Ứng dụng kỹ thuật Inverse‐shifting PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia a thể nặng

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 202 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT INVERSE‐SHIFTING PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN  ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A THỂ NẶNG   Nguyễn Hữu Huy*, Nguyễn Thị Băng Sương**, Đỗ Thị Thanh Thủy**, Ngô Thị Hồng Phước**  TÓM TẮT  Mở đầu: Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X do sự thiếu hụt hoặc  khiếm khuyết yếu tố VIII, một loại protein đông máu. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/5000 trẻ trai. Bệnh  Hemophilia A thể nặng (nồng độ yếu tố VIII thấp hơn 1%) chiếm khoảng 40% các trường hợp mắc bệnh. Bệnh  nhân mắc bệnh dễ xuất huyết do chấn thương hay tự phát, tụ máu trong cơ, chảy máu ở khớp. Đột biến đảo đoạn  intron 22 gây ra 40‐50% các trường hợp Hemophilia A thể nặng.  Mục tiêu: Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 ở bệnh nhân Hemophilia A thể nặng và người nữ dị hợp tử  trong gia đình bệnh nhân.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thực hiện phân tích 2 gia đình với 2 bệnh nhân nam được chẩn  đoán Hemophilia A thể nặng và 5 thành viên nữ. Phản ứng Inverse PCR gồm 3 bước: (a) cắt bằng enzyme BclI;  (b) nối lại sản phẩm cắt tạo DNA vòng; (c) thực hiện phản ứng multiplex PCR và đọc kết quả.  Kết quả: Phát hiện 2 bệnh nhân nam mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4 người nữ dị hợp tử là người lành  mang gen bệnh và 1 người nữ đang có thai là người bình thường.  Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật Inverse PCR để phát hiện đột biến đảo đoạn intron  22 gây bệnh Hemophilia A thể nặng ở bệnh nhân và người lành mang gen bệnh.  Từ khoá: Inverse PCR, đảo đoạn intron 22, Hemophilia A  ABSTRACT  APPLICATION INVERSE‐SHIFTING PCR TO IDENTIFY INVERSION INTRON 22 CAUSE   OF SEVERE HEMOPHILIA A  Nguyen Huu Huy, Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Ngo Thi Hong Phuoc  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 202 ‐ 207  Introduction: Hemophilia A is a recessive X‐linked genetic disorder caused by missing or defective factor  VIII, a clotting protein. Hemophilia A occurs in approximately 1 in 5,000 live births. Severe hemophilia A (factor  levels less than 1%) represents approximately 40% of cases. People with severe hemophilia A experience bleeding  following an  injury and may have  frequent spontaneous bleeding episodes, often  into their  joints and muscles.  Factor VIII intron 22 inversions (Inv22) cause 40%–50% of severe cases of hemophilia A.  Objective: Identify inversion intron 22 in severe Hemophilia A patients and heterozygous female carriers.  Patients  and Method:  To  conduct  the  genetic  analysis  in  2  families  of  2  patients  diagnosed  of  severe  hemophilia A  and  5  female members.  Inverse  PCR  involved  3  steps:  (a)  BclI  restriction;  (b)  self‐ligation  of  restriction fragments, providing BclI rings; and (c) standard multiplex‐PCR analysis.   