Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực caovà đánh giá hiệu suất lên men ethanol dịch thủy phân bèo Nhật Bản bằng acid loãng

HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 7 1985 TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ HOẠT LỰC CAOVÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT LÊN MEN ETHANOL DỊCH THỦY PHÂN BÈO NHẬT BẢN BẰNG ACID LOÃNG Nguyễn Minh Trí, Hồ Phan Ngọc Thúy Trường Đại học Khoa học Huế Ethanol là một loại nhiên liệu sinh học, được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men đường, tinh bột hay cellulose từ các loạicây nông nghiệp như ngô,lúa mì,lúa mạch, mía... chuyển hóa thành đường đơn và cũng có thể sản xuất etanol từ cây cỏ có chứa hợp chất cellulose. Chính vì vậy, người ta đang nghiên cứu theo hướng sản xuất ethanol từ các nguồn phế liệu của nông nghiệp [3]. Bèo Nhật Bản (Eichhornia crassipes) hay còn gọi là bèo Tây, Lục Bình có nguồn gốc từ Nam Mỹ đã được di nhập vào Việt Nam từ những năm 1902 với mục đích làm cảnh. Hiện nay đối tượng này đã phân bố rộng khắp tại các thủy vực ở Việt Nam nói chung và ở địa bàn tỉnh Thừa Thiên -Huế nói riêng. Vì vậy, việc xử lý sinh khối bèo Nhật Bản đang là một vấn đề cần quan tâm hiện nay [10]. Bài báo này giới thiệu một số kết quả về tuyển chọn chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol cao được phân lập từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng lên men ethanol từ dịch thủy phân bèo Nhật Bản bằng acid loãng nhằm giải quyết một lượng lớn sinh khối bèo Nhật Bản đang phát triển quá mức và tận dụng loại nguyên liệu này như một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình sản xuất ethanol sinh học. I. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu: - Bèo Nhật Bản - Chủng nấm men được phân lập từ các nguồn khác nhau Phƣơng pháp nghiên cứu Phân lập các chủng nấm men từ: 13 loại bánh men rượu, 2 loại bã rượu, 2 loại trái cây chín... [1]. Sơ tuyển hoạt lực lên men của các chủng nấm men đã được phân lập bằng cách xác định chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống Durham tại các thời điểm nuôi cấy [7]. Xác định hàm lượng cellulose của bèo Nhật Bản bằng phương pháp thủy phân [2]. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp so màu với acid picrid [2]. Xác định nồng độethanol trong quá trình lên menbằng phương pháp so màu [8]. Các thí nghiệm được thực hiện trong ba lần lặp lại, kết quả là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Tất cả các số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Excell 2010. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập các chủng nấm men Qua quá trình phân lập từ các nguồn khác nhau, chúng tôi đã thu nhận được 17 chủng nấm men. Sau đó quan sát các khuẩn lạc hiện diện trên môi trường dinh dưỡng dựa vào các đặc điểm khác nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước của tế bào nấm men để phân loại sơ bộ các chủng nấm men (Bảng 1) (Kurtzman and Fell, 1998). . TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG 1986 Bảng 1 Đặc điểm hình thái của 17chủng nấm men đƣợc phân lập Mẫu Chủng Mô tả khuẩn lạc Hình dạng tế bào Bánh men Quảng Ngãi QN1 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng nhạt, trơn hình oval lớn QN2 Khuẩn lạc trắng đục, khô hình cầu QN3 Khuẩn lạc to, màu trắng sữa, đậm trong và nhạt dần ra ngoài hình oval lớn QN4 Khuẩn lạc lớn, màu trắng đục, bề mặt khô, hình oval lớn QN5 Khuẩn lạc trung bình, màu trắng sữa, bề mặt khô hình oval nhỏ QN6 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt trơn láng hình oval lớn Bánh men Sài Gòn SG1 Khuẩn lạc trắng trung bình sữa nhạt, trơn Hình oval nhỏ SG2 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, khô Hình elip SG3 Khuẩn lạc trắng sữa trơn hơi to Hình oval nhỏ Men bánh mì BM1 Khuẩn lạc to, bề mặt trơn, bóng có màu trắng sữa Hình oval lớn BM2 Khuẩn lạc vừa, nhạt trong và đậm dần từ ngoài vào trong Hình elip BM3 Khuẩn lạc nhỏ, nhân trắng sữa Hình oval nhỏ BM4 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, khô Hình oval nhỏ Bã rượu Sake BR1 Khuẩn lạc trung bình, trơn láng Hình cầu BR2 Khuẩn lạc vừa, khô Hình cầu Trái cây TC1 Khuẩn lạc trung bình, màu