Tuyển chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM Tô Thị Ngọc Anh TÓM TẮT 14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cò bỏ được đem khảo sát hoạt tính trên môi trường Delafield cải tiến, sử dụng bột rơm làm cơ chất. Kết quả chọn dòng cho thấy vi khuẩn 43 cho đường kính vòng tròn thủy phân lớn nhất (13,0mm) trên môi trường nhuộm Congo-Red. Dòng 43 là vi khuẩn gram âm, cầu đôi, di động và sinh trưởng trong khoảng pH rộng 5,0-10,0, nhiệt độ 25-40oC. Tại pH 6,0, nhiệt độ 30oC, thời gian ủ 5 ngày, dòng 43 cho hoạt độ thủy phân rơm cao nhất với hàm lượng protein sinh ra 0,10mg/ml và đường khử sinh ra 0,046µg/ml. Từ khóa: dạ cỏ bò, đường khử, kỵ khí, thủy phân, rơm. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng sản xuất lúa trọng điểm của cả nƣớc, với diện tích trồng lúa chỉ chiếm 12,1% nhƣng sản lƣợng lúa chiếm 51,5% và cung cấp hơn 90% lƣợng xuất khẩu của cả nƣớc. Tƣơng đƣơng với lƣợng lúa gạo thì lƣợng rơm phát sinh là rất lớn. Ƣớc tính lƣợng rơm phát sinh năm 2011 của toàn vùng ĐBSCL là 26,23 triệu tấn, trong các địa phƣơng khảo sát thì nhiều nhất là tỉnh An Giang (4,78 triệu tấn) và thấp nhất là Cần Thơ (1,68 triệu tấn) (Tổng cục Thống kê, 2011). Khuynh hƣớng sử dụng rơm hiện nay của các nông hộ là: đốt rơm trên đồng, vùi trong đất, trồng nấm, bán chăn nuôi và cho rơm. Theo báo cáo của Trần Sỹ Nam (2014), hầu nhƣ tất cả ngƣời dân đều có khuynh hƣớng lựa chọn biện pháp đốt rơm trên đồng ruộng cho các năm tiếp theo: 98,75% (vụ Đông Xuân), 96,5% (vụ Hè Thu) và 91,25% (vụ Thu Đông). Đốt rơm rạ trên đồng ruộng chỉ tái tạo đƣợc một phần chất dinh dƣỡng vô cơ cho đất, nhƣng lại thúc đẩy rửa trôi chất dinh dƣỡng trong đất và làm “chai đất”. Hơn nữa, đốt rơm trên các diện tích lớn ĐBSCL sẽ ảnh hƣởng lớn đến môi trƣờng đất, nƣớc và không khí, ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời, góp phần làm gia tăng biến đổi khí hậu (IPCC, 2007; Gadde et al., 2009) và gây lãng phí nguồn tài nguyên sinh khối này (Ngô Thị Thanh Trúc, 2005). Do đó, nghiên cứu xử lý rơm rạ sau thu hoạch là một vấn đề cấp thiết, đặc biệt trong thời điểm ĐBSCL đang gánh chịu những tác hại nặng nề của biến đổi khí hậu (Đoàn Thị Thu, 2014). Cellulase là nhóm enzyme xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết β 1-4 glucoside trong mạch phân tử cellulose, đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ xử lý phế phẩm nông nghiệp, trong các ngành công nghiệp nhƣ trong sản xuất bia, chất tẩy, dệt, giấy, thực phẩm, nhiên liệu sinh học và cả trong y dƣợc(Kirk et al., 2002), (Cherry và Fidantsef, 2003). Cellulase đƣợc sinh ra bởi nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm sợi có khả năng phân hủy rất tốt các cellulase tự nhiên, tuy nhiên, vi khuẩn có tốc độ sinh trƣởng cao hơn nấm nên có tiềm năng lớn đƣợc dùng trong sản xuất cellulase. Động vật nhai lại có khả năng tiêu hóa thức ăn có thành phần cellulose nhờ một hệ vi sinh vật rất phong phú, đa dạng cộng sinh trong dạ cỏ: nấm, vi khuẩn và nguyên sinh vật. Trong đó, nấm và vi khuẩn đóng góp 80% trong sự tiêu hóa thức ăn ở dạ cỏ, nguyên sinh vật chỉ chiếm 20% (Dijkstra và Tamminga, 1995). Nghiên cứu của Cheng và cộng sự (1991), Forsberg và Cheng (1992) chỉ ra Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens và Ruminococcus albus là những vi khuẩn có vai trò chính trong phân giải tế bào thực vật trong dạ cỏ. