Ứng dụng enzyme α-Amylase, glucoamylase và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp

giữa các mạng là amylose và amylosepectin . Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết hydro. Ngoài các liên kết trên trong tinh bột còn có các liên kết khác chắn chắn hơn (do sự xoắn mạch của các mạch amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết. Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu hạt, người ta thường bổ sung một lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu. Khi làm nguội, dung dịch amylosepectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng. Đối với dung dịch amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 20 Do đó làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá. Một biện pháp kĩ thuật thường dùng là sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) 2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp Nguyên liệu tinh bột của nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải qua giai đoạn đường hoá. Tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase. Enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên men. Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme. Nếu vượt quá nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ hơn đối với cơ chất. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần của sản phẩm đường hóa. Khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra nhiều hơn so với đường khử. Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu suất thu hồi. pH Bản chất của enzyem là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein. Những nhóm hoá học cơ bản của enzyem có khả năng ion hoá. Sự hiện diện của ion H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này. Nếu nhóm này là trung tâm hoạt động của enzyem thì sẽ kiềm hãm hay kích thích enzyem tuỳ theo nồng độ. pH tối thích của enzyem amylase trong khoảng 4,5 ÷ 5,5. Thời gian đường hóa Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá. Thời gian đường hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng của dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi. Thời gian đường hoá có ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Khi đường hoá khối nấu ở nhiệt độ 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 21 Nồng độ enzyme Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ đường hóa tăng. Trong sản xuất tốc độ của sự phân hủy là một hàm số, là sự tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme. Phức hệ enzyme, nếu có sự khác nhau về loại, lượng, hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau. Chất sát khuẩn: Để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn trong quá trình đường hoá, các nhà máy sản xuất rượu thường sử dụng Na2SiF6, formol. Nồng độ chất sát trùng cao không gây ức chế có khi lại kích thích sự hoạt động của enzyem. 2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. - Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic - Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid accetic, citric Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa. Cơ chế của quá trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được lớn hơn 100 triệu tế bào trong 1ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường khử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màn vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2. Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg nhiệt độ 25 ÷ 30 0C là 0,856 ÷ 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 22 đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men luôn ở trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo các thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Các giai đoạn của quá trình lên men - Giai đoạn đầu: khoảng 60 giờ kể khi cho nấm men tiếp xúc với dịch men. Sự lên men xảy ra rất chậm. - Giai đoạn 2: đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 ÷ 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. - Giai đoạn 3: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau. Giai đoạn lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường, sau mỗi giờ nồng độ đường trong dung dịch lên men sẽ giảm đi, mức độ giảm tùy theo sản phẩm, dây chuyền sản xuất. Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường tồn tại trong dịch lên men là 100% thì 4 ÷ 6% là dạng chất không tan, 75 ÷ 77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin. Trong giai đoạn lên men, sự đường hoá cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hoà tan. Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự thuỷ phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy vậy, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 23 chu kì lên men cuối phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme . Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng, càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men. Tuy vậy, tuỳ theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ đường của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của tế bào nấm men, do đó cũng ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men và chất lượng rượu thành phẩm. Nấm men phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 ÷ 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 ÷ 220C có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 ÷ 450C. Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết. - Ảnh hưởng của pH pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm men phát triển tốt ở một pH nhất định gọi là pH tối thích. Nấm men trong sản xuất rượu vang có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là 4 ÷ 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH khoảng 3,8 ÷ 4,0. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường lên men người ta thường bổ sung vào môi trường acid. - Nồng độ đường Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 ÷ 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 ÷ 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. - Ảnh hưởng của nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 24 2.6 Quy trình sản xuất rượu vang nếp 2.6.1 Sơ đồ quy trình 2.6.2 Thuyết minh quy trình Nghiền Việc nghiền nhỏ nguyên liệu là khâu rất quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình hồ hóa tinh bột và quá trình thủy phân của enzyme. Nghiền nhằm tạo điều kiện để tăng tốc độ quá trình lý học và hóa sinh học trong khi hòa thấm hạt vào nước. Đồng thời nghiền nhỏ còn có tác dụng làm tăng cường tiếp xúc giữa nước và hạt giúp các chất hòa tan dễ dàng vào nươc khi nấu. Việc nghiền nhỏ nguyên liệu được thực hiện bằng máy nghiền búa. Gạo nếp Nghiền Hồ hóa, dịch hóa Làm nguội (30-350) Lên men chính Men giống Hãm cồn Lên men phụ Lọc thô Pha loãng Nước Enzyme α-amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 25 Nấu Mục đích: quá trình nấu nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không hòa tan thành trạng thái hòa tan trong nước, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme amylase dễ dàng thủy phân tinh bột. Tiến hành: cho khoảng 10% enzyme vào nếp đã được pha loãng sẵn sau đó nâng nhiệt độ lên 70 ÷ 720C và giữ ở nhiệt độ đó 15 phút để enzyme thực hiện quá trình dịch hóa. Tiếp tục đun dịch cháo đến nhiệt độ sôi và giữ ở đó khoảng 10 phút để quá trình hồ hóa xảy ra hoàn toàn. Làm nguội dịch cháo đến khoảng 65 ÷ 750C và cho toàn bộ lượng enzyme còn lại vào, iữ nhiệt độ này trong khoảng 30 phút đến khi quá trình đường hóa kết thúc rồi đem đi lọc. Làm nguội Sản phẩm sau khi nấu xong có nhiệt độ khá cao cần làm nguội đến điều kiện nhiệt độ phòng để nấm men phát triển và lên men. Lên men Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ phòng. Trong thời gian lên men có hai quá trình xảy ra song song ở mức độ khác nhau đó là quá trình phát triển của nấm men và quá trình rượu hóa. Hãm cồn Sau khi lên men nồng độ cồn trong dịch lên men khoảng 7 ÷ 10%. Với hàm lượng cồn này rượu rất khó bảo quản và chất lượng không cao. Vì vậy, ta cần bổ sung thêm một lượng cồn để tăng hàm lượng cồn trong sản phẩm và tăng khả năng bảo quản cũng như tăng chất lượng sản phẩm. Tùy theo yêu cầu của từng loại sản phẩm mà lượng cồn thêm vào khác nhau. Lên men phụ Rượu nếp được lên men và không qua chưng cất nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm và gây độc cho người tiêu dùng. Vì vậy, cần có thời gian lên men phụ để chuyển hóa và ổn định rượu làm cho chất lượng rượu tốt hơn. Thời gian lên men phụ thường là 6 tháng. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 26 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 07/01/2008 đến 12/04/2008. Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp & SHƯD – Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu Nếp được mua ở chợ, chọn loại không bị lẫn các loại nếp khác, có mùi thơm đặc trưng. Các loại enzyme α-amylase, glucoamylase, nấm men Saccharomyces cerevisiae ở dạng thương mại được mua ở các cửa hàng. Các loại enzyme phải đạt độ tinh khiết theo yêu cầu. 3.1.3 Hóa chất Acid citric dùng để chỉnh pH Dung dịch NaOH 0,05N; 0,1N và 1N Dung dịch fehling A, fehling B, Na2SO4, Pb(CH3COO)2 Các hóa chất khác. 3.1.4 Dụng cụ trang thiết bị Máy nghiền búa Cân Nồi hấp cách thủy Bếp điện Nhiệt kế, pH kế, chiết quang kế Ống nghiệm, ống đong, phễu, pipet, micropipet, buret và một số thiết bị dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu nếp được mua tại chợ Xuân Khánh – TP Cần Thơ. Nếp phải được lựa chọn thật kĩ, hạt phải đồng đều, không được lẫn gạo hoặc nếp khác, nếp có màu đục, có hương thơm tự nhiên. Mẫu phải được mua một lần cho tất cả các thí nghiệm để tránh sai số. Mẫu phải được bảo quản thật tốt trước khi đưa vào thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 27 Mẫu enzyme α-amylase và glucoamylase được mua tại cửa hàng hóa chất – TP Cần Thơ. Men sử dụng là hai loại men Saccharomyces vàng mua tại cửa hàng hóa chất. 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được bố trí với 2 hoặc 3 nhân tố với 3 lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Plus 4.0. 3.2.3 Phương pháp phân tích Xác định độ nhớt bằng nhớt kế (Phụ lục A.1) Phân tích hàm lượng chất khô (Phụ lục A.2) Phân tích hàm lượng đường khử trong thực phẩm (Phụ lục A.3) Phân tích nồng độ rượu bằng cồn kế (Phụ lục A.4) 3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến quá trình dịch hóa tinh bột nếp.
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thích hợp cho quá trình dịch hóa.
Chuẩn bị mẫu • Nếp đã được nghiền mịn • Nước để pha loãng nếp • Chế phẩm enzyme α-amylase thương mại • Dung dịch đệm chỉnh pH
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. • Nhân tố cố định: tỉ lệ pha loãng, pH, nhiệt độ. • Nhân tố A: Nồng độ enzyme α-amylase A1: 0,02% A2: 0,03% A3: 0,04% A4: 0,05% Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 28 • Nhân tố B: Thời gian dịch hóa B1: 10 phút B2: 15 phút B3: 20 phút A B A1 A2 A3 A4 B1 B1A1 B1A2 B1A3 B1A4 B2 B2A1 B2A2 B2A3 B2A4 B3 B3A1 B3A2 B3A3 B3A4 • Tổng số nghiệm thức: 3 x 4 = 12 nghiệm thức • Số đơn vị thí nghiệm: 12 x 3 = 36 đơn vị • Phương pháp đánh giá: đo độ nhớt bằng nhớt kế • Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Gạo nếp Nghiền Pha loãng 1:4 Đo độ nhớt Chỉnh pH 6,5 Dịch hóa (850C) Enzyme α-amylase Làm nguội Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 29 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa.
