toàn thế giới. Hiện nay trên thế giới có khoảng 25 nước sản xuất bia với sản lượng trên 1 tỷ lít mỗi năm. Trong đó có Mỹ, Cộng Hòa Liên Bang (CHLB) Đức, Trung Quốc mỗi năm sản xuất trên 10 tỷ lít, sản lượng tính theo đầu người năm 1984 ở Đan Mạch là 182 lít/năm, ở CHLB Đức, Hà Lan 146 lít/năm. Ở Việt Nam, mấy năm gần đây, sản lượng bia đã tăng lên nhanh chóng. Nếu 10 năm trước, nước ta chỉ có 2 nhà máy bia ở Hà Nội và Sài Gòn thì nay ước tính có hàng trăm nhà máy, xí nghiệp và phân xưởng sản xuất bia lớn, nhỏ có quy mô công nghiệp. Năm 1994, theo thống kê thì bình quân đầu người là 5 lít/năm. Từ xa xưa trong công nghệ sản xuất bia ở hầu khắp các nước trên thế giới đều dùng malt, nhưng khác với sản xuất rượu, malt chủ yếu là tác nhân đường hóa thì trong sản xuất bia malt vừa là tác nhân đường hóa, vừa là nguyên liệu sản xuất. Sản xuất bia theo sơ đồ công nghệ thông thường các hệ enzyme được tạo ra trong quá trình nảy mầm cần thiết để xử lý nguyên liệu bột chuyển các chất chiết sang trạng thái hòa tan ở giai đoạn nấu. Các enzyme tạo ra trong quá trình nảy mầm và có ý nghĩa quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất bia là enzyme amylase dịch hóa và đường hóa tinh bột. Enzyme protease phân giải protein của đại mạch đến các polysaccharide không phải là tinh bột, hòa tan màng nội nhũ hạt ngũ cốc, làm cho các enzyme amylase và protease dễ dàng tác dụng đến cơ chất tương ứng. Mỗi quá trình kể trên cần tiến hành đến mức độ xác định để ổn định việc lọc dịch đường hóa, lên men dịch đường, làm trong và lọc bia; cũng như tạo ra những tính chấ,t mùi vị và lý hóa xác định cho bia. Những enzyme có nguồn khác nhau dùng thay thế enzyme của malt cần phù hợp với enzyme của malt về đặc tính tác dụng và phải trội hơn về hoạt lực, do đó cho phép giảm quy mô sản xuất chế phẩm enzyme, so với quy mô sản xuất malt. Ở Liên Xô (cũ) những công trình nghiên cứu có hệ thống về ứng dụng chế phẩm enzyme từ vi sinh vật với mục đích thay thế một phần đáng kể malt bằng đại mạch chưa nảy mầm được tiến hành sớm hơn ở các nước khác. Người ta có thể thay thế 86 - 100% malt bằng đại mạch chưa nảy mầm. Có sử dụng hỗn hợp enzyme α-amylase của Asp. oryzae và Bacillus subtilis. Trên thế giới có rất nhiều nước quan tâm đến việc sản xuất bia từ đại mạch chưa nảy mầm và các nguyên liệu khác thay thế như gạo, ngô, khoai tây và sắn Nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này đã được báo cáo ở hội nghị quốc tế lần thứ 13 và 14 Hiệp hội ngành bia châu Âu EBC năm 1971 và 1973. Khi phân tích thành tựu công nghiệp bia người ta đã dự báo việc thay thế hoàn toàn malt bằng Đại mạch chưa nảy mầm và enzyme vi sinh vật. Từ những năm 1960, Liên Xô đã sản xuất ở quy mô công nghiệp các chế phẩm enzyme đã ứng dụng trong sản xuất bia Jigulevxkoe, như Amilorizin Px, Xitorozenin Px và amilosubtilin G10x. Bia Jigulevxkoe đã thay thế 50% malt bằng đại mạch chưa nảy mầm. Giá trị của công nghệ mới này là ở chỗ trong khi đảm bảo khả năng thu được bia phẩm chất cao do lượng lớn nguyên liệu chưa nảy mầm và các enzyme từ vi sinh vật. Mục đích đầu tiên người ta sử dụng chế phẩm α-amylase (chủ yếu là amylase từ vi khuẩn) để dịch hóa tinh bột làm tăng khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường, đặc biệt là khi dùng các loại hạt mầm để thay thế malt đại mạch. Loại α-amylase thường dùng hiện nay là từ Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis và Baciillus liquefaciens. Dịch đường hóa trong sản xuất bia cần đảm bảo về tỉ lệ thành phần maltose và dextrin, không phải đơn thuần tích lũy nhiều đường đơn. Do vậy, người ta còn dùng bổ sung cả nguồn enzyme β-amylase của nấm mốc Asp. oryzae trong giai đoạn đường hóa. Ngoài ra, các chế phẩm này còn được sử dụng trong sản xuất một số bia cho người mắc bệnh tiểu đường hay những người cần ăn kiêng. Người ta còn sử dụng cả enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa, nhằm giảm lượng đường trong sản phẩm cuối cùng. Chế phẩm dùng trong sản xuất bia là hỗn hợp enzyme chứa α-amylase và β-amylase (hay α-amylase có khả năng đường hóa cao) các enzyme protease và