Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng trƣởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt. Vì vậy các nhà chọn giống đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu quả cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của việc chăn nuôi heo nhƣ: phẩm chất con giống, dinh dƣỡng, trình độ chăm sóc quản lý, vệ sinh phòng bệnh…Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng. Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nƣớc đã áp dụng nhiều chƣơng trình chọn giống mới kết hợp với phƣơng pháp chọn lọc truyền thống. Ngƣời ta đã tiến hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS). Theo các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000), Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh sản của nái. Trong nƣớc đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005) Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành chăn nuôi. Đƣợc sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire” 1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích Ứng dụng PCR để phát hiện sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và xác định kiểu gen của nó trong quần thể. 1.2.2 Yêu cầu Ly trích DNA từ mẫu máu và da tai 2 Xác định qui trình phản ứng PCR phù hợp nhất Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu ly trích đƣợc Xử lý enzyme các mẫu có sự hiện diện của gen PRLR Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR trên các mẫu 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorkshire Đây là giống heo lai giữa giống Large White và giống khác ở vùng Yorkshire của Anh Quốc, nên lấy tên gọi là giống Yorkshire. Giống heo này hiện nay đƣợc nuôi rộng rãi khắp nơi trên thế giới, và hầu hết các trại giống ở Việt Nam do những ƣu điểm thích nghi rộng và năng suất cao. Về hình dáng bề ngoài giống Yorkshire có những đặc điểm nhƣ thân hình dài, trông dáng vẻ nặng nề, đầu to, trán rộng, bụng gọn. Ngực rộng và sâu. Hai chân dài chắc khỏe, đùi to. Hai tai lớn hình tam giác, dựng đứng, sắc trắng. Sáu tháng tuổi đạt 90 – 100 kg, khi trƣởng thành nặng khoảng 250 – 300 kg. Mỗi năm đẻ từ 1.8 – 2.2 lứa, mỗi lứa khoảng 8 – 9 con, trọng lƣợng heo con sơ sinh 1.8 kg / con. Giống Yorkshire có đặc điểm nuôi con giỏi, là giống đứng đầu trong tổng đàn ngoại nhập ở nƣớc ta. 2.2 Prolactin 2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo Prolactin còn gọi là LTH (Luteo tropic hormone) . Ở ngƣời và các loài động vật hƣu nhủ prolactin đƣợc tổng hợp và phân tiết ở tế bào ƣa acid của tuyến não thùy. Nó là một polypeptide gồm mƣời chín cấu tử amino acid và trọng lƣợng phân tử khoảng 23000 Da. 2.2.2 Tác dụng của prolactin Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của ngƣời và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con. Trên một số loài động hữu nhũ, prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone. Prolactin đƣợc phân tiết từ các tế bào ƣa acid của tuyến não thùy theo máu di chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin. Sự tiếp nhận này đƣợc quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích. Bình thƣờng bất cứ heo mẹ, heo bố hay heo con nào cũng phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hƣởng của hormone này. Sự xuất hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin receptor gene). 4 2.2.3 Cơ chế tác động của prolactin Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor) tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP. c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, nhƣ tác động vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng và cả hoạt tác gen. Nguồn gốc: Hình scan từ Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM của PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận Hình 2.1: Cơ chế tác động của hormone tại tế bào mục tiêu Hoạt tác gen Kích hoạt các enzyme, hormone 5 2.2.4 Gen thụ thể prolactin Cùng với sự phát hiện ra gen thụ thể estrogen, gen halothan...Ngƣời ta cũng đã phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Gen này đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển trong công tác chọn giống ở các dòng heo: Large White, Landrace, Duroc...Theo các nghiên cứu của Vincent (1998), Linville, Drogemuler (2001), Hamann (2001) nếu trên các cá thể heo có sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỉ lệ sống sót của các heo con cao. Đặc biệt, trọng lƣợng heo con sinh ra vẫn duy trì ở mức bình thƣờng không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng thấy sự tăng khối lƣợng trên ngày của các cá thể heo con có sự hiện diện của gen thụ thể prolactin cao hơn các cá thể không có sự hiện diện của gen này. Các nghiên cứu về gen thụ thể prolactin chỉ dừng lại ở mức xác định mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất sinh sản hay tăng trọng cơ thể. Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo (Vincent, 1998). Ở heo gen PRLR đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 16. Gen này liên kết khá chặt chẽ với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23). Để xác định đƣợc tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Trƣớc ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này. Với cách này thì ông đã xác định đƣợc kích thƣớc của các băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 và 76 bp. Trong đó, băng 110 và 90 bp đƣợc xác định là đa hình. Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp đƣợc xác định là alen A, băng 110 bp đƣợc xác định là alen B. Gen PRLR có tính đa hình rất cao. Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn cắt cũng có nhiều kích thƣớc khác nhau. Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA, AB, BB. Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thƣớc heo con sinh ra đồng đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB. 6 Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank Locus SSU96306 Định danh Gen PRLR Số truy cập U96306 Sinh vật Ngƣời và các động vật hữu nhủ Tác giả Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Robic A., Rothschild M.F. Trình tự 1- agcaggagaa cggcgaccgg ccggagaagg ctggcgcccc tgaaaccagc aaggaatacg cccaggtgtc ccgggtgatg gataaccaca tcctggtgtt agtgcaggat ccgcgagctc gaaacgtggc tccgtttgaa gaaccaacca aggagacccc gccatcccgg ccgcagaatc cagctgcgaa agacctggcc agcttcacca cggccccggg ccactgcaga cacccgctgg gtgggctgga ttacctcgat cccgcaggct ttatgcactc ctttcagtga gagcttggtt catgggatga tgggttacaa ggtggggttt ttttcaggtc gcactacgtg aaatgcactc taccagagaa agctcgaaaa tggggttaga atgacactac ccagactcac agttcactcc tcttcatgct ccattttcaa ccacttgcc- 449 bp 2.3 Giới thiệu về DNA (Deoxyribonucleotide acid) Acid nucleic là vật chất mang thông tin di truyền của cơ thể sống. Acid nucleic đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm có ba thành phần: nhóm phosphate, đƣờng pentose, và nhóm bazơ hữu cơ. Bazơ hữu cơ gồm có hai nhóm: nhóm bazơ purin và nhóm bazơ pyrimidine. Nhóm purin gồm có: adenine (A) và guanine (G). Nhóm pyrimydine gồm có: thymine (T) và cytosine (C). Bốn loại bazơ hữu cơ này kết hợp với nhóm phosphate và đƣờng pentose tạo thành bốn loại nucleotide, ngƣời ta viết tắt chúng là A, T, G, C. Các nucleotide này nối với nhau thành một chuỗi dài hay mạch DNA. Phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hidro, liên kết đƣợc hình thành giữa các bazơ bổ sung A với T và G với C. A liên kết với T bằng hai liên kết hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro. Mỗi mạch đơn có một đầu OH tự do và một gốc phosphate tự do. Ngƣời ta qui ƣớc là đầu chứa gốc phosphate tự do là đầu 5’, đầu chứa gốc OH tự do là đầu 3’. 7 Một đặc điểm có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu phân tử DNA đó là khả năng hồi tính và biến tính của DNA: Sự biến tính là hiện tƣợng hai mạch DNA tách rời nhau do đứt gãy các liên kết hidro bởi nhiều yếu tố vật lý và hoá học nhƣ: nhiệt độ, dung dịch kiềm, formaline, urea…Hiện tƣợng biến tính do nhiệt độ xảy ra khi nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trƣờng. Tm cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA. DNA chứa càng nhiều G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng hơn để phá huỷ liên kết này. Hồi tính là hiện tƣợng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với nhau theo nguyên tác bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép. Đặc điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction). N N NH N NH2 N NH NH N NH2 O N NH NH2 O NH NH O O CH3 Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide nhƣ sau: Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide OH O O OH OH OH O P Bazơ hữu cơ Adenine Cytosine Guanine Thymine 8 2.3.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA DNA đƣợc xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi . Đặc điểm cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semiconservative replication). Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời của chuỗi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân tử DNA con đƣợc hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ. Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuỗi DNA mẹ nhờ enzyme topoisomerase và protein DNA A. Trong quá trình sao chép các chuỗi tách rời nhau dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide. Nhiều loại helicase cùng họat động đồng thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’. Các mạch tách rời sẽ đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn lại với nhau. Sự tái bản đƣợc khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ các DNA polymerase. Sự thêm các nucleotide luôn theo hƣớng 5’– 3’. Tức là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch. Trên mạch khuôn 3’ - 5’ sự tái bản theo chiều 5’- 3’ cùng hƣớng với chiều tháo xoắn sự tái bản trên mạch này diễn ra một cách liên tục và đƣợc gọi là sợi tiến nhanh. Trên mạch còn lại sự tái bản diễn ra ngƣợc với chiều tháo xoắn. Sự tổng hợp mạch mới ở đây không diễn ra liên tục mà dƣới dạng những đoạn ngắn gọi là những đoạn Okazaki. Sự tái bản bán bảo thủ có vai trò rất quan trọng vì qua đó khi tế bào phân chia có thể truyền sang tế bào con bản sao nguyên vẹn toàn bộ cơ cấu di truyền của nó. Trong sự phân bào bình thƣờng thì DNA đƣợc nhân đôi khi các nhiễm sắc thể tách rời nhau. 9 Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA STT Tên Chức năng 1 DNA mẹ Làm khuôn cho sự tổng hợp 2 Nucleotide: A, T, G, C Nguyên liệu cho sự tổng hợp 3 Mg 2+ Cần thiết cho hoạt động của các enzyme DNA polymease 4 Ezyme: DNA polymerase, topoisomerase, helicase, RNA primase, protein DNA A… Tháo xoắn, tách các mạch đơn, cố định mạch đơn, tổng hợp mồi và kéo dài chuỗi. Hình 2.4: Sự nhân bản DNA Mạch đƣợc tổng hợp liên tục Mạch đƣợc tổng hợp từ các đoạn Okazaki 10 2.3.2 Gen, allen và sự đa hình của gen 2.3.2.1 Gen Gen là một đoạn DNA có khả năng kiểm soát một chức năng hoặc một tính trạng nào đó của cơ thể sống. Đoạn DNA có khả năng sao mã tạo ra mRNA (RNA thông tin). Từ mRNA thông tin này có thể đƣợc mã hóa tạo ra protein. Protein là đơn vị cấu tạo nên sự sống, mọi thành phần của cơ thể sống hầu hết đƣợc cấu tạo từ protein nhƣ các men tiêu hóa, các hormone, các thành phần cấu tạo của tế bào… Có nhiều gen không tham gia tổng hợp protein nhƣng nó có khả năng ức chế hoạt động của một gen hay một tổ hợp gen khác. Những loại gen này rất phổ biến ở động vật và ngƣời. Cấu trúc tổng quát của một gen động vật đƣợc phân chia thành hai vùng nhƣ sau: vùng mã hoá và vùng điều hoà ở đầu 5’(Lê Đức Trình, 2001; Bùi Trang Việt, 2002). Vùng mã hoá bao gồm một chuỗi lần lƣợt các exon và intron. Các exon là các vùng gen mã hoá protein. Theo qui ƣớc ngƣời ta gọi nucleotide thứ nhất nơi khởi sự sao chép là +1, nucleotide trƣớc đó là -1. Còn các intron là các vùng gen không mã hoá acid amin. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra rõ chức năng của vùng này trong quá trình biểu hiện gen. Vùng điều hoà gồm các enhancer và promotor. Các enhancer là nơi chứa các trình tự nhận biết chuyên biệt của nhiều yếu tố điều hoà. Các promotor bao gồm các trình tự từ 6 – 8 nucleotide (đôi khi đến 20 nucleotide), nhận biết một cách gián tiếp RNA polymerase, thƣờng nhất là : TATA box (trình tự giàu T và A, ví dụ TATAAA), GC box, CCAAT box. Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen Sự biểu hiện gen ở động vật rất phức tạp. Sự biểu hiện này bị tác động bởi các yếu tố điều hoà có bản chất là protein, steroid, DNA. Trên cấu trúc của gen, các enhancer có các vùng trình tự nhận biết đƣợc các yếu tố này và có thể dẫn đến hiện tƣợng sao chép DNA tạo ra mRNA. Nếu xảy ra sự sao chép thì mRNA tạo ra ban đầu sẽ trải qua quá trình trƣởng thành. Cả exon và intron đều đƣợc sao chép thành mRNA, nhƣng trƣớc khi rời khỏi nhân, các đoạn tƣơng ứng với intron bị loại đi, các đoạn exon còn lại nối lại với nhau tạo thành mRNA có trình tự liên tục mã hoá acid amin. 11 Sự liên kết giữa gen và marker Marker là một đoạn DNA liên kết với gen (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000). Khi phát ra những đoạn DNA mới kiểm soát một chức năng nào đó của cơ thể sống, ngƣời ta cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó. Điều này hoàn toàn có thể thực hiện đƣợc nhờ công trình có tính lịch sử của Morgan về liên kết gen và khoảng cách di truyền (tính bằng centi Morgan, viết tắt là cM). Bản đồ di truyền của ruồi giấm đƣợc phát hiện rất sớm vào năm 1925. Những tính trạng di truyền chung với nhau đƣợc xếp chung vào một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể. Những tính trạng này đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể tùy mức độ liên kết của nó. Sự sắp xếp độc lập của các nhiễm sắc thể giúp cho việc xác định vị trí các locus trong các nhóm liên kết gen. Sự xuất hiện của hiện tƣợng quấn chéo (crossing over) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự các locus trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền đƣợc đo bằng tần suất tái tổ hợp gen. Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó, mà ngƣời ta có thể đo đếm đƣợc – gen đó có thể xem là marker gen. Việc lập bản đồ gen và việc chọn lọc marker hình thái nhƣ vậy tốn rất nhiều thời gian, thậm chí hàng chục năm trời. Số lƣợng marker thu đƣợc theo kiểu chọn lọc này rất ít và chỉ có ở qui mô hình thái. Do vậy ngƣời ta đã sử dụng marker isozyme đã làm cho vấn đề thay đổi theo chiều hƣớng tốt hơn, nhƣng số lƣợng marker thu đƣợc cũng rất ít không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu. Trong tình hình này thì DNA marker đƣợc đề xuất (Tankley và ctv, 1980). Về căn bản thì bất cứ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem nhƣ một DNA marker. Nhƣng nó phải đảm bảo về tính ổn định, sự xuất hiện của nó phải luôn luôn có sự xuất hiện của gen quan tâm. 2.3.2.2 Allen và sự đa hình của gen Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen nhƣ sau: “ Allen là các dạng khác nhau của một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tƣợng đƣợc ông khảo sát ở đây là đậu Hòa Lan. Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền và locus đƣợc hình thành thì allen đƣợc định nghĩa lại nhƣ sau: “ Allen là 12 các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”. Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen. Gen có càng nhiều allen thì tính đa hình càng cao. Mỗi allen đƣợc hình thành từ sự đột biến đoạn mã di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trƣờng sống, các tác nhân vật lý, hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép. Các đột biến này nếu tạo thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ đƣợc duy trì và lan truyền trong quần thể. Nhƣ vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến ( Bùi Chí Bữu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang cùng một gen chƣa hẳn là có đoạn trình tự chuỗi mã di truyền của gen giống nhau, giữa những cá thể khác nhau thì luôn xuất hiện đột biến khác nhau nhƣng hiếm khi biểu hiện thành các đặc điểm hình thái. Tính đa hình của gen trong trƣờng hợp này chỉ đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phân tích ở mức phân tử. 2.3.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật DNA đƣợc chiết tách từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật DNA đƣợc chiết tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Qui trình này cơ bản gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hổn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phƣơng pháp ly tâm. Bƣớc 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol. 13 2.3.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA 2.3.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) Phƣơng pháp này không thật chính xác, chỉ ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ acid nucleic có trong mẫu. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng λ = 260 nm. Một đơn vị OD tƣơng ứng với nồng độ là: - 50 μg / ml cho một dung dịch sợi đôi - 40 μg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn Ví dụ: một OD260 nm= 0,9 sẽ tƣơng ứng với: - Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi bằng 0,9*50 = 4,5 μg - Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA bằng 0,9*40 = 3,6 μg Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch có độ tinh sạch cao. Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA thu đƣợc ngƣời ta đo thêm giá trị OD 280 nm, ở bƣớc sóng này protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhƣng các protein cũng hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm, do đó làm sai giá trị thật của acid nucleic có trong mẫu. Một dung dịch acid nucleid đƣợc xem là sạch nếu có tỉ số OD260 nm / OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. Nồng độ DNA trong mẫu đƣợc tính bằng công thức sau: Nồng độ (ng / μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36 2.3.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kích thƣớc của các đoạn DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gelling). Giữa những hạt nhƣ vật có những lỗ rất nhỏ. Tùy theo nồng độ của gel mà kích thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel càng cao thì kích thƣớc của các lỗ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lỗ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này. DNA có kích thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kích thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị trí 14 và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và đặt dƣới tia tử ngoại. 2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 2.4.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase. Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94 - 95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR 2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 2.4.2.1 Taq polymerase Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72 o C 45-56o C 15 Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2.4.2.2 Các nucleotid dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. 2.4.2.3 Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn oligoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymeresa bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. 