Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang trong chẩn đoán trước sinh nhanh phát hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở người

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 144  ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG   TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH NHANH PHÁT HIỆN   BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở NGƯỜI  Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Thị Huyền Trang**, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Vạn Thông***,   Khổng Hiệp***   TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Vài năm trở lại đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển với mục đích phát  hiện các bất thường số lượng các nhiễm sắc thể và giúp chẩn đoán trước sinh các thai kỳ nguy cơ với thời gian  nhanh hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như kỹ thuật làm nhiễm sắc thể đồ. Xuất phát từ nhu cầu trên, nhóm  nghiên cứu của chúng tôi tiến hành ứng dụng kỹ thuật PCR định  lượng huỳnh quang (QF – PCR) để chẩn  đoán nhanh bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y ở người.  Mục tiêu: Ứng dụng thành công kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang phát hiện dị bội NST 13, 18, 21,  X, Y trong các mẫu dịch ối.  Phương pháp: Tách chiết DNA từ các mẫu dịch ối của các thai kỳ nguy cơ (bất thường double test, triple  test) và có chỉ định của bác sĩ lâm sàng. Sau đó, thực hiện phản ứng PCR định lượng huỳnh quang và cuối cùng  điện di sản phẩm khuếch đại trên hệ thống điện di mao quản. Dữ liệu thô thu được sẽ được phân tích trên phần  mềm chuyên dụng để tìm ra bất thường trong mẫu ối.  Kết quả: Từ tháng 03/2010 đến tháng 01/2011 chúng tôi thu thập được 64 mẫu ối từ thai kỳ nguy cơ.  Trong đó phát hiện được 10 trường hợp bất thường (16,9%). Các kết quả này đều tương đồng với kết quả nhiễm  sắc thể đồ được thực hiện song song tại bệnh viện Hùng Vương.  Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật QF‐PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm  chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể với độ chính xác cao và tiết kiệm thời gian, cung cấp một phương  tiện chẩn đoán cho bác sĩ sản khoa trong việc xác định bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở những thai kỳ nguy  cơ cao.  Từ khóa: QF‐PCR, chẩn đoán trước sinh, dị bội thể  ABSTRACT  RAPID PRENAL DIAGNOSIS BY QUANTITATIVE FLUORESCENT POLYMERASE   CHAIN REACTION TO DETECT HUMAN ANEUPLOIDIES IN AMNIOTIC FLUIDS  Hoang Hieu Ngoc, Pham Thi Huyen Trang, Pham Hung Van, Nguyen Van Thong, Khong Hiep,   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 144 ‐ 149  Background: Previously,  aneuploidies were usually  diagnosed  by  karyotype. But  this  technique  is  time  consuming and hardly avoid the concern for pregnant women. Based on the development of molecular biology in  medicine, we apply quantitative fluorescent polymerase chain reaction technique (QF‐PCR) to detect aneuploidies  in amniotic fluids from high risk pregnancy with reducing time.  