Results: 2 male patients had intron 22 inversion, 4 female members were carrier and 1 female member, who  was pregnant, was fortunately non carrier.  Conclusion: We  have  successfully  applied  inverse PCR  to  identify  inversion  intron  22  cause  of  severe  Hemophilia A. This helped for the detection of patients and identification of female carriers.  Keywords: Inverse PCR, inversion intron 22, Hemophilia A  * Khoa sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên,TPHCM.  ** Đại học Y Dược TPHCM.  Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Thị băng Sương  , ĐT: 0914007038  , Email: suongnguyenmd@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 203 ĐẶT VẤN ĐỀ  Hemophilia  A  là  căn  bệnh  rối  loạn  đông  máu di truyền nghiêm trọng do sự thiếu hụt hay  khiếm khuyết yếu tố VIII đồng thời đây cũng là  căn bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể  giới tính X phổ biến nhất với tần suất mắc bệnh  là 1/5000 trẻ trai(1). Nguyên nhân gây bệnh là do  đột biến  trên gen F8 nằm  trên  cánh dài nhiễm  sắc thể giới tính X tại vị trí Xq28, gen có chiều dài  186 kb, gồm 26 exon và mã hóa cho RNA dài 9  kb(3).  Sản phẩm  của gen F8  là yếu  tố VIII nằm  trong phức hợp hoạt hóa yếu tố X đóng vai trò  rất quan  trọng  trong  con  đường  đông máu,  sự  thiếu hụt yếu  tố VIII  sẽ dẫn đến  rối  loạn đông  máu và các biểu hiện lâm sàng là xuất huyết tự  phát hay do chấn thương nhẹ, tụ máu trong cơ,  chảy máu  ở  khớp,  đôi  khi  có  tiểu máu.  Bệnh  Hemophila A  được  chia  thành  3  loại  dựa  vào  nồng độ yếu tố VIII trong huyết thanh: thể nặng  khi yếu tố VIII có nồng độ rất thấp (<1% so với  giá trị bình thường), thể trung bình (1‐5%) và thể  nhẹ (5‐40%). với tỷ lệ lần lượt của các thể bệnh là  40%,  10%  và  50%  các  trường  hợp  mắc  Hemophilia A(6). Khoảng  70%  các  trường  hợp  mắc bệnh là do di truyền gen đột biến và 30% là  do đột biến de novo. Các đột biến gây nên bệnh  Hemophilia A chủ yếu là các đột biến điểm nằm  rải rác khắp chiều dài của gen. Tuy nhiên 40‐50%  các trường hợp Hemophilia A thể nặng là do đột  biến đảo đoạn intron 22(4). Nguyên nhân của đảo  đoạn intron 22 là do một đoạn trình tự dài 9,5 kb  nằm trong intron 22 của gen F8 gọi là int22h‐1 có  độ  tương  đồng  rất  cao với  2  vùng  int22h‐2  và  int22h‐3 nằm cách xa gen F8, các trình tự này có  thể tái tổ hợp tương đồng trong nhiễm sắc thể X  làm phá vỡ khung đọc của gen F8 gây ra bệnh  Hemophilia A thể nặng(8).  Do Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên  kết với nhiễm sắc  thể giới  tính X nên bệnh chủ  yếu gặp ở nam giới vì người nam chỉ có 1 nhiễm  sắc thể X nên nếu có đột biến sẽ biểu hiện ngay  ra kiểu hình còn người nữ phải đột biến ở trên 2  nhiễm sắc thể X mới bị mắc bệnh. Người nữ dị  hợp tử mang gen bệnh sẽ có 50% nguy cơ truyền  gen X bị đột biến cho con của mình. Do vậy nếu  không có các chương trình tầm soát gen bệnh thì  bệnh  Hemophilia  A  sẽ  lan  truyền  rộng  trong  cộng