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ và thời gian thích hợp cho quá trình đường hóa.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. • Nhân tố C: nồng độ enzyme α-amylase (%) C1: 0,1% C2: 0,2% C3: 0,3% C4: 0,4% • Nhân tố D: thời gian thủy phân D1: 10 phút D2: 20 phút D3: 30 phút D4: 40 phút C D C1 C2 C3 C4 D1 D1C1 D1C2 D1C3 D1C4 D2 D2C1 D2C2 D2C3 D2C4 D3 D3C1 D3C2 D3C3 D3C4 D4 D4C1 D4C2 D4C3 D4C4 • Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức • Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị • Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Gạo nếp Dịch hóa (850C) Hồ hóa (1000C) Đường hóa Enzyme α-amylase Chuẩn đường khử Enzyme α-amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 30 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa.
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ glucoamylase và thời gian thích hợp cho quá trình đường hóa.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. • Nhân tố E: nồng độ enzyme glucoamylase E1: 0,1% E2: 0,2% E3: 0,3% E4: 0,4% • Nhân tố F: thời gian thủy phân F1: 0 phút F2: 10 phút F3: 20 phút F4: 30 phút E F E1 E2 E3 E4 F1 F1E1 F1E2 F1E3 F1E4 F2 F2E1 F2E2 F2E3 F2E4 F3 F3E1 F3E2 F3E3 F3E4 F4 F4E1 F4E2 F4E3 F4E4 • Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức • Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị • Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Gạo nếp Đường hóa Làm nguội 650C Enzyme glucoamylase Chuẩn đường khử Enzyme α-amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 31 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến quá trình dịch hóa tinh bột nếp. Tài liệu tham khảo cho thấy, nguyên liệu nếp có hàm lượng tinh bột rất cao. Khi hồ hóa, hàm lượng tinh bột này sẽ làm độ nhớt của dịch nếp tăng cao gây cản trở cho quá trình đường hóa sau này. Chính vì vậy, việc sử dụng enzyme α-amylase để phân cắt một phần tinh bột nhằm làm giảm độ nhớt là rất cần thiết. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chế phẩm enzyme α-amylase thương mại để thực hiện quá trình dịch hóa, nhiệt độ và pH thực hiện quá trình dịch hóa là 850C và 6,5 (kết quả khảo sát động học của Nguyễn Thị Giang Thanh). Thí nghiệm được tiến hành với hai nhân tố và ba lần lặp lại. Kết quả được thể hiện như sau: 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 10 15 20 Thời gian Đ ộ n hớ t 0.02% 0.03% 0.04% 0.05% Hình 12. Đồ thị biểu hiện sự giảm độ nhớt theo nồng độ enzyme và thời gian Bảng 5. Độ nhớt dịch nếp khi dịch hóa ở các mức nồng độ enzyme và thời gian 0,02% 0.03% 0,04% 0,05% Trung bình (Thời gian) 10 28,67 16 14,67 14 18,33b 15 24 11 11,33 11,67 14,5a 20 23 11 10 10,33 13,58a Trung bình (Nồng độ) 25,22 b 12,67a 12a 12a Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5% Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. Thời gian Nồng độ Đ ộ n hớ t ( C p) Thời gian (phút) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 32 86.7194 - 2695.56*x - 2.44667*y +31388.9*x*x + 6.33333*x*y + 0.0583333*y*y 0.02 0.03 0.04 0.05 10 15 20 8 12 16 20 24 28 86.7194 - 2695.56*x - 2.44667*y +31388.9*x*x + 6.33333*x*y + 0.0583333*y*y 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 26.0 28.00.02 0.03 0.04 0.05 10 15 20 Hình 13. Đồ thị mối quan hệ giữa độ nhớt với nồng độ enzyme và thời gian Việc sử dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa sẽ làm giảm đáng kể độ nhớt của dịch nếp. Mẫu đối chứng cho thấy nếu không sử dụng enzyme α-amylase để dịch hóa thì dịch nếp sẽ rất sệt, do khi nấu tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên, hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần đó là nguyên nhân làm dịch nếp sệt không khuấy được (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Khi sử dụng enzyme α-amylase để dịch hóa ở các nồng độ khác nhau và các mức thời gian khác nhau sẽ làm giảm độ nhớt của dịch nếp ở các mức độ khác nhau. Kết quả thống kê ở bảng 5 và đồ thị hình 12 cho thấy khi nồng độ enzyme sử dụng tăng từ 0,02% đến 0,03% thì độ nhớt giảm đáng kể (có sự khác biệt ý nghĩa 5% về độ nhớt khi dịch hóa ở hai mức nồng độ 0,02% và 0,03%). Khi nồng độ enzyme tăng từ 0,03% đến 0,05% thì độ nhớt giảm không đáng kể (không có sự khác biệt ý Z = 86,7194 – 2695,56X – 2,44667Y + 3188,9X2 + 6,3333XY + 0,05833Y2 Nồng độ enzyme (%) Đ ộ n hớ t ( C p) Thời gian (phút) Th ờ i g ia n (P hú t) Z = 86,7194 – 2695,56X – 2,44667Y + 3188,9X2 + 6,3333XY + 0,05833Y2 Độ nhớt (Cp) (a) (b) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 33 nghĩa 