Objective: Detecting aneuploidies in amniotic fluids from high risk pregnancy.   Method:  DNA  from  amniotic  cells  were  extracted  and  then  performed  QF‐PCR.  The  fluorescent‐labeled  amplicons were detected by capillary electrophoresis system. Then, these raw data were analyzed by specific software.  * Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM, ** Công ty Nam Khoa, *** Bệnh viện Phụ Sản Hùng Vương  Tác giả liên lạc: ThS. BS. Hoàng Hiếu Ngọc  ĐT: 0988937406  Email: hoanghieungoc@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Sản Phụ Khoa 145 Results: From 03/2010 to 01/2011, we have 64 amniotic  fluid samples. There are 10 cases  (16.9%) with  aneuploidies  including  3  cases  of  trisomy  21,  3  cases  of  trisomy  18,  1  case  of Turner  syndrome,  3  cases  of  Klinfelter syndrome. These results share the similarity of karyotype that also performed simultaneously at Hung  Vuong Hospital.  Conclusions: By applying QF‐PCR, we have built up the examination to detect aneuploidies from amniotic  fluids successfully. Since, we open up the new trend of rapid prenatal diagosis in Vietnam.  Keywords: QF‐PCR, prenatal diagnosis, aneuploidy.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Bất  thường  số  lượng  nhiễm  sắc  thể  là  nguyên nhân  thường  gặp nhất  của dị  tật  bẩm  sinh, ảnh hưởng lên 1 trong 165 trẻ sơ sinh(7). Sự  bất thường nhiễm sắc thể ảnh hưởng lên thai kỳ,  gây dị  tật bẩm sinh hoặc sẩy  thai. Khoảng một  nửa các trường hợp sẩy thai tự nhiên ở ba tháng  đầu  là  do  nguyên  nhân  nhiễm  sắc  thể.  Bất  thường  nhiễm  sắc  thể  phát  hiện  bằng  chọc  ối  chiếm 30 – 35%  theo sau việc siêu âm  thấy bất  thường(11, 14). Bất thường nhiễm sắc thể được chia  thành bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm  sắc  thể. Bất  thường về số  lượng có  thể  là  thêm  hẳn một bộ nhiễm sắc thể (đa bội) hoặc là thừa,  thiếu một nhiễm  sắc  thể  (dị bội)  thì gặp nhiều  hơn  là bất  thường về  cấu  trúc nhiễm  sắc  thể  ‐  chiếm đến khoảng 95% các trường hợp(13).  Các trường hợp đa bội có thể là do rối  loạn  trong quá trình phân chia của trứng hay thường  gặp hơn là 2 tinh trùng được thụ tinh vào cùng  một trứng. Trái lại, dị bội vẫn là do không phân  ly nhiễm sắc thể trong quá trình tạo giao tử của  trứng, cho thấy nguyên nhân liên quan đến tuổi  mẹ cao là chủ yếu. Đa số các trường hợp thụ thai  tam bội  là do một  trứng  được  thụ  tinh với hai  tinh trùng. Vì vậy, thể  tam bội  thường có dạng  nhiễm  sắc  thể  đồ  là  69,XXX;  69,XXY;  hay  69,XYY. Hầu hết các thai kỳ tam bội đều bị sẩy  vào  ba  tháng  đầu  hoặc  thời  điểm  đầu  của  ba  tháng giữa. Khoảng 7% trường hợp sẩy thai xác  định trên lâm sàng là do tam bội. Lượng alpha –  fetoprotein  trong huyết  thanh mẹ  thường được  lượng giá cho thai kỳ nghi ngờ tam bội(10).  