đồng, tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao, người  bệnh sẽ trở thành gánh nặng cho gia đình và xã  hội. Hiện nay có 3 phương pháp chính để phát  hiện  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  là  Southern  Blot,  Long  distance‐PCR và  Inverse  PCR  trong  đó  Inverse PCR  được  đánh giá  là một phương  pháp đặc hiệu, đơn giản, tiết kiệm chi phí, phù  hợp với điều kiện Việt Nam. Từ cơ sở đó, chúng  tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu với mục tiêu:  “Ứng  dụng  kỹ  thuật  Inverse‐shifting  PCR  xác  định  đột biến  đảo  đoạn  intron 22  ở bệnh nhân  Hemophilia A thể nặng”.  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Gồm 2 gia đình  Gia  đình  bệnh  nhân  thứ  nhất  gồm  1  bệnh  nhân nam mắc bệnh Hemophilia A thể nặng và  3  thành viên nữ  là mẹ và 2  chị  của bệnh nhân  trong đó một người chị đang mang thai.  Gia  đình  bệnh  nhân  thứ  hai  gồm  1  bệnh  nhân nam mắc bệnh Hemophilia A thể nặng và  2 thành viên nữ là mẹ và dì của bệnh nhân.  Mẫu  DNA  chứng  dương  là  plasmid  tạo  dòng từ bệnh nhân đảo đoạn  intron 22 và mẫu  DNA  người  bình  thường  không  mắc  bệnh  Hemophilia A  Phương pháp nghiên cứu  Kỹ thuật tách chiết DNA   Mẫu máu  ngoại  vi  được  xử  lý  bằng  chất  chống đông EDTA, được tách chiết trong 24 giờ.  Quy trình tách chiết DNA từ 2 ml máu ngoại vi  được  tiến hành  theo Promega Kit. Nồng  độ và  độ tinh sạch của sản phẩm DNA được kiểm tra  trên  máy  quang  phổ  NanoDrop  2000,  những  mẫu có  tỷ  lệ giá  trị mật độ quang ở bước sóng  260/280 nm  đạt  từ 1,8 – 2,0  được dùng  để  tiến  hành phản ứng PCR và giải trình tự gen.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 204 Kỹ  thuật  Inverse PCR xác định đột biến đảo  đoạn intron 22  Phương  pháp  Inverse  PCR  gồm  3  bước  chính  ‐ Cắt  bằng  enzyme BclI: Thành phần phản  ứng gồm 1,5 μg DNA genome, 3 μl buffer 10X,  1,2 μl enzyme BclI (Promega), bổ sung nước cất  cho đủ thể tích 30 μl. Ủ 50oC/4 giờ. Tinh sạch sản  phẩm  cắt  bằng  Phenol/chloroform.  Tủa  sản  phẩm  bằng  ethanol  tuyệt  đối  và  CH3COONa.  Hòa sản phẩm trong 20 μl nước cất.  ‐  Nối  bằng  T4  DNA  Ligase:  Thành  phần  phản ứng gồm 20 μl DNA sản phẩm cắt, 20 μl  buffer  10X,  1  μl T4 DNA Ligase  (Promega).  Ủ  16oC/16‐18  giờ.  Tinh  sạch  sản  phẩm  nối  bằng  Phenol/chloroform. Tủa sản phẩm bằng ethanol  tuyệt đối và CH3COONa. Hòa sản phẩm  trong  20 μl nước cất.  ‐ Phản ứng  Inverse PCR: Thành phần phản  ứng gồm 0,1 μl Taq Takara, 2 μl buffer 10X, 1,5  μl dNTPs, 2 μl sản phẩm nối, 0,5 μl mồi ID, 0,5  μlmồi ED, 0,5 μl mồi  IU, bổ sung nước cất cho  đủ thể tích 15 μl.  Chu  trình  nhiệt:  Biến  tính  ở  98oC  trong  5  phút,  sau  đó  là  40  chu  kỳ  gồm  98oC  trong  10  giây; 55oC  trong 20 giây; 72oC  trong 30 giây, và  giai đoạn kết thúc gồm 72oC trong 2 phút.  Bảng 1‐ Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng  Inverse PCR  Tên Primer Trình tự Sản phẩm ID 5'-ACATACGGTTTAGTCACAAGT-3 487 bp (ID / IU): Bình thường ED 5'- TCCAGTCACTTAGGCTCAG-3 559 bp (ED / IU): Đảo đoạn intron 22 IU 5'-CCTTTCAACTCCATCTCCAT-3 Các  sản  phẩm  nhân  bản  của  phản  ứng  Inverse PCR  được  điện di  trên gel agarose 2%.  