Ứng dụng kỹ thuật ONE-STEP RT-PCR chẩn đoán bệnh cứng trái do vi rút (east asian passiflora virus - eapv) gây bệnh trên chanh leo ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 63 7. de Silva D. P. P., Jones, P. and Shaw, M. W. ,2002. Identification and transmission of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum) in Sri Lanka. Plant Pathol., 51: 537–545. 8. Deeshma K. P and Bhat A. I. , 2017. Occurrence of endogenous Piper yellow mottle virus in black pepper. Virus Diseases, 28: 213-217. 9. Hany U., Adams I. P., Glover R., Bhat A. I., Boonham N., 2014. The complete genome sequence of Piper yellow mottle virus (PYMoV). Arch Virol, 159: 385-388. 10. Lockhart B. E. L., Kittisak Kiratiya-Angul, Jones P., Lily Eng, De Silva D. P. P., Olszewski N.E., Lockhart N., Deeshma N. and Sangalang J., 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug- transmitted badnavirus infecting Piper spp. In Southeast Asia. Eur. J. Plant Pathol., 103: 303–311. Phản biện: TS. Trịnh Xuân Hoạt ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ONE-STEP RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH CỨNG TRÁI DO VI RÖT (East Asian Passiflora Virus - EAPV) GÂY BỆNH TRÊN CHANH LEO Ở VIỆT NAM One-step RT-PCR for Detection of Passionfruit Woodiness Disease Caused by East Asian Passiflora Virus (EAPV) in Viet Nam Đỗ Duy Hƣng, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Nam Dƣơng, Phạm Thị Dung, Ngô Thị Thanh Hƣờng, Lê Mai Nhất và Hà Minh Thanh Viện Bảo vệ thực vật Ngày nhận bài: 16.08.2018 Ngày chấp nhận: 29.09.2018 Abstract East Asian Passiflora virus (EAPV) is the third pathogenic potyvirus species that induces “passionfruit woodiness disease” to be identified recently in East Asia, after Passion fruit woodiness virus (PWV) in Australia, Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) in Brazil. One-step RT-PCR was optimized for detection of East Asian Passiflora virus (EAPV) strain AO and IB on passion fruit in Taiwan. Three pairs of primer were used for detection of both EAPV-AO and EAPV-IB from the infected samples collected from Nghe An and Dak Nong provinces of Viet Nam. Among the tested samples, EAPV-AO was detected from 14 samples from Nghe An and 4 samples from Dak Nong; meanwhile, EAPV-IB was detected only from 4 samples collected from Nghe An but not from Dak Nong. Different parts of infected passion fruit plant including fresh and fried tissues except the old leaf could be used for the detection of EAPV-AO and EAPV-IB. This protocol was used routinely at Plant Protection Research Institute for detection of EAPV-AO and EAPV-IB on passion fruit collected from different areas in Viet Nam. Keywords: EAPV, passion fruit, RT-PCR, detection 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chanh leo (Passiflora spp.) là cây trồng có giá trị kinh tế cao được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, chanh leo đã và đang trở thành cây trồng chủ lực tại nhiều vùng trong cả nước như các tỉnh Tây Nguyên, Nghệ An, Sơn La, Hòa Bình(Nguy n Tuấn Lộc và cs, 2017). Tuy nhiên, sản xuất chanh leo gặp nhiều khó khăn do sâu, bệnh hại đặc biệt là các loại bệnh do vi rút gây ra. Trên thế giới, đã phát hiện được 23 loài vi rút gây hại trên chanh leo. Trong đó, ở một số nước như Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan đã phát hiện 6 loài vi rút bao gồm: Euphorbia leaf curl virus (EuLCV) and