Dị  bội  nhiễm  sắc  thể  thường  là  dư  hay  thiếu một  chiếc nhiễm  sắc  thể  (nhiễm  sắc  thể  thường  hay  nhiễm  sắc  thể  giới  tính)  gây  ra  dạng  trisomy  hay  monosomy.  Hấu  hết  các  dạng  trisomy nhiễm  sắc  thể  thường  hay một  vài  loại  trisomy  của  nhiễm  sắc  thể  X  là  do  không phân  ly nhiễm  sắc  thể  trong quá  trình  tạo  trứng  và  tỉ  lệ  mắc  các  loại  bất  thường  nhiễm  sắc  thể này  thường  liên quan  đến  tuổi  mẹ(9). Đối với hội chứng Kleinfelter 47, XXY thì  tỉ  lệ  không  phân  ly  nhiễm  sắc  thể  ở  tế  bào  trứng hay tinh trùng thì chiếm tỉ lệ bằng nhau,  có khi tỉ lệ gặp ở tinh trùng chiếm tỉ lệ hơi cao  hơn  (57%). Không giống như  trisomy các  loại  nhiễm  sắc  thể  thường  khác, monosomy X  lại  thường gặp ở những phụ nữ trẻ(13).  Vài năm trở lại đây, nhiều kỹ thuật sinh học  phân tử mới được phát triển với cùng một mục  đích  phát  hiện  các  bất  thường  số  lượng  các  nhiễm sắc thể và giúp chẩn đoán trước sinh các  thai kỳ nguy cơ với thời gian nhanh hơn mà vẫn  đảm bảo độ chính xác như kỹ thuật làm nhiễm  sắc  thể  đồ. Hiện  tại,  kỹ  thuật QF  – PCR  được  dùng  trong  chẩn  đoán  nhanh  bất  thường  số  lượng  nhiễm  sắc  thể  13,  18,  21, X, Y  ở  người.  Trong phạm vi nghiên  cứu này,  chúng  tôi  tiến  hành ứng dụng kỹ thuật trên để chẩn đoán bất  thường dị bội thể 13, 18, 21, X, Y trên các mẫu ối  được  thu  thập  tại  thành phố Hồ Chí Minh. Từ  đó,  đánh giá khả năng phát  triển  của kỹ  thuật  chẩn đoán trước sinh nhanh này tại Việt Nam.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Mẫu bệnh phẩm  Mẫu dịch  ối  từ  các  thai  kỳ nguy  cơ  có  chỉ  định chọc ối làm nhiễm sắc thể đồ từ bác sĩ lâm  sàng. Mẫu được để ở nhiệt độ 2 – 8oC cho đến  khi làm xét nghiệm. Tiêu chuẩn loại trừ là mẫu  đã được trữ đông.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 146 Trích biệt DNA tế bào ối  Phương  pháp  tách  chiết  DNA  được  thực  hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 1000  μl  dịch  ối  cho  vào  1  tube  Eppendorf,  ly  tâm  14.000 rpm  trong 3 phút để  làm  lắng  tế bào ối.  Dịch nổi  được  bỏ  đi,  thêm  vào  200  μl PBS  để  thuần nhất tế bào ối trở lại. Sau đó, chúng tôi sử  dụng bộ  tách  chiết DNA bằng  kit  thương mại  QIAGEN DNA Blood Mini kit. Nồng  độ DNA  thích hợp cho phản ứng QF‐PCR là 1 – 10 ng nên  sau khi đo nồng độ DNA, có thể tiến hành pha  loãng nếu DNA mẫu  có nồng  độ  cao hơn  tiêu  chuẩn đề ra.  Thực hiện kỹ thuật QF‐PCR.   