Kích thước của các sản phẩm được xác định khi  so sánh với thang chuẩn 1kb plus (Invitrogen).  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU  Kết quả Inverse PCR của gia đình bệnh nhân thứ nhất  Hình 1‐ Kết quả Inverse PCR gia đình bệnh nhân thứ nhất  Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng  (‐):  Chứng  âm; Giếng  1:  Bệnh  nhân; Giếng  2: Mẹ  bệnh nhân; Giếng 3: Chị bệnh nhân; Giếng 4: Chị  bệnh nhân đang mang thai; Giếng 5: Người bình  thường; Giếng 6: Chứng dương.  Nhận  xét:  Bệnh  nhân  ở  giếng  1  có  1  băng  DNA tương ứng với băng kích thước 559 bp của  chứng dương ở giếng số 6 chứng tỏ bệnh nhân  có  đột biến  đảo  đoạn  intron 22. Người  chị  của  bệnh  nhân  đang  mang  thai  có  1  băng  DNA  600bpp 500bp6 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 205 tương ứng với băng kích thước 487 bp của người  bình thường ở giếng số 5 chứng tỏ người này là  người bình thường. Mẹ bệnh nhân ở giếng số 2  và người  chị  của bệnh nhân  ở giếng  số  3  có  2  băng DNA tương ứng với băng 559 bp và 487 bp  chứng  tỏ hai người này mang kiểu gen dị hợp  tử. Bệnh  nhân  bị mắc  bệnh Hemophilia A  thể  nặng do di truyền từ mẹ.   Kết quả Inverse PCR của gia đình bệnh nhân thứ hai  Hình 2‐ Kết quả Inverse PCR gia đình bệnh nhân thứ hai  Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng  (‐):  Chứng  âm; Giếng  1:  Bệnh  nhân; Giếng  2: Mẹ  bệnh  nhân;  Giếng  3:  Dì  bệnh  nhân;  Giếng  4:  Người bình thường; Giếng 5: Chứng dương  Nhận  xét:  Bệnh  nhân  ở  giếng  1  có  1  băng  DNA tương ứng với băng kích thước 559 bp của  chứng dương ở giếng số 5chứng tỏ bệnh nhân có  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22. Mẹ  bệnh  nhân  ở  giếng số 2 và người dì của bệnh nhân ở giếng số  3 có 2 băng DNA tương ứng với băng 559 bp và  487 bp chứng tỏ hai người này mang kiểu gen dị  hợp  tử. Bệnh nhân bị mắc bệnh Hemophilia A  thể nặng do di truyền từ mẹ.  BÀN LUẬN  Hemophilia A  là  bệnh  di  truyền  lặn  liên  kết với nhiễm  sắc  thể giới  tính X do  đột biến  tại gen F8 dẫn đến thiếu hụt yếu tố VIII gây ra  rối  loạn  đông máu. Các  đột biến  ở gen F8 vô  cùng  đa dạng bao gồm mất  toàn bộ gen,  đảo  đoạn  DNA  lớn,  các  đột  biến  vô  nghĩa,  sai  nghĩa, lệch khung, splicing... đều có thể gây ra  những bất  thường  trong  sự biểu hiện,  tiết và  thời gian phân hủy  của yếu  tố VIII. Trong  số  các đột biến ở gen F8  thì đột biến quan  trọng  nhất  là đột biến đảo đoạn  intron 22 chiếm 40‐ 50%  các  trường  hợp Hemophilia  thể  nặng(4).  Đặc biệt, 21% các trường hợp đảo đoạn intron  22 sẽ sản xuất kháng thể kháng lại yếu tố VIII  điều  trị bổ  sung dẫn  đến  rất nhiều khó khăn  trong việc điều trị bệnh Hemophilia(9).  Gen F8 là một trong những gen lớn nhất với  kích thước 186 kb nằm ở vị trí Xq28. Gen F8 có  26 exon có kích thước từ 69 đến 3106 bp. Chiều  dài của vùng  intron  lên đến 177,9 kb với  intron  lớn nhất là intron 22 dài 32,8kb(3).  