trắng nhạt, trơn Hình cầu TC2 Khuẩn lạc trắng sữa to, khô Hình cầu 2. Khảo sát hoạt lực lên men ethanol của các chủng nấm men Để xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men có thể dựa vào khả năng sinh khí CO2 trong quá trình lên men. Tuy nhiên do thời gian lên men trong ống Durham ngắn, trong khi quá trình lên men rượu có thời gian dài ngày hơn. Vì vậy phương pháp xác định chiều cao cột khí CO2 bằng ống Durham chỉ là cơ sở ban đầu để tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng nấm men trong môi trường dinh dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 30ºC và xác định chiều cao của cột khí CO2 sau mỗi đợt theo dõi là 6 giờ. Kết quả khảo sát qua 3 lần lặp lại cho thấy: tại các thời điểm khác nhau, chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham cũng khác nhau, cho thấy cường độ lên men của các chủng nấm men cũng khác nhau (Bảng 2). Bảng 2 Chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống Durham của các chủng nấm men qua 3 lần lặp lại STT Chủng nấm men Chiều cao cột khí CO2 (cm) 6 giờ 12 giờ 18 giờ 24 giờ 30 giờ 36 giờ 1 QN1 4,2 7,5 9,0 11,0 11,0 11,0 2 QN2 - - - - - - . HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 7 1987 3 QN3 - - - - - - 4 QN4 0,3 1,4 2,2 7,8 8,6 10,8 5 QN5 2,1 3,8 5,1 8,3 9,0 10,6 6 QN6 - - - - - - 7 SG1 0,2 1,9 3,4 5,6 7,8 8,9 8 SG2 - - - - - - 9 SG3 1,1 2,5 5,3 7,9 8,0 8,2 10 BR1 3,6 4,5 6,6 7,5 8,9 10,4 11 BR2 1,3 2,5 5,8 6,0 6,9 7,5 12 BM1 2,0 3.4 5,6 6,1 7,5 8,0 13 BM2 - - 1,0 2,4 4,7 6,2 14 BM3 1,2 2,0 3,8 5,3 7,9 9,0 15 BM4 - - - - - - 16 TC1 - 1,1 2,0 4,4 5,9 7,0 17 TC2 0,9 2,6 3,7 5,0 6,5 7,4 Ghi chú: (-) chưa tạo CO2 trong ống Durham Ở thời điểm 6 giờ đầu của quá trình lên men, đa số các chủng nấm men đều có khả năng lên men và tạo khí CO2. Chủng QN1 có chiều cao cột khí cao hơn cả so với các chủng còn lại, cho thấy các chủng này có khả năng lên men nhanh. Sau 36 giờ lên men, chiều cao cột khí trong ống Durham ít thay đổi do quá trình lên men đã kết thúc. Trong số 17 chủng nấm men được khảo sát ở trên thì chủng QN1 có thời gian lên men ngắn (24 giờ) và chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham đạt tối đa (11,00 cm). Một số chủng nấm men không thấy xuất hiện bọt khí CO2 trong ống Durham chứng tỏ chủng nấm men này không lên men được trong môi trường dinh dưỡng đó. Từ kết quả khảo sát khả năng lên men thông qua chiều cao cột khí CO2 này chúng tôi lựa chọn chủng QN1 để định danh tên khoa học và thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 3. Phân loại Chủng nấm men QN1 được phân loại bằng phương pháp giải trình tự gen 18S rRNA và tra cứu trên Gen Bank để định danh loài. Kết quả giải trình tự gen của chủng nấm men QN1 như sau: Query 1 CTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAG 60 Sbjct 1021 CTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAG 962 Query 61 GAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTC 120 Sbjct 961 GAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTC 902 Query 121 AAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTT 180 Sbjct 901 AAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTT 842 Query 181 CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACT 240 Sbjct 841 CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACT 782 Query 241 TTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGT 300 Sbjct 781 TTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGT 722 Query 301 ATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCA 360 Sbjct 721 ATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCA 662 Query 361 AGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGaaaaaaaaa 394 Sbjct 661 AGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGAAAAAAAAA 628 Hình 1: Trình tự nucleotide đoạn gen 18S rARN của chủng QN1 . TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG 1988 Hình 2: Chủng QN1 trên môi trƣờng thạch đĩa và ảnh tiêu bản nhuộn Gram (×40) Bảng 3 Đánh giá mức độ tƣơng đồng trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 Tên loài Tên chủng Mã số truy cập Độ tương đồng (%) Saccharomyces cerevisiae YZ KT459474.1 100 Qua kết quả giải mã trình tự gen, chúng tôi nhận thấy trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng nấm men BĐ1 tương đồng 100% với trình tự đoạn gen 18S rRNA ở chủng Saccharomyces cerevisiae YZ, KT459474.1. Chủng QN1 được xếp vào chi Saccharomyces, loài Saccharomyces cerevisiae. Chúng tôi đặt tên loài này là Saccharomyces cerevisiae QN1. 