Kỹ  thuật QF  – PCR  giúp  khuếch  đại, phát  hiện, phân tích trình tự đoạn lặp lại ngắn (STR)  nằm  trên các cặp nhiễm sắc  thể 13, 18, 21, X, Y  dựa trên các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế sao  cho  vùng  trình  tự  lặp  lại  được  nằm  giữa  hai  đoạn mồi xuôi và ngược. Ngoài ra, ở đầu ở của  các đoạn mồi xuôi cũng được gắn thêm các màu  huỳnh  quang  nhằm  giúp  phát  hiện  sản  phẩm  khuếch  đại  bằng  phương  pháp  điện  di  mao  quản. Trong giai  đoạn  lũy  thừa  sớm  của phản  ứng  khuếch  đại,  lượng  sản  phẩm  khuếch  đại  được  tạo ra  tỉ  lệ với  lượng DNA có  trong mẫu  ban  đầu. Yếu  tố  tiên quyết  cho  sự  thành  công  của kỹ  thuật  là  lượng DNA  thích hợp  cho vào  trong một phản ứng và số chu kỳ nhiệt của phản  ứng PCR.  Chúng tôi sử dụng bộ kit AneufastTM QF –  PCR  kit  của  hãng  Molgentix  gồm  có  6  loại  master  mix  là  S1,  S2,  MXY,  M13,  M18,  M21  khuếch đại các marker trên từng loại nhiễm sắc  thể như sau:  Bảng 1: Các loại dấu ấn được sử dụng trong bộ kit QF‐PCR  S1 S2 MXY M21 M18 M13 AMXY SRY SRY D21S1411 D18S386 D13S631 D21S1414 X22 AMXY D21S1435 D18S391 D13S634 D21S1446 DXYS218 HPRT D21S1437* D18S858* D13S742* D13S631 HPRT SBMA* D21S1412* D18S499* D13S628* D13S305 D21S1411 DXS6803* D21S1008* D18S1002* D18S535 D21S1435 DXS6809* D18S391 D13S634 DXS8377* D13S258 D18S386 D18S390 Hai bộ mix S1, S2 cho phép phân tích đồng  thời bốn dấu ấn của mỗi nhiễm sắc  thể số 13,  21, 18, hai trình tự lặp lại ngắn trên giả nhiễm  sắc  thể  thường  (X22,  DXY218),  Amelogenin  (AMXY) và SRY. Sau khi chạy PCR trên 2 loại  mix S1, S2, sản phẩm khuếch đại sẽ được trộn  chung và điện di mao quản cùng một lượt. Bốn  loại master mix còn lại (còn gọi là dấu ấn phụ)  dùng  để  chạy bổ  sung khi kết quả phân  tích  S1S2 cho biết bốn dấu ấn của từng  loại nhiễm  sắc thể đều ở dạng đồng hợp. Khi đó, kết quả  của marker phụ  tương ứng  sẽ cho kết quả  rõ  ràng  hơn  hoặc  là  củng  cố  thêm  kết  quả  bất  thường  có  được  từ  phân  tính  S1S2. QF‐PCR  được  thực  hiện  theo  chu  kỳ  nhiệt  như  sau:  hoạt  hóa men  Taq  polymerase  95oC/15  phút,  biến  tính  95oC/40  giây,  bắt  cặp  60oC/90  giây,  kéo  dài  72oC/40  giây,  kéo  dài  cuối  cùng  60oC/60 phút. Sản phẩm có thể được giữ ở 4oC  đến khi bắt đầu điện di mao quản.  Điện di mao quản sản phẩm khuếch đại.   Sản phẩm QF – PCR là những đoạn DNA có  chiều  dài  khác  nhau,  được  đánh  dấu  huỳnh  quang  ở một mạch  đơn  theo  nguyên  tắc  như  sau: Nếu chiều dài đoạn DNA khác nhau giữa  các dấu  ấn  thì màu huỳnh quang giống nhau.  Nếu  chiều  dài  DNA  được  khuếch  đại  giống  nhau  ở hai  loại dấu  ấn khác nhau  thì  sẽ  đánh  dấu bằng các màu huỳnh quang khác nhau. Khi  điện di,  đoạn ngắn  sẽ  chạy  đển  đầu  đọc  laser  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Sản Phụ Khoa 147 trước  và  đoạn  dài  sẽ  chạy  đến  sau.  Tín  hiệu  được  ghi  nhận  bằng  phần mềm  chuyên  dụng  Data Collection Version 3.0 của hãng ABI.  Phân tích kết quả QF‐PCR.   Sử dụng phần mềm phân tích Gene Marker  phiên bản 1.91. Mẫu  được xem  là  đạt khi xuất  hiện đủ các tín hiệu của thang chuẩn, phân tích  rõ các  tín hiệu của các đoạn khuếch đại, cường  độ  huỳnh  quang  cao.  