Vào năm  1990, Levison  đã phát hiện  trong  gen F8 có chứa 1 gen khác  là gen F8A, gen này  nằm ngược chiều với gen F8 và nằm trong vùng  intron  22(5).  Sau  đó,  Freije  và  Schlessinger  đã  phát hiện trong nhiễm sắc thể X có 3 bản sao của  gen F8A, 1 nằm ở vùng  intron 22 và 2 bản sao  còn  lại nằm ngược hướng cách gen F8 500kb(2).  Vào năm 1993, hai nhóm nghiên cứu đã chứng  minh  nguyên  nhân  của  50%  các  trường  hợp  Hemophilia A  thể nặng  là do một  đột biến  tại  600bpp 500bp6 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 206 vùng  intron  22 ngăn  cản  sự phiên mã  liên  tục  của mRNA từ exon 22 sang exon 23. Cả 2 nhóm  đã đề xuất một mô hình dựa trên sự tái tổ hợp  tương đồng giữa các đoạn gen F8A nằm ở intron  22 và ngược chiều gen F8. Khi sự tái tổ hợp diễn  ra  sẽ  làm  đảo  ngược  trình  tự  DNA  nằm  bên  trong và phá vỡ khung đọc gen F8(4,7).  Hình 3‐ Cơ chế đảo đoạn intron 22 của gen F8  Vào năm 2005, Rosetti đã  thiết kế phương  pháp Inverse PC nhằm phát hiện đột biến đảo  đoạn intron 22. Sau khi xử lý cắt bằng enzyme  BclI và nối  lại bằng T4 Ligase  sẽ  tạo  ra DNA  vòng chứa vùng  trình  tự  intron 22. Rosetti đã  thiết kế 3 mồi trong đó 2 mồi ID và IU bắt cặp  với trình tự nằm ở trong gen F8 khi PCR sẽ tạo  ra sản phẩm có kích  thước 487 bp  tương ứng  với  gen  F8  bình  thường  không  xảy  ra  đảo  đoạn.  Mồi  ED  bắt  cặp  với  trình  tự  ở  giữa  int22h‐2  và  int22h‐3  nằm  bên  ngoài  gen  F8.  Khi  xảy  ra  đảo  đoạn  thì một  phần  int22h‐1  được thay thế bằng đoạn int22h‐2 hoặc int22h‐ 3, mồi ED sẽ kết hợp với mồi IU để tạo thành  sản phẩm PCR kích thước 559 bp(10).  Phương  pháp  Inverse  PCR  có  nhiều  ưu  điểm hơn so với 2 phương pháp Southern Blot  và Long distance PCR  trước đó dùng để chẩn  đoán đột biến đảo đoạn  intron 22  là thời gian  thực hiện nhanh hơn phương pháp  Southern  Blot  (2  ngày  so  với  8  ngày)  và  tương  đương  phương  pháp  Long  distance‐PCR. Đồng  thời  phương pháp này không sử dụng chất đồng vị  độc hại như phương pháp Southern Blot hay  yêu  cầu nghiêm ngặt về  chất  lượng Taq,  chu  trình  nhiệt,  chất  lượng  DNA  bản  mẫu  như  phương pháp Long distance‐PCR. Inverse PCR  được đánh giá  là phương pháp đơn giản,  tiết  kiệm chi phí, đảm bảo tính đặc hiệu cao do sự  đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn phù hợp ứng  dụng ở điều kiện Việt Nam(6).  Khi ứng dụng phương pháp Inverse PCR để  xác  định  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  ở  2  gia  đình  bệnh  nhân  thì  2  bệnh  nhân  nam  đều  di  truyền đột biến từ mẹ của mình. Đa số các người  nữ trong 2 gia đình đều là người lành mang gen  bệnh (4/5 người), nếu họ mang thai thì cần tiến  hành chẩn đoán trước sinh và thực hiện tư vấn  di truyền vì nguy cơ họ truyền gen bệnh cho con  là 50%. Đối với người chị bệnh nhân đang mang  thai ở gia đình thứ nhất thì không cần tiến hành  chọc ối vì người mẹ không mang gen bệnh nên  sẽ không truyền gen bệnh cho thai nhi.