4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid và thời gian đến quá trình thủy phân bèo Nhật Bản Phản ứng thủy phân được tiến hành ở các nồng độ acid H2SO4 loãng từ 0,5 - 2% ở 100 0 C trong những thời điểm khác nhau qua lặp lại 3 lần và kết quả được thể hiện ở hình 3. Hình 3: Ảnh hƣởng của nồng độ acid và thời gian đến phản ứng thủy phân 0,5 1 1,5 2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 30 60 90 120 150 180 0,5 1 1,5 2 Thời gian (phút) H2SO4(%) H àm l ư ợ n g đ ư ờ n g k h ử (g /l ) . HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 7 1989 Kết quả ở hình 3 cho thấy, trong khoảng thời gian từ 30 – 120 phút thì hàm lượng đường khử được tạo thành trong dịch thủy phânbèo Nhật Bản ở các nồng độ acid H2SO4tăng tỷ lệ thuận với thời gian phản ứng. Tại thời điểm 120 phút thì hàm lượng đường khử có giá trị cao nhất (2,208 g/l) ứng với nồng độ acid H2SO4 1%, tiếp đến (2,198 g/l) ở nồng độ H2SO4 1,5% và thấp nhất (2,193 g/l) ở nồng độ H2SO4 0,5% Với kết quả khảo sát này, theo chúng tôi việc sử dụng nồng độ acid H2SO4 1% để thực hiện phản ứng thủy phân bèo Nhật Bản trong thời gian 120 phút là thích hợp cho việc thu nhận dung dịch đường khử. Theo nghiên cứu của Das Arpan thì bèo Nhật Bản được xử lý với tỷ lệ rắn lỏng 1:10 (w/v) bằng acid sulfuric 2% ở nhiệt độ và áp suất cao, lượng đường khử thu được tối đa là 425,6 mg/g [4]. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Xuân Cự (2010),thì quá trình thủy phân thân cây ngô bằng H2SO42% ở 120 oC trong 60 phút với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch H2SO42% là 1/10 (w/v) có hàm lượng đường khử tạo thành khá cao (4,2 g/l) trong dung dịch [3]. 5. Kết quả lên men ethanol dịch thủy phân b o Nhật Bản Từ kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nồng độ acid và thời gian đến quá trình thủy phân bèo Nhật Bản, chúng tôi chọn được nồng độ H2SO4 1% và thời gian cho phản ứng thủy phân là 120 phút. Tiến hành thủy phân bèo Nhật Bản bằng H2SO4 1% trong thời gian 120 phút, sau đó lọc lấy dịch trong và trung hòa bằng NaOH 1M. Thực hiện quá trình lên men: phân phối dịch thủy phân bèo Nhật Bản đã được trung hòa vào các bình lên men, mỗi bình là 100 ml và khử trùng ở 1at trong 60 phút. Sau đó dùng pipet vô trùng lấy 1ml dịch từ bình nuôi cấy chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae QN1 cho vào các bình lên men. Nuôi ở nhiệt độ phòng từ 25-29oC. Sau 24 giờ, tiến hành lấy 1 – 5 ml để xác định nồng độ ethanol được tạo thành bằng phương pháp trắc quang trên máy Cobas C311 Analyzer của hãng Hitachi (hình 4). Hình 4: Hàm lƣợng ethanol tạo thành theo thời gian lên men qua 3 lần lặp lại Kết quả khảo sát qua 3 lần lặp lại được thể hiện ở hình 4 cho thấy:hàm lượng ethanol tạo thành cao nhất ở ngày thứ 2 sau lên men đạt 18,696%, những ngày sau hàm lượng ethanol có xu hướng giảm dần. Theo chúng tôi, thời gian 2 ngày cũng là khoảng thời gian nấm men thích nghi với môi trường cơ chất mới và phản ứng lên men tạo ethanol tăng mạnh. Trong điều kiện lên men kỵ khí, ngoài ethanol được tạo thành thì còn có nhiều sản phẩm phụ khác như acid lactic, 9.618 18.969 16.533 14.871 11.067 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 24 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) H àm l ư ợ n g e th an o l (% ) . TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG 1990 phenol, furfural làm hạn chế khả năng lên men của vi sinh vật nên. Mặt khác, khi nồng độ ethanol đạt cao nhất thì hoạt động của chủng nấm men sẽ bị kìm hãm vì vậy chủng sẽ không lên men để chuyển hóa đường thành ethanol, do vậy nồng độ ethanol từ ngày thứ 3 trở đi sẽ giảm dần. Kết quả của Kumar sau khi lên men dịch thủy phân bèo Nhật Bản với H2SO4 2% bằng chủng nấm men Pichia stipitis NCIM-3497 đã thu được ethanol với hàm lượng 0,425 g/g [6]. Theo nghiên cứu của Isarankura-Na-Ayudhya, ban đầu thủy phân bèo Nhật