Phần mềm  sẽ  tính  toán  dựa trên diện tích và cường độ huỳnh quanh để  tính ra tỉ lệ của các dấu ấn tương ứng của từng  loại  nhiễm  sắc  thể  13,  18,  21, X, Y. Mẫu  được  xem  là không  đạt khi không xuất hiện  đầy  đủ  các  tín  hiệu  của  thang  chuẩn  hay  các  tín  hiệu  huỳnh quang khuếch đại của dấu ấn các allele bị  thiếu.  KẾT QUẢ  Từ  tháng 03/2010  đến  tháng 01/2011  chúng  tôi thu thập được 64 mẫu ối từ thai kỳ nguy cơ.  Trong  đó  phát  hiện  được  10  trường  hợp  bất  thường  (16,9%). Tỉ  lệ  thực hiện  kỹ  thuật QF  –  PCR thành công là 100% trên tất cả 64 mẫu dịch  ối. Tất cả 64 mẫu này khi được ly trích DNA tế  bào ối, thực hiện phản ứng QF – PCR và điện di  mao quản cho tín hiệu huỳnh quang đẹp. Thực  hiện  chế  độ  phân  tích  bằng  phần  mềm  GeneMarker phiên bản 1.91 đều thành công với  64 mẫu.  Trong số 64 mẫu được thực hiện QF – PCR,  có 26 mẫu cho kết quả là nữ bình thường chiếm  tỉ  lệ  40,6%,  29 mẫu  cho  kết  quả  là  nam  bình  thường chiếm tỉ lệ 45,3%. QF – PCR đã phát hiện  được  10  trường  hợp  bất  thường  gồm  3  mẫu  trisomy  21,  3 mẫu mang hội  chứng Klinefelter  (XXY), 3 mẫu trisomy 18 (hội chứng Edward), 1  mẫu phát hiện monosomy X (hội chứng Turner).  Khi  so  sánh  với  kết  quả  nhiễm  sắc  thể  đồ  thì  chúng  tôi  thấy QF‐PCR đạt độ nhạy và độ đặc  hiệu là 100%.  Hình 1: Kết quả trisomy 21 của một mẫu ối được thực hiện bằng kỹ thuật QF‐PCR  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 148 Hình 2: Kết quả trisomy 21 trên dấu ấn phụ  Bảng 2: Kết quả so sánh giữa QF‐PCR và nhiễm sắc thể đồ  N XX XY T21 T18 XO XXY QF 64 26 (40,6%) 29 (45,3%) 3(4,7%) 3(4,7%) 1 (1,6%) 3(4,7%) Nhiễm sắc thể đồ 64 26 (40%) 29 (45%) 3(4,7%) 3(4,7%) 1 (1,6%) 3 (4,7%) BÀN LUẬN  Chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật QF‐PCR cho  kết quả tương đồng với kỹ thuật nhiễm sắc thể  đồ 100%. Đồng thời, kỹ thuật QF‐PCR đưa ra kết  quả nhanh và  đáng  tin  cậy  trong vòng  24 giờ.  Những  bất  thường  dị  bội  thể  thường  gặp  đã  được phát hiện thành công trong tất cả các mẫu.  Các  thao  tác  trong  kỹ  thuật QF  khá  đơn  giản,  thực hiện nhanh. Vì vậy, ưu điểm đầu  tiên của  kỹ  thuật QF  là  ít  tốn  thời  gian  hơn  so  với  kỹ  thuật nhiễm sắc thể đồ.  Kỹ  thuật  QF  cơ  bản  được  dựa  trên  là  kỹ  thuật PCR kinh điển  trong đó cải  tiến  thêm về  khả năng khuếch đại được nhiều loại DNA đích  khác nhau trong 1 phản ứng PCR đồng thời các  loại mồi xuôi được đánh dấu bởi các màu huỳnh  quanh khác nhau giúp phát hiện được sản phẩm  khuếch đại bằng hệ thống điện di mao quản và  phân biệt từng nhóm sản phẩm khuếch đại dựa  trên  màu  huỳnh  quang  và  chiều  dài  đoạn  khuếch đại. Kết quả điện di phát hiện các đỉnh  huỳnh  quang  được  ghi  nhận  bằng  phần mềm  đọc  tín hiệu  chuyên dụng. Bên  cạnh  đó, phần  mềm  phân  tích  (GeneMarker  phiên  bản  1.91)  giúp  ta  tính  toán  được  cường  độ màu  huỳnh  quang và diện tích các đỉnh từ đó tính ra được tỉ  lệ bình  thường hay bất  thường  của mẫu.  