5% về độ nhớt khi dịch hóa ở ba mức nồng độ 0,03%, 0,04%, 0,05%). Như vậy, nồng độ enzyme α-amylase sử dụng hiệu quả là 0,03%. Kết quả thống kê và đồ thị hình 12 cũng cho thấy, thời gian dịch hóa càng dài thì độ nhớt dịch nếp càng giảm nhưng không đều. Độ nhớt giảm nhiều ở giai đoạn đầu (có sự khác biệt ý nghĩa 5% về độ nhớt khi dịch hóa ở hai mức thời gian 10 phút và 15 phút), giảm không đáng kể ở giai đoạn sau (không có sự khác biệt ý nghĩa 5% về độ nhớt khi dịch hóa ở hai mức thời gian 15 và 20 phút). Như vậy, thời gian dịch hóa hiệu quả nhất là 15 phút. Đồ thị hình 13a là đồ thị ba chiều thể hiện sự phụ thuộc của độ nhớt vào nồng độ enzyme sử dụng và thời gian dịch hóa. Đồ thị hình 13b là đồ thị contour giúp ta chọn nồng độ enzyme và thời gian tối ưu cho quá trình dịch hóa. Độ nhớt của dịch nếp là do các phân tử amylose và amylosepectin tạo ra. Thành phần này càng nhiều thì dịch nếp có độ nhớt càng cao. Enzyme α-amylase sẽ phân cắt dần các phân tử amylose và amylosepectin thành chất tan (dextrin, maltose, glucose,) làm giảm dần độ nhớt của dịch nếp. Enzyme α-amylase sử dụng với nồng độ cao thì độ nhớt giảm nhanh và ngược lại. Tuy nhiên, độ nhớt của dịch nếp giảm đến một giá trị nào đó thì mức độ giảm không đáng kể do amylose và amylosepectin đã được phân cắt gần hết. Như vậy, theo kết quả trên, quá trình dịch hóa ở nồng độ enzyme α-amylase 0,03% trong thời gian 15 phút cho hiệu quả cao về mặt kinh tế cũng như kỹ thuật. 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa. Nguyên liệu tinh bột của nếp không thể trực tiếp lên men được, do đó đường hóa nguyên liệu là một công đoạn không thể thiếu đối với công nghệ lên men rượu vang nếp. Trong quá trình đường hóa, enzyme sẽ phân cắt tinh bột thành đường để nấm men sử dụng lên men. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi quan tâm nhiều đến hàm lượng đường khử - loại đường chủ yếu mà nấm men sử dụng lên men. Tiến hành thí nghiệm, chúng tôi sử dụng enzyme α-amylase thương mại để đường hóa với các nồng độ và các mức thời gian khác nhau. Để quá trình đường hóa xảy ra nhanh và hiệu quả, chúng tôi cố định các nhân tố tối ưu cho quá trình dịch hóa ở trên. Thí nghiệm với hai nhân tố và ba lần lặp lại thu được kết quả như sau: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 34 Bảng 6. Hàm lượng đường khử khi đường hóa ở các mức nồng độ enzyme và thời gian khác nhau. 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Trung bình (Thời gian) 10 3,33 4 4,52 4,75 4,15a 20 4,45 4,75 5,34 5,42 4,99b 30 5,09 5,7 6,03 5,95 5,69c 40 5,33 5,98 6,26 6,31 5,97d Trung bình (Nồng độ) 4,55 c 5,11b 5,54a 5,61a Các chữ số khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5% Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. 10 20 30 40 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Đ ư ờ n g kh ử Thời gian 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Hình 14. Đồ thị biểu diễn sự tăng hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme α- amylase và thời gian đường hóa Nồng độ Thời gian Đ ư ờ n g kh ử (% ) Thời gian (phút) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 35 1.11208 + 11.085*x + 0.144942*y -12.3333*x*x - 0.0525333*x*y- 0.00140417*y*y 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 10 20 30 40 3 4 5 6 7 1.11208 + 11.085*x + 0.144942*y -12.3333*x*x - 0.0525333*x*y- 0.00140417*y*y Duong khu 3.3 3.6 3.9 4.2 4.5 4.8 5.1 5.4 5.7 6.0 6.30.1 0.2 0.3 0.4 0.5 10 20 30 40 Hình 15. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa độ nhớt với nồng độ enzyme và thời gian Theo lý thuyết, enzyme α-amylase phân cắt tinh bột thành nhiều loại đường khác nhau, trong đó chỉ có đường khử là được nấm men sử dụng để lên men. Khi sử dụng enzyme α-amylase cho quá trình đường hóa, hàm lượng đường khử tăng theo nồng độ enzyme và thời gian. Kết quả thống kê ở bảng 6 và đồ thị hình 14 cho thấy, hàm lượng đường khử tăng theo nồng độ enzyme α-amylase sử dụng nhưng không đều. Hàm lượng đường khử tăng nhiều khi nồng độ enzyme α-amylase tăng từ 0,1% đến 0,3% (có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi đường hóa ở ba mức nồng độ enzyme khác nhau), tăng chậm khi nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,4% (không có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi đường hóa ở hai mức nồng độ enzyme 0,3% và 0,4%). Như vậy, chọn nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình đường hóa là 0,3%. Hàm lượng đường khử cũng tăng theo thời gian đường hóa, tăng nhanh trong khoảng thời gian 10 phút đến 30 phút và tăng chậm trong khoảng thời gian 30 phút Z = 1,11208 + 11,085X + 0,144942Y – 12,3333X2 – 0,0525333XY – 0,001404Y2 Nồng độ (%) Thời gian (phút) Đ ư ờn g kh ử (% ) Nồng độ (%) Đường khử (%) Z = 1,11208 + 11,085X + 0,144942Y – 12,3333X2 – 0,0525333XY – 0,001404Y2 Th ờ i g ia n (p hú t) (a) (b) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 36 đến 40 phút. Kết quả thống kê cho thấy, có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi đường hóa ở bốn mức thời gian khác nhau. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, chúng ta nên dừng lại ở thời gian 30 phút vì càng về sau hàm lượng đường khử tăng không đáng kể. Đồ thị hình 15a là đồ thị ba chiều thể hiện sự phụ thuộc của hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme và thời gian đường hóa. Hàm lượng đường khử tăng theo nồng độ enzyme và thời gian đường hóa. Đồ thị 15b là đồ thị contour cho phép chọn điểm tối ưu về nồng độ enzyme và thời gian cho quá trình đường hóa. Hoạt động của enzyme α-amylase chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như nồng độ enzyme sử dụng, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, thời gian, chất hoạt hóa, chất ức chế,Trong thí nghiệm này tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH, chất hoạt hóa, chất ức chế đều được kiểm soát. Hoạt động của enzyme α-amylase chỉ chịu ảnh hưởng chủ yếu bởi nồng độ enzyme sử dụng, nồng độ cơ chất và thời gian. Enzyme α- amylase phân cắt amylose và amylosepectin thành nhiều loại đường trong đó có đường khử. Nồng độ enzyme càng cao, thời gian càng dài thì hàm lượng đường khử càng nhiều. Khi nồng độ enzyme tăng từ 0,1% đến 0,3% và thời gian từ 10 phút đến 30 phút thì hàm lượng đường khử tăng nhanh hơn là do enzyme α-amylase đã cắt gần hết các liên kết 1,4 glycoside phần còn lại là các phân tử dextrin nhánh có liên kết 1,6 glycoside mà enzyme α-amylase không cắt được liên kết 1,6 glycoside. 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa Từ kết quả thí nghiệm 2, khi sử dụng đơn thuần enzyme α-amylase, hàm lượng đường khử sinh ra không cao, chỉ khoảng 5 - 6% (dữ liệu không thể hiện). Với hàm lượng này, quá trình lên men diễn ra không tốt do không đủ đường khử cho nấm men sử dụng lên men, thể hiện ở độ cồn lên men thử chỉ khoảng 3% (kết quả của Trần Thị Hồng Chúc). Vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao hiệu suất lên men? Khi đó một trong những biện pháp hiệu quả là sử dụng enzyme glucoamylase. Trong khi thí nghiệm, chúng tôi cố định các nhân tố của thí nghiệm trên và khảo sát nồng độ sử dụng enzyme glucoamylase ở các mức thời gian khác nhau. Thí nghiệm được thực hiện với hai nhân tố và ba lần lặp lại. Kết quả như sau: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 37 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 20 30 40 Thời gian (phút) Đ ư ờ n g kh ử (% ) 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Hình 16. Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử tăng theo nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian sử dụng. Bảng 7. Hàm lượng đường khử khi đường hóa ở các mức nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian khác nhau 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Trung bình (Thời gian) 20 5,86 5,77 5,70 5,86 5,8b 30 8,11 8,62 9,49 9,67 8,97a 40 9,77 10,66 11,03 11,03 10,63a Trung bình (Nồng độ) 9,98 c 10,79b 11,30a 11,43a Các chữ số khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5% Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. Nồng độ Thời gian Thời gian (phút) Đ ư ờ n g kh ử (% ) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 38 -0.796389 + 13.7889*x + 0.524333*y -15.7778*x*x - 0.0353333*x*y - 0.00700833*y*y 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 20 30 40 5 7 9 11 13 -0.796389 + 13.7889*x + 0.524333*y -15.7778*x*x - 0.0353333*y*x - 0.00700833*y*y 8.0 8.4 8.8 9.2 9.6 10.0 10.4 10.8 11.2 11.6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 20 30 40 Hình 17. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian. Theo lý thuyết và thí nghiệm thăm dò, việc bổ sung enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa sẽ làm tăng đáng kể hàm lượng đường khử (so với mẫu đối chứng, hàm lượng đường khử tăng gấp đôi). Enzyme glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside trong tinh bột. Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một, sản phẩm tạo thành chủ yếu là glucose. Kết quả thống kê ở bảng 7 và đồ thị hình 16 cho thấy, hàm lượng đường khử tăng nhanh khi nồng độ enzyme tăng từ 0,1% đến 0,3% (có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi bổ sung enzyme glucoamylase ở ba mức nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,3%). Bên cạnh đó, hàm lượng đường khử tăng không đáng kể khi nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,4% (không có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi bổ sung enzyme glucoamylase ở hai mức nồng độ 0,3%, 0,4%). Do đó, chọn nồng độ enzyme glucoamylase thích hợp nhất là 0,3%. Z = – 0,796389 + 13,7889X + 0,524333Y – 15,7778X2 – 0,0353333XY – 0.007Y2 Nồng độ (%) Thời gian (phút) Đ ư ờ n g kh ử (% ) Z = – 0,796389 + 13,7889X + 0,524333Y – 15,7778X2 – 0,0353333XY – 0.007Y2 Nồng độ (%) Th ời gi a n (p hú t) Đường khử (%) (a) (b) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 39 Về mặt thời gian, hàm lượng đường khử cũng tăng theo thời gian đường hóa. Khoảng thời gian từ 20 phút đến 30 phút, hàm lượng đường khử tăng đáng kể (có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi bổ sung enzyme glucose amylase giữ ở hai mức thời gian 20 phút và 30 phút), tăng chậm ở khoảng thời gian sau (không có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hàm lượng đường khử khi bổ sung enzyme glucose amylase giữ ở hai mức thời gian 30 phút và 40 phút). Do vậy, khi bổ sung enzyme glucoamylase nên giữ khoảng 30 phút sẽ cho hiệu quả kinh tế cao nhất vì cho dù có giữ lâu hơn thì vẫn không tăng thêm được hàm lượng đường khử. Đồ thị hình 17a là đồ thị không gian ba chiều thể hiện sự phụ thuộc của hàm lượng đường khử sinh ra vào nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian sử dụng. Đồ thị 17b là đồ thị contour cho phép ta chọn nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích hợp. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 40 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua tham khảo các nguồn tài liệu đã được công bố và tiến hành các thí nghiệm nhằm tìm ra điều kiện tốt nhất cho quá trình thủy phân dịch nếp đạt hiệu quả cao, chúng tôi tìm ra những thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như sau: - Đối với quá trình dịch hóa sử dụng enzyme α-amylase: nồng độ enzyme α-amylase sử dụng hiệu quả nhất là 0,03% và thời gian dịch hóa tốt nhất là 15 phút . - Đối với quá trình đường hóa sử dụng enzyme α-amylase: nồng độ enzyme α- amylase thích hợp cho quá trình đường hóa là 0,3% và thời gian đường hoá tốt nhất là 30 phút . - Đối với quá trình đường hóa sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase: nồng độ enzyme glucoamylase thích hợp nhất là 0,3% và thời gian sử dụng glucoseamylase thích hợp cho hiệu quả kinh tế cao là 30 phút. 5.2 Đề nghị - Khảo sát động học phản ứng của enzyme α-amylase theo độ nhớt. - Tối ưu hóa quá trình lên men cho sản phẩm vang nếp thơm có chất lượng tốt và hiệu quả cao. - Khảo sát các thành phần phụ sinh ra trong suốt quá trình lên men. - Nghiên cứu và so sánh phương pháp bảo quản sản phẩm rượu vang nếp thơm bằng E200 và sorbic. - Ứng dụng enzyme và nấm men thuần chủng để sản xuất rượu nếp chưng cất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 41 5.3 Kết luận quy trình sản xuất rượu vang nếp Gạo nếp Nghiền Pha loãng 1:4 Chỉnh pH 6,5 Dịch hóa (850C) Enzyme α-amylase Hồ hóa (1000C) Đường hóa Enzyme α-amylase Làm nguội (30-350C) Lên men chính Men giống Lọc Hãm cồn Lên men phụ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Hữu Thuận, 2004, Bài giảng sinh hóa thực phẩm, Đại học Cần Thơ 2. Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004, Bài giảng công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát, Đại học Cần Thơ 3. Lê Minh Châu, 2007, Ảnh hưởng của các loại nấm men, pH đến quá trình lên men và chất lượng rượu vang nếp than khi lên men dịch đường đã thuỷ phân bằng enzyme, Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm 4. Lê Thanh Mai, 2005, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học - Kỹ thuật 5. Nguyễn Đình Thưởng, 2005, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn thực phẩm, NXB Khoa học - Kỹ thuật 6. Nguyễn Đức lượng và ctv, 2004, Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 7. Nguyễn Đức Lượng, 2003, Công nghệ vi sinh vật (tập 3), NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thanh Vũ, 2007, Ảnh hưởng của loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH đến quá trình thuỷ phân nếp than ứng dụng cho quá trình lên men, Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 43 PHỤ LỤC Phụ lục A: Phương pháp phân tích A.1 Xác định độ nhớt Nguyên tắc: Xác định độ nhớt ở 200C bằng nhớt kế đã được hiệu chuẩn. Dụng cụ: • Nhớt kế • Bình ổn nhiệt • Đồng hồ bấm giây (0,2 s) Tiến hành: • Hiệu chuẩn: hiệu chuẩn dụng cụ đo độ nhớt theo chỉ dẫn, đảm bảo thực hiện ở nhiệt độ không đổi 200C. Kiểm tra độ chuẩn của dụng cụ bằng cách đo độ nhớt ở 200C của nước = 1,002 mPa.s • Chuẩn bị mẫu: lọc dịch đường đảm bảo không còn hạt nhỏ nào. • Tiến hành đo: đổ đầy dịch đường vào nhớt kế, đo độ nhớt theo chỉ dẫn, lặp lại thí nghiệm nhiều lần để lấy giá trị trung bình. • Kết quả của dịch nhớt tính theo mPa.s theo công thức đưa ra tùy thuộc thiết bị sử dụng. A.2 Phân tích hàm lượng chất khô Nguyên tắc: Trong dịch đường hóa luôn có chứa một lượng chất hòa tan, chủ yếu là tinh bột tan, dextrin và đường oligo có số gốc glucose khác nhau, maltose và glucose. Các chất này mang tên chung là chất tan hay chất khô của dịch đường. Dùng chiết suất để suy ra nồng chất tan trong dung dịch, khi nồng độ dung dịch tăng thì chiết suất tăng. Tiến hành: • Đường hóa xong, đem lọc dịch đường rồi đem dịch đường đo độ Brix. • Hiệu chỉnh chiết quang kế: về nguyên tắc, nước cất không chứa chất tan, do vậy người ta dùng nước cất để hiệu chỉnh chiết quang kế về 0. Nhỏ một giọt nước cất (nhiệt độ 200C) lên mặt kính đo. Chú ý không tạo bọt và đậy mặt kính lại. Điều chỉnh vít vặn sao cho dãy phân cách giữa hai vùng sáng tối rõ nét và ở đúng điểm 0. • Phương pháp đo: lấy một giọt dung dịch cần đo nhỏ lên bề mặt kính đo. Chú ý không tạo bọt và đóng mặt kính lại. Đọc chỉ số tương ứng trên dãy phân cách. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 44 • Chú ý: Trước và sau khi đo phải dùng bông mền lau thật sạch mặt kính. Thường xuyên kiểm tra điểm 0 của chiết quang kế bằng nước cất. Chiết quang kế chỉ cho ta nồng độ chất khô hòa tan mà thôi. A.3 Phân tích hàm lượng đường khử trong thực phẩm Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm các chất khử như (glucose, fructose, maltose,) dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng fehling. Kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch. Lượng Cu2O tương ứng với lượng đường khử. R-CHO + Cu(OH)2 → R-COOH + Cu2O + H2O Căn cứ vào lượng đường khử đủ để tác dụng với 10ml hỗn hợp fehling A và B cho màu đỏ gạch bền vững, tra bảng tính hàm lượng đường cần phân tích. Hóa chất sử dụng: 1. NaOH 30%, 10%, 1N 2. Pb(CH3COO)2 30% 3. Na2SO4 bão hòa (30%) 4. Metyl xanh 1% trong nước 5. Fehling A: CuSO4 tinh thể 69.28g Nước cất đến 1000ml 6. Fehling B: Kalinatritartrate 346g NaOH 100g Nước cất đến 1000ml 7. Phenolphtalein 1% trong cồn Tiến hành: Cân m gam mẫu cho vào cốc (tùy theo nồng độ đường trong mẫu, đường nhiều cân khối lượng mẫu ít, đường ít cân khối lượng mẫu nhiều). • Thêm vào trong đó 50ml nước cất và 5ml HCl đậm đặc, thủy phân dung dịch trong thời gian 7 phút ở nhiệt độ 68 ÷ 700 C. • Sau khi thủy phân tiến hành làm lạnh ngay, trung hòa bằng NaOH với nồng độ giảm dần 30%, 10%, 1N. • Khử tạp chất bằng 7ml Pb(CH3COO)2 30%. Để yên 5 phút đến khi thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn thì coi như đã khử xong tạp chất. • Kết tủa muối chì bằng 18 ÷ 20ml Na2SO4. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 45 • Lọc pha loãng sau khi sử dụng. Tùy hàm lượng đường trong dung dịch mà ta có hệ số pha loãng khác nhau. • Cho vào becher 5ml Fehling A + 5ml Fehling B + 15ml dịch lọc pha loãng. Đem đốt trên bếp và chuẩn độ. Mỗi lần chuẩn nhỏ 1ml dung dịch chuẩn đến màu đỏ gạch, không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt methyl xanh vào dung dịch đang sôi, thấy màu xanh trên màu đỏ gạch. Đọc kết quả tra bảng ra hàm lượng đường. Bảng 8. Bảng tra hàm lượng đường ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển 15 336 24 213,3 33 156,06 42 124,2 16 316 25 204,8 34 152,2 43 121,4 17 298 26 197,4 35 147,09 44 118,7 18 282 27 190,4 36 143,9 45 116,1 19 267 28 183,7 37 140,2 46 113,7 20 254,5 29 177,6 38 136,6 47 111,4 21 242,9 30 171,7 39 133,3 48 109,2 22 231,8 31 166,3 40 130,1 49 107,1 23 222,2 32 161,2 41 127,1 50 105,1 A.4 Phân tích nồng độ rượu bằng cồn kế Nguyên tắc: Cồn kế được thiết lập theo định luật Acsimet có nhiều loại. Loại dùng để đo nồng độ từ 0 đến 10%, 10 đến 20%,90 đến 100%. Mỗi vạch trên thước đo ứng với 1% thể tích. Đối với loại cần xác định chính xác lại chia thành vạch nhỏ hơn 0,1%. Tiến hành: • Rót cồn hoặc rượu vào ống đo đặc thẳng đứng, ống đo phải sạch, khô và phải tráng qua dịch đo. Nhiệt độ khi đo cần làm lạnh đến nhiệt độ 200C. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 46 • Từ từ nhúng thước đo vào, buông tay để thước nổi tự do rồi đọc kết quả đo được. Đọc 2 đến 3 lần để lấy kết quả trung bình. Khi đọc phải đặt mắt ngang tầm mực chất lỏng và không đọc ở phần lồi hoặc lõm. Trong mỗi dung dịch đều chứa các chất hoạt động bề mặt và do đó làm ảnh hưởng tới sức căng bề mặt, chỉ số đọc được trên thước đo, dẫn đến làm tăng hoặc giảm so với nồng độ thực tế. Phụ lục B: Kết quả phân tích thống kê B1. Thí nghiệm 1 - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến quá trình dịch hóa tinh bột nếp Analysis of Variance for Do nhot - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Nong do 1143.42 3 381.139 428.78 0.0000 B:Thoi gian 152.389 2 76.1944 85.72 0.0000 INTERACTIONS AB 7.83333 6 1.30556 1.47 0.2309 RESIDUAL 21.3333 24 0.888889 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1324.97 35 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Do nhot by Nong do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nong do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0.05 9 12.0 X 0.04 9 12.0 X 0.03 9 12.6667 X 0.02 9 25.2222 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0.02 - 0.03 *12.5556 1.24309 0.02 - 0.04 *13.2222 1.24309 0.02 - 0.05 *13.2222 1.24309 0.03 - 0.04 0.666667 1.24309 0.03 - 0.05 0.666667 1.24309 0.04 - 0.05 0.0 1.24309 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Do nhot by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 20 12 13.5833 X 15 12 14.5 X 10 12 18.3333 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 15 *3.83333 1.07654 10 - 20 *4.75 1.07654 15 - 20 0.916667 1.07654 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 47 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. B2. Thí nghiệm 2 – Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa Analysis of Variance for Duong khu - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Nong do enzyme 8.55767 3 2.85256 88.47 0.0000 B:Thoi gian 23.7608 3 7.92027 245.65 0.0000 INTERACTIONS AB 0.465175 9 0.0516861 1.60 0.1565 RESIDUAL 1.03173 32 0.0322417 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 33.8154 47 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Duong khu by Nong do enzyme -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nong do enzyme Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0.1 12 4.5475 X 0.2 12 5.11 X 0.3 12 5.5375 X 0.4 12 5.60667 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0.1 - 0.2 *-0.5625 0.149318 0.1 - 0.3 *-0.99 0.149318 0.1 - 0.4 *-1.05917 0.149318 0.2 - 0.3 *-0.4275 0.149318 0.2 - 0.4 *-0.496667 0.149318 0.3 - 0.4 -0.0691667 0.149318 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Duong khu by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 12 4.15 X 20 12 4.99083 X 30 12 5.69083 X 40 12 5.97 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 20 *-0.840833 0.149318 10 - 30 *-1.54083 0.149318 10 - 40 *-1.82 0.149318 20 - 30 *-0.7 0.149318 20 - 40 *-0.979167 0.149318 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm - khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trang 48 30 - 40 *-0.279167 0.149318 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. B3. Thí nghiệm 3 – Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến hiệu suất đường hóa Analysis of Variance for Duong khu - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Nong do enzyme 11.4838 3 3.82793 25.32 0.0000 B:Thoi gian 25.5893 2 12.7947 84.63 0.0000 INTERACTIONS AB 0.382706 6 0.0637843 0.42 0.8571 RESIDUAL 3.6282 24 0.151175 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 41.084 35 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Duong khu by Nong do enzyme -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nong do enzyme Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0.1 9 9.29 X 0.2 9 10.0256 X 0.3 9 10.6056 X 0.4 9 10.71 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0.1 - 0.2 *-0.735556 0.378288 0.1 - 0.3 *-1.31556 0.378288 0.1 - 0.4 *-1.42 0.378288 0.2 - 0.3 *-0.58 0.378288 0.2 - 0.4 *-0.684444 0.378288 0.3 - 0.4 -0.104444 0.378288 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Duong khu by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 20 12 8.97417 X 30 12 10.625 X 40 12 10.8742 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 20 - 30 *-1.65083 0.327607 20 - 40 *-1.9 0.327607 30 - 40 -0.249167 0.327607 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.