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme đƣợc sinh ra bởi các chủng Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, Penicillium, Aspergillus, Mucor và Fusarium sp., phân lập từ dạ cỏ bò, cừu và dê có thể ứng dụng trong phân giải switchgrass, một nguồn nhiên liệu tái tạo mới. Nghiên cứu của Krushna Chandra Das và Wensheng Qi (2012) cho thấy vi khuẩn Butrivibrio fibrisolvens, Streptococcus sp., và Clostidium aminophilum phân lập từ dịch dạ cỏ gia súc có thể sinh cellulase hoạt tính cao. Từ những tiền đề và cơ sở trên cho thấy đƣợc tiềm năng to lớn của việc sử dụng vi khuẩn phân lập từ dạ cỏ bò phân giải rơm rạ sau thu hoạch để sản xuất cellulase. Biện pháp này không chỉ nghiên cứu hƣớng xử lý nguồn rơm thải bỏ mà còn tận dụng nguồn tài nguyên sinh khối dồi dào ở ĐBSCL, đem lại hiệu quả kinh tế. Mục tiêu đề tài: tuyển chọn đƣợc dòng vi khuẩn phân lập từ dạ cỏ bò có khả năng thủy phân rơm hiệu quả cao. Những yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của vi khuẩn và khả năng thủy phân rơm đều đƣợc tiến hành nghiên cứu. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Rơm: Mẫu rơm thu đƣợc tại huyện Cờ đỏ, quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ. Rơm đƣợc xử lý rửa sạch chất bẩn, sấy khô và nghiền thành bột mịn để làm cơ chất nuôi vi khuẩn. Nguồn vi khuẩn: 14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ trâu bò, đƣợc đánh số 30, 31, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 49, 50, 51, 52. Vi khuẩn đƣợc trữ bằng glycerol 20%, nhiệt độ -20oC, tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ. 2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí Cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch Delafield (2002) cải tiến, thành phần 5g/l CMC (Carboxymethyl Cellulose), 1g/l (NH4)2SO4, 1g/l K2HPO4, 0,5g/l MgSO4.7H2O, 0,001g/l NaCl. Vi khuẩn đƣợc ủ trong bình hút ẩm bên trong có đặt một ngọn lửa đèn cầy để loại bỏ hoàn toàn oxy trong bình, tại nhiệt độ phòng, trong 2 ngày. Cấy chuyền vi khuẩn qua nhiều lần cho đến khi thu nhận đƣợc từng dòng vi khuẩn thuần nhất. Tiến hành mô tả hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, quan sát hình dạng và chuyển động của vi khuẩn. 2.3. Xác định khả năng thủy phân rơm của 14 dòng vi khuẩn Thử khả năng thủy phân rơm của 14 dòng vi khuẩn phân lập. Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần cho mỗi dòng vi khuẩn. Cấy vi khuẩn sang dịch môi trƣờng Delafield (2002) cải tiến bổ sung 0,5% bột rơm và để ổn định tại nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Cấy vi khuẩn sang môi trƣờng agar Delafield 0,5% bột rơm, ủ trong 5 ngày, nhiệt độ phòng. Sau đó, các đĩa petri đƣợc với nhuộm Congo Red để đánh giá khả năng thủy phân cellulose có trong rơm của các dòng vi khuẩn kỵ khí thông qua độ lớn của đƣờng kính vòng tròn thủy phân. Việc kiểm tra hoạt tính cellulase bằng việc đo đƣờng kính vòng tròn thủy phân đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp đã miêu tả bởi Laurent et al. (2000). 2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến dòng vi khuẩn tuyển chọn đƣợc 2.4.1. pH và nhiệt độ Thử nghiệm sự tƣơng tác của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn tuyển chọn và hiệu suất thủy phân rơm. Tiến hành bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 nhân tố, lặp lại 3 lần cho dòng vi khuẩn tuyển chọn. Cấy vi khuẩn trên môi trƣờng agar 0,5% bột rơm, pH môi trƣờng 4,0-11,0. pH đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5M và HCl 6M. Ủ đĩa petri tại điều kiện nhiệt độ 25-50oC, trong 5 ngày và tiến hành so sánh đƣờng kính đƣờng tròn thủy phân để xác định pH và nhiệt độ thích hợp. 2.4.2. Thời gian nuôi cấy Thử nghiệm ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của dòng vi khuẩn trên rơm để đạt đƣợc hiệu quả thủy phân cao nhất. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 7 ngày, 3 lần lặp lại cho dòng vi khuẩn khảo sát. Vi khuẩn đƣợc nuôi trong 24 ống falcon 50ml môi trƣờng Delafield (2002) cải tiến bột rơm 0,5%. Sau mỗi ngày lấy ra 3 ống để đo mật số vi khuẩn, hàm lƣợng protein và đƣờng khử sinh ra và hoạt tính CMCase. 2.4.3. Bố trí thí nghiệm và phân tích thống kê Tất cả số liệu thu đƣợc trong đề tài đƣợc phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dƣới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design). Tất cả thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Giá trị trung bình đƣợc so sánh bằng việc kiểm tra thống kê khác biệt có ý nghĩa LSDT (Least Significant Difference Test) bằng phần mềm Statgraphic version 3.0. 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Khảo sát đặc tính sinh học của 14 dòng vi khuẩn. Mƣời bốn dòng vi khuẩn phân lập là cầu khuẩn Gram âm, kết thành chuỗi (kết đám), bắt cặp hoặc riêng lẻ, đa số các dòng có khả năng chuyển động ngoại trừ ba dòng 30, 32, 39, 42. Trên môi trƣờng thạch, khuẩn lạc có ba dạng: trắng sữa, vàng cam và vàng nhạt, bề mặt khuẩn lạc nhày, riêng dòng dòng 39 có dạng sần cứng. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong Hình 1 và Bảng 1. Hình 1. Hình thái vi khuẩn 3.2. Tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm cao Mƣời bốn dòng vi khuẩn đều tạo đƣợc đƣờng tròn thủy phân trên môi trƣờng CMC 1% có bổ sung Congo red Ind, cho thấy 14 dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng sinh cellulase để sử dụng cellulose (Võ Chí Đức, 2010). Tuy nhiên, khi thử nghiệm trên môi trƣờng thạch rơm, chỉ có hai dòng 43 và 51 tạo đƣợc đƣờng tròn thủy phân (Hình 2). Đƣờng tròn thủy phân của dòng 51 có đƣờng kính 23,00mm. Đƣờng kính đƣờng tròn thủy phân của dòng 43 ở ba lần lặp lại là 13,00, 12,00 và 14,00mm. Kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa ở 5% đƣờng kính đƣờng tròn thủy phân của hai dòng 43 và 51. Tuy nhiên, dòng 51 chỉ tạo đƣợc 1 đƣờng tròn thủy phân ở thí nghiệm 3 lần lặp lại, kém ổn định hơn so với dòng 43. Do đó, dòng 43 đƣợc chọn để khảo sát ở các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của dòng vi khuẩn 43 pH và nhiệt độ Bảng 1. Hình thái khuẩn lạc của 14 dòng vi khuẩn phân lập Hình 2. Đƣờng kính đƣờng tròn thùy phân của 2 dòng 51 và 43 sau 5 ngày ủ. pH và nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của vi khuẩn và hoạt tính cellulase. Biểu đồ 1 cho thấy dòng 43 không tạo đƣờng tròn thủy phân sau 5 ngày ủ trên môi trƣờng pH 4,0 và 11,0. Tại pH 10,0, đƣờng tròn thủy phân không xuất hiện ở các nhiệt độ ủ 25, 25 và 50oC. Khả năng thủy phân rơm của vi khuẩn tăng tại pH 5,0, 6,0 và giảm trong khoảng pH 7,0-10,0. Về sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, sự thay đổi đƣờng kính thủy phân cũng tƣơng tự nhƣ với ảnh hƣởng của giá trị pH. Giá trị trung bình đƣờng kính vòng tròn thủy phân đạt cao nhất tại nhiệt độ 30oC sau đó giảm dần ở các nhiệt độ còn lại với mọi giá trị pH thay đổi. Tóm lại, kết quả thí nghiệm đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng tƣơng tác giữa nhân tố pH và nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của dòng vi khuẩn 52. Giá trị pH 6,0 và nhiệt độ là 30oC (ứng với đƣờng kính đƣờng tròn thủy phân 26,33mm) đƣợc chọn bố trí cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo. Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng vi khuẩn 43 tăng trƣởng chậm (Biểu đồ 2a). Giai đoạn tiềm phát kéo dài trong 2 ngày, mật số vi khuẩn giảm từ 4,5x108 CFU/ml (ngày 0) còn 3x10 8 CFU/ml (ngày 2). Tại ngày 3, vi khuẩn bƣớc vào giai đoạn pha chỉ số, mật số vi khuẩn tăng lên 2x109 CFU/ml và đạt đƣợc cao nhất 4,5x1010 CFU/ml (ngày 4). Mật số vi khuẩn giảm nhẹ trong ngày 5 2,8x1010CFU/ml. Lƣợng đƣờng khử sinh ra và hoạt tính CMCase tại ngày 1, 2, 3 đo đƣợc bằng 0 (Biểu đồ 2b, c). Hàm Biểu đồ 1. Ảnh hƣởng pH và nhiệt độ đến đƣờng kính đƣờng tròn thủy phân của dòng vi khuẩn 43 lƣợng đƣờng khử và hoạt tính CMCase tăng tuyến tính tại ngày 4, 5 và đạt đƣợc giá trị cao nhất tại ngày 5 0,054µg/ml, 0,006 U/ml. Tại ngày 6, 7, vi khuẩn bƣớc vào pha suy vong, mật số vi khuẩn, hàm lƣợng đƣờng khử sinh ra và hoạt tính CMCase đo đƣợc giảm mạnh (Biểu đồ 2a, b). Tại ngày 5, mật số vi khuẩn đạt 2,8x1010 CFU/ml thấp hơn ngày 4; tuy nhiên, hàm lƣợng đƣờng khử sinh ra và hoạt tính CMCase đạt cao nhất 0,054µg/ml và 0,006 U/ml. Do đó, thời gian ủ thích hợp cho hiệu suất thủy phân rơm cao nhất của dòng 43 là 5 ngày. 