Điều  này giúp cho việc nhận định kết quả QF vô cùng  khách quan, không phụ thuộc vào cái nhìn cảm  quan của người làm thí nghiệm.  Dịch ối có đôi khi không tránh khỏi bị lẫn tế  bào máu mẹ;  tùy  thuộc  vào  lượng máu mẹ  bị  nhiễm vào nhiều hay  ít mà kết quả QF không  hoặc có thể sai lệch. Nếu  lượng máu mẹ nhiễm  chỉ chiếm khoảng dưới 20% tổng lượng tế bào ối  thu  thập  được  thì kết quả QF  sẽ không bị  ảnh  hưởng. Đối với những mẫu ối bị nhiễm máu mẹ  nhiều, ta có thể nuôi cấy để  loại đi tế bào máu.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Sản Phụ Khoa 149 Sau đó mới dùng dịch cấy tế bào này thực hiện  kỹ thuật QF – PCR.  Kỹ  thuật QF‐PCR chỉ khảo sát 5  loại nhiễm  sắc thể là nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y bởi vì  tỉ lệ dị tật bẩm sinh liên quan đến bất thường số  lượng nhiễm  sắc  thể  của 5  loại này  chiếm  tỉ  lệ  cao nhất (95%). So với tác giả Maj A.Hulten(8) đã  thực nghiên cứu trên dịch ối bằng kỹ thuật QF‐ PCR thì kết quả của chúng tôi cũng cho thấy có  sự  tương đồng về độ  tin cậy, nguy cơ của việc  chẩn  đoán  sai  là  rất  thấp. Một  tác  giả  khác  là  Chrysanthy Bili(1) đã  tiến hành nghiên cứu  trên  1100 mẫu ối thuộc dân số Hy Lạp và cũng đưa  ra  được  kết  luận  là  kỹ  thuật QF‐PCR  rất  hiệu  quả trong chẩn đoán trước sinh và nên đựa vào  thực hiện như một xét nghiệm thường qui. Tuy  nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên cỡ mẫu  nhỏ  nhưng  cũng  giúp  xác  định  ban  đầu,  kỹ  thuật QF‐PCR hoàn toàn có thể thực hiện được  thành công tại Việt Nam.  KẾT LUẬN  Việc  ứng  dụng  kỹ  thuật  sinh  học  phân  tử  vào  lĩnh vực  chẩn  đoán  trước  sinh nhanh dần  trở nên hiệu quả và ngày càng được tin cậy. Kỹ  thuật QF‐PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu và  tỷ  lệ  thất  bại  tương  đương  với  kỹ  thuật  karyotype  trong chẩn đoán dị bội các nhiễm sắc thể thường  gặp nên có thể sử dụng đối với các thai phụ do  tuổi mẹ  cao  hay  bất  thường  trên  siêu  âm mà  không cần thực hiện tầm soát sinh hoá. Với thời  gian trả kết quả ngắn trong 1 đến 2 ngày, chính  xác và khả năng tự động hoá cao, kỹ thuật QF‐ PCR  có  thể  ứng dụng  thường  quy  trong  chẩn  đoán trước sinh để có kết quả chẩn đoán lệch bội  sớm giảm tình trạng lo lắng cho thai phụ.  Do  thời gian và kinh phí có hạn nên đề  tài  chỉ  được  thực  hiện  trên  cỡ mẫu  nhỏ  và  cách  chọn mẫu là thuận tiện. Tuy nhiên, kết quả thu  được chứng minh rằng đề tài đã được thực hiện  thành công. Chúng tôi mong muốn thực hiện đề  tài này với phạm vi mẫu  lớn hơn  trên sản phụ  Việt Nam để từ đó tìm ra những kinh nghiệm có  thể  áp  dụng  trên  người  Việt  Nam,  nâng  khả  năng  chẩn  đoán  trước  sinh bằng kỹ  thuật  sinh  học phân tử nói chung lên một tầm cao mới.