Papaya leaf curl Guangdong virus (PaLCuGDV) (Cheng et al., 2016); Cucumber mosaic virus BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 64 (CMV); East Asian Passiflora virus (EAPV) (gồm chủng AO và IB) (Fukumoto et al., 2012, Hang et al., 2018); Passionfruit woodiness virus (PWV) và Telosma mosaic virus (TelMV) (Pissawan Chiemsombat et al., 2014) Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao trong chẩn đoán một số loài RNA vi rút ở Việt Nam như vi rút gây bệnh lùn sọc đen phương Nam trên lúa (Hoang et al., 2011), Papaya Ring Spot Virus (PRSV) gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ (Revill et al., 2004) Tại Việt Nam cũng đã xác định được 4 loài vi rút gây bệnh trên chanh leo, trong đó bệnh cứng trái (hóa bần vỏ trái) do East Asian Passiflora virus (EAPV) được coi là bệnh hại nguy hiểm nhất trên chanh leo tại Việt Nam. Bệnh gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả, nhiều vườn trồng chanh leo tại Tây Nguyên bị bệnh nặng đã phải hủy vườn. Do vậy, xác định phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh cứng trái do EAPV gây ra là yêu cầu cấp thiết để góp phần quản lý bệnh đạt hiệu quả cao. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu lá, quả chanh leo thu thập tại Nghệ An và Đắk Nông. Các hóa chất gồm: Trizol, Chloroform, Isopropanol, 0,8M Sodium Citrate, 1,2M NaCl, One-Step RT-PCR kit (Affymetrix-USA). Các dụng cụ và máy móc chuyên dùng: Pippet, hệ thống điện di ngang, hệ thống chụp ảnh gel, máy li tâm, máy li tâm lạnh, máy vortex, máy PCR Các cặp mồi AOCP1/AOCP2, AOHC1/AOHC2 và IBCP1/IBCP2 từ phòng thí nghiệm vi rút thực vật trường Đại học quốc gia Chung Hsing - Đài Loan (bảng 1, Chong et al., 2018). 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu mẫu: Mẫu lá, quả chanh leo được thu thập tại các vùng trồng chính ở 2 tỉnh Nghệ An và Đắk Nông. Mẫu lá, quả tươi được bảo quản trong túi nhựa PE ở nhiệt độ 4°C; mẫu lá khô được bảo quản trong túi nhựa PE chứa Silicagel ở nhiệt độ phòng. 2.2.2. Tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Các bước cơ bản và thành phần hóa chất được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen): 0,1g mẫu tươi hoặc 0,03g mẫu khô được nghiền với nitơ lỏng bằng chày cối sứ. Chuyển mẫu vào 1 ống ly tâm 1,5ml, bổ sung 1ml Trizol, lắc mạnh sau đó tiến hành ly tâm 12000 vòng trong 10 phút. Sau khi ly tâm phần dịch trong phía trên (khoảng 900 l) được chuyển sang 1 ống khác và bổ sung 300 µl Chloroform, lắc mạnh trong 30 giây sau đó ly tâm 12000 vòng trong 10 phút. Chuyển dịch trong phía trên sang 1 ống khác và bổ sung 250 µl Isopropanol, 250 µl 0,8M Sodium Citrate, 250 µl 1,2 M NaCl, lắc nhẹ và ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở nhiệt độ 4°C. Loại bỏ phần dịch trong và rửa phần kết tủa 2 lần với cồn 75º. Làm khô kết tủa ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan kết tủa bằng 80 µl RNase-free H2O. 2.2.3. Kỹ thuật One-step RT-PCR để chẩn đoán EAPV-AO, EAPV-IB Bảng 1. Một số Primer sử dụng trong nghiên cứu (Chong et al., 2018) Tên Primer Trình tự mồi Kích thước sản phẩm AOCP1(EAPV-AO CP fwd) CCCATGGTATTCAGCAGTCCA AAGAG 527bp AOCP2(EAPV-AO CP rev) GGGAATTCATACCCA AAAGGGTGT IBCP1(EAPV-IB CP fwd) GAAAAGAACAGGAACTCTGGCAA 615bp IBCP2(EAPV-IB CP rev) GTTTTGGATGTGACCTCATAAAAGTC AOHC1(EAPV –AO HC Pro fwd) GGCCAGAGGAAACTTGCTATTGGC 620bp AOHC2(EAPV –AO HC Pro