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 207 Hình 4‐ Nguyên tắc của phương pháp Inverse PCR  xác định đảo đoạn intron 22  KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  ứng  dụng  thành  công  kỹ  thuật  Inverse PCR xác  định  đột biến  đảo  đoạn  intron 22  ở bệnh nhân Hemophilia A và người  lành mang  gen  bệnh.  Trong  2  gia  đình  bệnh  nhân  được  phân  tích  thì  có  1  người  nữ mang  kiểu gen bình  thường, 2 bệnh nhân bị đột biến  đảo đoạn intron 22 và 4 người nữ là người lành  mang gen bệnh.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bolton‐Maggs  PH,  Pasi  KJ  (2003),“Hemophilias  A  and  B”,  Lancet, 361:1801‐1809.  2. Freije  D,  Schlessinger  (1992),  “A  1.6‐Mb  contig  of  yeast  artificial  chromosomes  around  the  human  factor  VIII  gene  reveals  three  regions homologous  to probes  for  the DXS115  locus  and  two  for  the DXYS64  locus”, Am  J Hum  Genet,  51(1):66‐80.  3. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton  DH,  Vehar  GA,  Capon  DJ,  Lawn  RM  (1984),  “Characterization  of  the  human  factor  VIII  gene”, Nature,  312:326–330.  4. Lakich  D,  Kazazian  HH,  Jr.,  Antonarakis  SE,  Gitschier  J  (1993),  “Inversions  disrupting  the  factor  VIII  gene  are  a  common cause of severe haemophilia A”, Nat Genet, 5:236– 241.   5. Levinson B, Kenwrick S, Gamel P, Fisher K, Gitschier J (1992),  “Evidence  for a  third  transcript  from  the human  factor VIII  gene”, Genomics, 14(3):585‐9.  6. Liliana C. Rossetti, Claudia P. Radic, Miguel M. Abelleyro,  Irene  B.  Larripa,  and  Carlos D. De  Brasi  (2011),  “Eighteen  Years  of  Molecular  Genotyping  the  Hemophilia  Inversion  Hotspot: From Southern Blot  to  Inverse Shifting‐PCR”,  Int  J  MolSci, 12(10): 7271–7285.  7. Naylor J, Brinke A, Hassock S, Green PM, Giannelli F, (1993),  “Characteristic mRNA abnormality found in half the patients  with severe haemophilia A is due to large DNA inversions”,  Hum Mol Genet, 2(11):1773‐8.  8. Naylor  JA,  Buck  D,  Green  PM, Williamson H,  Bentley  D,  Giannelli F  (1995), “Investigation of  the  factor VIII  intron 22  repeated  region  (int22h)  and  the  associated  inversion  junctions”,Hum Mol Genet, 4:1217‐1224.  9. Oldenburg  J, Schröder  J, Hermann Brackmann HH, Müller‐ Reible C, Schwaab R, Tuddenham E  (2004), “Environmental  and  genetic  factors  influencing  inhibitor  development”,  Semin Hematol, 41:82–88.  10. Rossetti  LC,  Radic  CP,  Larripa  IB,  De  Brasi  CD  (2005),  “Genotyping  the  hemophilia  inversion  hotspot  by  use  of  inverse PCR”, Clin Chem, 51:154–158.  11. Wood WI, Capon DJ,  Simonsen CC, Eaton DL, Gitschier  J,  Keyt B, Seeburg PH, Smith DH, Hollingshead P, Wion KL, et  al  (1984),  “Expression  of  active  human  factor  VIII  from  recombinant DNA clones”, Nature, 312:330–337.  Ngày nhận bài báo:        05/9/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:    29/9/2014  Ngày bài báo được đăng:  20/10/2014