pentosanase, β-glucanase. Amylase của Bacillus subtilis tốt hơn của nấm mốc vì có độ bền nhiệt và khả năng dịch hóa cao hơn. Đồng thời sử dụng bổ sung một cách hợp lý α-amylase của nấm mốc nâng cao mức độ lên men của dịch đường. Protease phải có khả năng proteinase lẫn peptidase để khi tác dụng lên polypeptide đại mạch thì chuyển vào dịch đường các hợp chất đạm khó tan, polypeptide và amino acid với khối lượng đủ đảm bảo của hoạt động sống bình thường của nấm men, cho sự hoàn chỉnh vị bia và cho sự tạo bọt. Protease được sử dụng trong công nghiệp bia, phần lớn là các enzyme trung tính. Các enzyme β-glucanase và pentosanase, hòa tan màng tế bào của nội nhũ đại mạch và có khả năng lên men nhanh dịch đường. Neutrase là chế phẩm protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Neutrase chỉ chứa các protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa lẫn protease kiềm. Neutrase không chứa α-amylase. Loại enzyme này có nhiệt độ thích hợp nhất trong vùng 45 – 55oC và pH 5,5 - 7,5. 3.1.2. Trong công nghệ chế biến thủy sản Đã có những nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng enzyme protease của Bacillus subtilis trong chế biến thủy sản như: sản xuất bột đạm thủy phân từ cơ thịt cá mối. Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme protease của Bacillus subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease của Bacillus subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50oC, pH tự nhiên của cơ thịt cá thì hỗn hợp thủy phân có các chỉ tiêu cảm quan và hóa học tốt nhất. Ðể ức chế quá trình gây thối của vi sinh vật trong quá trình thủy phân có thể bổ sung vào hỗn hợp thủy phân muối ăn với nồng độ 3% hoặc sorbitol với nồng độ 4% hay ethanol với nồng độ 8%. Sản xuất nước mắm ngắn ngày cũng được nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất bằng các chế phẩm protease thu nhận từ vi khuẩn. Để tăng quá trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta đã tiến hành tạo nhiệt độ thích hợp cho protease hoạt động là khoảng 50oC và giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease với cá bằng cách xay nhuyễn cá Khi cho muối vào chượp cá thì nhiệt độ thủy phân là 43 - 45oC và sẽ làm giảm hoạt độ của protease thủy phân cá. Ở điều kiện thích hợp, việc bổ sung protease giúp rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm từ 6 - 9 tháng xuống còn 30 - 40 ngày. Nước mắm ngắn ngày có hàm lượng đạm khá cao, tuy nhiên về hương vị, độ ngon thì kém nước mắm dài ngày. Người ta khắc phục nhược điểm này bằng cách pha trộn nước mắm ngắn ngày với nước mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm hương vị vào nước mắm ngắn ngày. Ngoài nhiệt độ thích hợp, độ xay nhuyễn cá và bổ sung muối phù hợp cũng làm giảm đáng kể thời gian lên men sản xuất nước mắm và đảm bảo chất lượng nước mắm thành phẩm. Ngoài ra, enzyme α-amylase còn được sử dụng trong sản xuất siro fructose, sản xuất bánh kẹo, bổ sung α-amylase và protease vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số sử dụng thức ăn 3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Enzyme protease có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis), nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng. 3.3. Ứng dụng trong công nghiệp dệt Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. 3.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra. Một tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa. Tham số đóng vai trò chìa khóa cho việc bổ sung protease nào vào chất tẩy rửa là pI của chúng. Một protease phù hợp khi pI của nó trùng với pH của dung dịch chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắt khe trên. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus (Rao và cộng sự, 1998; Thangam, 2002), và chủ yếu là từ Bacillus subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta và cộng sự, 2002). 3.4. Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường Việc ứng dụng các enzyme ngoại bào của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng đã và đang được nghiên cứu với nhiều triển vọng và có những ứng dụng nhất định trong việc xử lý ô nhiễm môi trường. Phương pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa hai phương pháp truyền thống, nó bao gồm các quy trình hoá học trên cơ sở hoạt động của các chất xúc tác có bản chất sinh học. Enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Phương pháp xử lý bằng enzyme so với phương pháp xử lý thông thường có những ưu điểm sau: Được áp dụng đối với các hợp chất sinh học khó xử lý. Tác dụng ở cả vùng nồng độ chất ô nhiễm cao và thấp. Một số enzyme riêng biệt có tác dụng trên phạm vi pH rộng, nhiệt độ và độ mặn. Không gây ra những biến động bất thường. Không gây ra các cản trở phá vỡ cân bằng sinh thái. Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mặt khác để xử lý. Các phế thải protein tồn đọng trong các dạng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối. Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ hoàn toàn. Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thuỷ phân, như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làm thức ăn. Các enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô khoai, sắn ... Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylase có thể dùng để sản xuất ethanol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylase và glucoamylase, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền, quy trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và sinh học. α-amylase trước tiên được dùng để phá vỡ các phân tử tinh bột mạch dài để tạo thành những mảnh nhỏ. Tiếp theo glucoamylase tác dụng tạo thành glucose thông qua quá trình đường hoá (hơn 90% tinh bột được chuyển thành đường). Glucose được lên men thành acid lactic nhờ chủng vi sinh vật sản sinh acid lactic. Acid lactic cuối cùng được thu lại, tinh sạch và dùng để sản xuất màng bao gói kiểu này. Sản phẩm cuối cùng chứa 95% acid lactic và 5% các chất thải an toàn với môi trường. Ở nước ta, việc nghiên cứu sử dụng các enzyme vi khuẩn như amylase để xử lý nước thải của các làng nghề làm bún, bánh đa đã có những kết quả đáng kể. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài này, tôi rút ra một số kết luận như sau: Bacillus subtilis có nhiều ưu điểm hơn các loài vi sinh vật khác như dễ nuôi cấy, sinh trưởng tốt, phát triển nhanh, không sinh độc tố và an toàn khi đưa vào sản xuất và sử dụng các chế phẩm từ loài vi khuẩn này, có khả năng kháng khuẩn cao và chịu được những ảnh hưởng bất lợi từ môi trường. Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào nhưng các enzyme được chú ý và ứng dụng vào đời sống và sản xuất công nghiệp là các enzyme amylase và protease. Bacillus subtilis có khả năng sinh lượng enzyme ngoại bào lớn. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis có những đặc tính vượt trội hơn hẳn các enzyme của vi sinh vật khác như khả chịu được nhiệt độ tương đối cao, pH hoạt động từ trung tính đến kiềm, khả năng thủy phân các cơ chất mạnh mẽ... Qui trình tách chiết và thu nhận các enzyme ngoại bào cũng tương đối dễ dàng, tận dụng được nguồn cơ chất từ các phế thải phụ phẩm làm giảm giá thành chế phẩm, tăng lợi nhuận, làm giảm đáng kể việc thải bỏ các chất thải hữu cơ vào môi trường. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong ngành công nghiệp thực phẩm điển hình là ngành công nghiệp sản xuất bia, sản xuất nước mắm và bột đạm thủy phân từ cá...; trong ngành công nghiệp dệt; ngành công nghiệp thuộc da; trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa và và ứng dụng trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường. 4.2. Kiến nghị Cần nghiên cứu và làm thực nghiệm khi nghiên cứu về Bacillus subtilis như: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme ngoại bào. Khảo sát hoạt tính và khả năng thủy phân các cơ chất khác nhau từ các chủng phân lập và tuyển chọn được. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để thu nhận các enzyme ngoại bào có hoạt độ cao hơn. Đưa vào sản xuất các enzyme ngoại bào từ các chủng Bacillus subtilis và ứng dụng vào thực tiễn vào sản xuất và đời sống. Nghiên cứu các điều kiện bảo quản tối ưu để các chế phẩm enzyme không bị giảm hoạt tính trong quá trình bảo quản và sử dụng được lâu.