rev) CCCAGTAGATCATTTGATGC Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 65 Quá trình phiên mã ngược được thực hiện trong 30 phút tại 42°C. Tiếp theo, quá trình khuếch đại sản phẩm PCR được thực hiện lần lượt với 95°C trong 3 phút, 40 vòng (95°C trong 30 giây, 54°C trong 30 giây, 72°C trong 60 giây), 72°C trong 3 phút và kết thúc ở 15°C. Thành phần hóa chất trong mỗi tuýp phản ứng (50µl) gồm: 1X RT-PCR buffer, 0,2 mM dNTPs, 4 units RNase Inhibitor, 1 unit RT-PCR Enzyme Mix, 0,2 mM forward primer, 0,2 mM reverse primer. Nồng độ agarose 1% được sử dụng để chạy điện di ở dòng điện 110 Vol bằng dung dịch 0,5X TAE. Dựa vào thang chuẩn của marker ở 100 bp DNA (Norgen-Canada) để so sánh sản phẩm. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh cứng trái do East Asian Passiflora virus (EAPV) gây ra Triệu chứng bệnh cứng trái do EAPV gây ra rất đa dạng với nhiều dạng triệu chứng khác nhau gồm: 1) Quăn và chùn ngọn; 2) Khảm vàng trên lá non; lá già, lá nhăn nheo, phồng rộp; 3) Quả nhỏ, vỏ quả hóa bần, quả biến dạng, vỏ quả chuyển màu từ màu sang sang màu trắng. Chủng EAPV – AO gây triệu chứng khảm lá, phồng rộp lá non, cứng trái, quả nhỏ, dịch quả ít, vỏ quả biến màu. Chủng EAPV – AO và IB gây triệu chứng quăn lá, khảm lá, vỏ quả hóa bần tuy nhiên mức độ bệnh của chủng EAPV – IB nhẹ hơn so với chủng EAPV – AO. Hình 1. Các triệu chứng bệnh do EAPV gây ra trên chanh leo: A. Quăn ngọn, biến dạng lá non; B, C. Khảm, phồng lá non; D. Quả nhỏ, biến dạng, vỏ cứng; E,F,G: Vỏ quả hóa bần, sần sùi, biến màu; H,I. Lá và quả khỏe 3.2 Chẩn đoán East Asian Passiflora virus (EAPV) gây bệnh trên chanh leo Trong nghiên cứu này hai cặp mồi AOCP1/AOCP2 và AOHC1/AOHC2 với kích thước sản phẩm tương ứng là 527 và 620 bp đã được sử dụng để xác định chủng AO của East Asian Passiflora virus (EAPV) (Chong et al., 2018). Tương tự cặp mồi IBCP1/IBCP2 với kích thước sản phẩm là 615 bp đã được sử dụng BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 66 nhằm xác định chủng IB của EAPV. Cả 3 cặp mồi này đã được kiểm tra độ nhạy và tính đặc hiệu trên các mẫu EAPV-AO và EAPV-IB tại Đài Loan (Chong et al., 2018). Các mẫu chanh leo có triệu chứng vàng lá, khảm lá thu thập tại Nghệ An và Đắk Nông đã được giám định bằng 3 cặp mồi trên, kết quả cho thấy có sự xuất hiện của cả 2 chủng EAPV-AO và EAPV-IB tại Nghệ An và chủng EAPV-AO tại Đắk Nông. Trong năm 2018 đã có 120 mẫu chanh leo được chẩn đoán sử dụng các cặp mồi nói trên đều cho kết quả nhanh, chính xác, ổn định (bảng 2). Bảng 2. Kết quả giám định virus một số mẫu chanh leo tại Nghệ An và Đắk Nông (Viện BVTV, 2018) STT Địa điểm thu mẫu Tổng số mẫu giám định Số mẫu nhi m virus EAPV-AO EAPV-IB 1 Nghệ An 90 14 4 2 Đắk Nông 30 4 0 Tổng cộng 120 18 4 Tỷ lệ - 15% 3,33% Kết quả bảng 2 cho thấy trong 120 mẫu giám định có 18 mẫu nhi m EAPV-AO chiếm tỷ lệ 15% và 4 mẫu nhi m EAPV-IB chiếm 3,33%. Hình 2. Kết quả giám định EAPV-AO với 2 cặp mồi AOCP1/AOCP2 và AOHC1/AOHC2. Giếng 1: 100-bp DNA ladder; Giếng 2: Đối chứng cây khỏe, Giếng 3,5: Mẫu NA1 (thu tại Nghệ An); Giếng 4,6: Mẫu ĐN1 (thu tại Đắc Nông) Hình 3. Kết quả giám định EAPV-IB với cặp mồi IBCP1/IBCP2. Giếng 1: 100-bp DNA ladder; Giếng 2: Đối chứng cây khỏe; Giếng 3: Mẫu NA2. Ghi chú: Mẫu NA1, NA2 thu thập tại huyện Quế Phong- Nghệ An. Mẫu ĐN1 thu thập tại thị xã Gia Nghĩa – Đắc Nông. Đánh giá độ nhạy và tính đặc hiệu của quy trình, các loại mẫu khác nhau đã được thử nghiệm bao gồm: (i) lá non, lá già, là đài, vỏ quả; (ii): mẫu tươi và mẫu đã ép khô. 10 mẫu nhi m EAPV-AO thu thập tại Nghệ An với các loại mẫu khác nhau được giám định bằng phương pháp RT-PCR (bảng 3). Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 67 Bảng 3. Đánh giá độ nhạy, tính đặc hiệu của quy trình giám định trên một số loại mẫu khác nhau nhiễm EAPV-AO thu thập tại Nghệ An (Viện Bảo vệ thực vật, 2018) STT Chủng loại mẫu Tỷ lệ phân tích chính xác bằng RT-PCR (mẫu) 1 Lá non 10/10 2 Lá già 0/10 3 Lá đài 10/10 4 Vỏ quả 10/10 5 Lá non đã ép khô 10/10 Kết quả cho thấy, trên cùng một cây dương tính với vi rút, các mẫu trên lá non, vỏ quả, lá đài cho kết quả dương tính, rõ nét trong khi mẫu lấy trên lá già cho kết quả âm tính. Các mẫu lá non được ép khô sau 3 tháng cho kết quả dương tính rõ nét. Hình 4. Kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR với một số bộ phận của cây chanh leo. M: Ladder 100bp; H: Đối chứng cây khỏe; P: Đối chứng cây bệnh; A: Mẫu lá non; B: Mẫu lá đài; C: Mẫu vỏ quả; D: Lá non ép khô; E: Mẫu lá già. 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Quy trình One-step RT-PCR sử dụng 2 cặp mồi AOCP1/AOCP2 và IBCP1/IBCP2 cho kết quả rõ nét, ổn định để giám định 2 chủng EAPV- AO và EAPV-IB với kích thước sản phẩm tương ứng là 527bp và 615bp. - Trong số 120 mẫu chanh leo ở Nghệ An và Đắk Nông có 18 mẫu nhi m EAPV-AO và 4 mẫu nhi m EAPV-IB. - Các bộ phận của cây chanh leo như lá non, quả, lá đài đều cho kết quả chẩn đoán rõ nét. Không sử dụng lá già trong chẩn đoán và giám định vi rút EAPV. 4.2 Đề nghị Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán bệnh cứng trái (EAPV) gây hại trên chanh leo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguy n Tuấn Lộc, Nguy n Huy Khánh, Hà Viết Cường, Nguy n Văn Liêm, Võ Thị Dung và cs., 2017. Kết quả nghiên cứu bước đầu vê thành phần sâu, bệnh hại cây chanh leo tại huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 4, tr 17-26. 2. Hoang, A. T., Zhang, H. M., Yang, J., Chen, J. P., Hébrard, E., Zhou, G. H., & Cheng, J. A. , 2011. Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Viet Nam. Plant Disease, 95(9), 1063-1069. 3. Chang, 1992. Characterization and Comparison of Passionfruit Mottle Virus, a Newly Recognized Potyvirus, with Passionfruit woodiness virus. Phytopathology 82:1358-1363. 4. Cheng, Y. H., Deng, T. C., Chen, C. C., Chiang, C. H., & Chang, C. A., 2016. First Report of Euphorbia leaf curl virus and Papaya leaf curl Guangdong virus on Passion Fruit in Taiwan. Plant Disease, 100(4), 865-865. 5. Chong, Y. H., Cheng, Y. H., Cheng, H. W., Huang, Y. C., & Yeh, S. D., 2018. The virus causing passionfruit woodiness disease in Taiwan is reclassified as East Asian passiflora virus. Journal of General Plant Pathology, 84(3), 208-220. 6. Fukumoto, T., Nakamura, M., Rikitake, M., & Iwai, H., 2012. Molecular characterization and specific detection of two genetically distinguishable strains of East Asian Passiflora virus (EAPV) and their distribution in southern Japan. Virus genes, 44(1), 141-148. 7. Iwai H, Yamashita Y, Nishi N, Nakamura M, 2006. The potyvirus associated with the dappled fruit of Passiflora edulis in Kagoshima prefecture, Japan is the third strain of the proposed new species East Asian Passiflora virus (EAPV) phylogenetically distinguished from strains of Passion fruit woodiness virus”, Arch Virol 151: 811–818.