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bili C, Divane A, Apessos A, Konstantinos T, Apostolos A,  Ioanmis  B,  et  al  (2002).  Prenatal  diagnosis  of  common  aneuploidies  using  quantitative  fluorescent  PCR.  Prenatal  Diagnosis, 22: 360 ‐ 365.   2. Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, Lloveras E, Plaja A,  Perez  Md,  et  al  (2011).  Clinical  application  of  multiplex  quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF ‐ PCR)  for  the  rapid  prenatal  detection  of  common  chromosome  aneuploidies. Molecular Human Reproduction, 7: 1001 ‐ 1006.  3. Cirigliano V, Sherlock J, Conway G, Quilter C, Rodeck C, &  Adinolfi M  (1999). Rapid detection of chromosome X and Y  aneuploidies  by  quantitative  fluorescent  PCR.  Prenatal  Diagnosis, 19: 1099 ‐ 1103.  4. Cirigliano V, Voglino G, Ordonez E, Marongiu A, Canadas  M,  Ejarque  M,  et  al  (2009).  Rapid  prenatal  diagnosis  of  common chromosome aneuploidies by QF ‐ PCR, results of 9  years of clinical experience. Prenatal Diagnosis, 29: 40 ‐ 49.  5. Dupont  A, Vaeth M, Videbech  P  (1986). Mortality  and  life  expectancy  of Down’s  synfrome  in Denmark.  J Ment Defic  Res, 30: 111 ‐ 120.  6. Hook  EB  (1981).  Rates  of  chromosomal  abnormalities  at  different maternal ages. Obstet Gynecol, pp.58 ‐ 292.  7. Hsu  LYF  (1986).  Prenatal  diagnosis  of  chromosome  abnormalities; in Milunsky A (ed): Genetic Disorders and the  Fetus, ed 2. New York, Plenum Press,, pp 115–183.   8. Hulten NA, Dhanjal  S, & Pertl B  (2003). Rapid  and  simple  prenatal  diagnosis  of  common  chromosome  disorders:  advantages  and  disadvantages  of  the  molecular  methods  FISH and QF ‐ PCR. Reproduction, 126: 279 ‐ 297.   9. Kalousek  DK, Barrett  IJ, McGillivray  BC  (1989).  Placental  mosaicism and  intrauterine  survival of  trisomies 13 and 18.  Am J Genet, 44(3): 338‐43  10. OʹBrien WF, Knuppel RA, Kousseff B, Sternlicht D, Nichols P  (1988).  Elevated  maternal  serum  alpha  ‐  fetoprotein  in  triploidy. Obstet Gynecol, 71: 994‐995.   11. Platt  LD, DeVore  GR, Lopez  E, Herbert  W, Falk  R, Alfi  O  (1986).  Role  of  amniocentesis  in  ultrasound  detected  fetal  malformations. Obstet Gynecol, 68(2): 153‐155.  12. Warburton D (1987). Chromosomal causes of fetal death. Clin  Obstet Gynecol, 30: 268‐277.  13. Warburton D, Kline J, Stein Z, Susser M (1980). Monosomy X.  A  chromosomal  anomaly  associated  with  young maternal  age. Lancet, 1: 167‐169.   14. Williamson  RA, Weiner  CP, Patil  S, Benda  J, Varner  MW, Abu‐Yousef  MM.  (1987).  Abnormal  pregnancy  sonogram. Selective  indication  for  fetal. Obstet Gynecol, 69:  15‐20.   Ngày nhận bài báo:       01/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   26/11/2013  Ngày bài báo được đăng:     05/01/2014