Bản với acid sulfuric 10% và sau đó lên men dịch thủy phân bằng chủng nấm Candida shehatae. Kết quả thu được hệ số sản xuất ethanol tối đa là 0,19 g/g và năng suất là 0,008 g/l/h [5]. Cũng như so với kết quả của Satyanagalakshmi khi nghiên cứu và sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu là bèo Nhật Bản được xử lý với H2SO4 4%. Trong điều kiện tối ưu, đã thu được bioethanol với hiệu suất thực tế là 59,3% [9]. III. KẾT LUẬN Đã phân lập được 17 chủng nấm men từ các nguồn khác nhau, trong đó có 12 chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol. Kết quả khảo sát hoạt tính lên men ethanol bằng phương pháp Durham của chủng QN1 là 11 cm cao hơn so với các chủng nấm men còn lại. Bằng phương pháp giải trình tự gen 18S rRNA và tra cứu trên Gen Bank, kết quả định danh chủng QN1 là loài Saccharomyces cerevisiae, xếp vào chi Saccharomyces. Các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân bèo Nhật Bản bằng dung dịch acid H2SO4 loãng: thời gian thủy phân là 120 phút với acid H2SO4 1% ở nhiệt độ 100 0 C. Sau quá trình lên men dịch thủy phân bèo Nhật Bản bằng Saccharomyces cerevisiae QN1, hàm lượng ethanol đạt giá trị cao nhất là 18,969 g/l ở thời điểm 48 giờ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lý Nguyễn Bình, Trần Văn Khánh, Hà Phƣơng Thảo, Nguyễn Văn Thành,2015. ―Phân lập và tuyển chọn nấm men có hoạt lực cao từ men rượu‖. Tạp ch Khoa học Trường Đai học Cần Thơ, tr. 18–28. 2. Phạm Thị Trân Châu, 2007.Thực hành hóa sinh học, Nxb. Giáo dục. 3. Nguyễn Xuân Cự, 2010.―Nghiên cứu khả năng thủy phân bằng axít loãng và bước đầu đánh giá hiệu quả sản xuất etanol sinh học từ thân cây ngô‖, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tụ nhiên và Công nghệ (26), tr. 211 – 216. 4. Das Arpan, et al, 2016 "Production of bioethanol as useful biofuel through the bioconversion of water hyacinth (Eichhornia crassipes)." 3 Biotech 6.1: 1 – 9. 5. Isarankura-Na-Ayudhya, C., Kongpanpee, T., Prabkate, P., Prachayasittikul, V., & Tantimongcolwat, T.,2007. Appropriate technology for the bioconversion of water hyacinth (Eichhornia crassipes) to liquid ethanol. 6. Kumar, Ashish, L. K. Singh, Sanjoy Ghosh., 2009 "Bioconversion of lignocellulosic fraction of water-hyacinth (Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to ethanol by Pichia stipitis." Bioresource Technology 100.13: 3293-3297. 7. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003.Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2 - Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. . HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 7 1991 8. Lê Thanh Mai,2009.Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB giáo dục, Hà Nội. 9. Satyanagalakshmi, K., Sindhu, R., Binod, P., Janu, K. U., Sukumaran, R. K., & Pandey, A, 2011. Bioethanol production from acid pretreated water hyacinth by separate hydrolysis and fermentation. 10. Nguyễn Minh Trí, Ngô Nguyễn Quỳnh Chi, 2016. Xử lý bèo Nhật Bản bằng chế phẩm sinh học Vixura tạo nguồn phân hữu cơ sinh học, Tạp chí KH&CN, trường ĐHKH Huế. Tập: 4, Số: 1, tr: 115-120 SELECTION OF HIGH PERFORMANCE YEAST STRAIN AND INITIAL EVALUATION OFETHANOL FERMENTATION EFFICIENCY WITH DILUTE ACID DILUTED Nguyen Minh Tri, Ho Phan Ngoc Thuy SUMMARY The study was carried out with the aim of selecting domesticated yeast strains to increase the performance of ethanol fermentation. The study was conducted based on the yeast strains isolated from traditional yeast cake: Ba Don, Saigon, Hue, yeast breads, distillers Sake and ripe fruits. In total, we had 17 yeast strains. Of which, the QN1 yeast strains has high ethanol fermentation activity and good heat resistance compare with the other strains. By sequencing the 18S rRNA gene and looking up Gen Bank, the results of identifying candidate BĐ1 are classified as Candida species, Candida tropicalis. The optimal parameters for hydrolysis of Eichhornia crassipes is at concentration of dilute acid: The hydrolysis time is 120 minutes with 1% H2SO4 at 100 o C. After fermenting the Eichhornia crassipes with Saccharomyces cerevisiae QN1, ethanol reached the highest value of 18,969 g / l at 48 hours. .