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Trong 14 dòng vi khuẩn kỵ khí khảo sát, đề tài đã chọn đƣợc dòng vi khuẩn 43 có khả năng sinh cellulase cao nhất trên môi trƣờng rơm. Việc sinh enzyme cellulase của dòng 43 là tốt nhật tại điều kiện nhiệt độ 30oC, pH 6,0 với thời gian ủ là 5 ngày. Biểu đồ 2a. Đƣờng cong tăng trƣởng của dòng vi khuẩn 43 Biểu đồ 2b. Lƣợng đƣờng khử sinh ra theo thời gian 4.2. Đề nghị Tiến hành định danh dòng vi khuẩn 43. Khảo sát các nhân tố ảnh hƣởng đến hiệu quả thủy phân rơm của vi khuẩn: phƣơng pháp xử lý rơm, nồng độ rơm, mật độ vi khuẩn ban đầu để làm cơ sở tiến hành tách chiết và tinh sạch enzyme cellulase. TÀI LIỆU THAM KHẢO Abhaykumar, V.K. and H.C. Dube, (1992). Cellulases of Vibrio agar-liquefaciens isolated from sea mud. Microbiol. and Biotechl. (8): 313-315. Abidin, and T.J.Kempton. (1981). Effects of treatment of barley straw with anhydrous ammonia and supplementation with heattreated protein meals on feed intake and liveweight performance of growing lambs. Anim. Feed Sci. Technol., 6:145:155. Akin, D. E., and R. Benner. (1988). Degradation of polysaccharides and lignin by ruminal bacteria and fungi. Appl. Environ.Microbiol, 54:1117-1125 Adebowale, E.A., Orskov, E.R. and P.M. Hoten. (1989). Rumen degradation of straw. 8: Effect of alkaline hydrogen peroxide on degradation of straw using either sodium hydroxide or gaseous ammonia as source of alkali. Anim. Feed Sci. Technol., 6:145:155. Abou-Taleb, A.A. Khadiga, W.A. Mashhoor, A. Sohair, M.S. Sharaf and H.M. Hoda, (2009). Nutritional and Environmental Factors Affecting Cellulase Production by Two Strains of Cellulolytic Bacilli. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 3(3): 2429-2436. Amtul, J. S., (1989). Purification and Characterization of Microbial Cellulolytic Enzymes. Ph.D. Thesis, Institute of Chemistry, University of the Punjab Lahore – 1, Pakistan, pp: 176. Ariffin, H, N. Abdullah, M.S.U. Kalsom, Y. Shirai, M.A. Hassan, (006). Production and characterization of cellulase by Bacillus pumilus EB3. Int. J. Eng. Tech. 3(1):47-53. Azzaz, H.H., (2009). Effect of cellulolytic enzymes addition to diets on the productive performance of lactating goats. M.Sc. Thesis, Faculty of Agriculture, Cario University, Egypt, pp: 141. Badhan, A.K., B.S. Chadha, K.G. Sonia, H.S. Saini and M.K. Bhat, (2004). Functionally diverse multiple xylanases of thermophilic fungus Myceliophthora sp. IMI 387099. Enz. and Microbiol. Technol. 35, 460–466. Bahkali, A.H., (1996). Influence of various carbohydrates on xylanase production by V. tricorpus. Bioresource Technol. 33(3): 265 - 268. Bauchop, T. (1979). The rumen anaerobic fungi: colonizers of plant fibre. Ann. Rech. Vet. 10:246-248. Bauchop, T. (1981). The anaerobic fungi in rumen fibre digestion. Agric. Environ. 6:339-348. Cherry, J.R. and Fidantsef, A.L. (2003). Directed evolution of industrial enzymes: An update.Current Opinion in Biotechnology, vol. 14, no. 4, p. 438-443. Kirk, O.; Borchert, T.V. and Fuglsang, C.C. (2002). Industrial enzyme applications. Current Opinion in Biotechnology, vol. 13, no. 4, p. 345-351. Trần Sỹ Nam, Nguyễn Thị Huỳnh Nhƣ, Nguyễn Hữu Chiếm, Nguyễn Võ Châu Ngân, Lê Hoàng Việt và Kjeld Ingvorsen, (2014). ƢỚC TÍNH LƢỢNG VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ RƠM RẠ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ và Môi trường: 32 (2014): 87-93