2.4.2.4 Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg 2+. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5 mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg 2+. Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm những sản phẩm đƣợc phát triển một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. 16 2.4.2.5 DNA khuôn Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. 2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzyme dùng trong phản ứng. 2.4.2.7 Nhiệt độ và pH Những enzyme đƣợc sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 72o C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C. Hầu hết các enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. 2.4.2.8 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR chúng ta thƣờng gặp những hiện tƣợng không mong muốn nhƣ: không có hiện diện sản phẩm PCR, sản phẩm PCR ít, xuất hiện các băng phụ. Dƣới đây là bảng trình bày các hiện tƣợng không mong muốn xảy ra khi thực hiện phản ứng PCR và cách khắc phục nó. 17 Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 1. Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trƣng Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM. Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng tap polymerase 2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trƣng Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng Taq polymerase 18 3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông. Gia tăng hàm lƣợng mồi Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C 4. Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể Gia tăng lƣợng mồi Gia tăng lƣợng DNA khuôn Gia tăng lƣợng Taq polymerase 2.4.2.9 Ứng dụng của PCR PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực: Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus. Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin... Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn vius có trong mẫu thực phẩm. Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen… 2.5 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP 2.5.1 Kỹ thuật RFLP ( restriction fragment length polymorphism) Đây là phƣơng pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay không đột 19 biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA. Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngƣợc lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Các bƣớc để tiến hành kỹ thuật RFLP: Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu đƣợc với enzyme cắt Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp Xác định kích thƣớc của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện Southern blot và đƣa ra kết luận Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thƣớc rất khó phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không dễ gì phát hiện ra đƣợc sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận đƣợc hình ảnh là một dải liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng. 2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau: 20 Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình. Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp. Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra kết luận. 2.6 Các enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá cuối năm 1960, có khả năng cắt DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích gen. Ngƣời ta phân ra làm ba loại enzyme : Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự , nó sẽ di chuyển một đoạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Loại 2 là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử. Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide. Có hai kiểu cắt chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng: Kiểu cắt đầu bằng: Kiểu cắt đầu dính: …TGG CCA… …ACC GGT… …C GGCCG… …GCCGG C… Enzyme Eco52I …AG CT… …TC GA… Enzyme AluI Enzyme BalI 21 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1 Thời gian, địa điểm 3.1.1 Thời gian Khóa luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005. 3.1.2 Địa điểm Lấy mẫu máu, da tai tại trại giống Đông Á, huyện Dĩ An tỉnh Bình Dƣơng. Tiến hành xét nghiệm mẫu để phát hiện gen thụ thể prolactin tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống. 3.3 Nội dung thực hiện Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai. Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống. Phân tích kiểu gen của các heo giống Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm Vật liệu Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu máu và mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái tại trại giống Đông Á. Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đƣng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nƣớc đá, bình tam giác. 22 Các thiết bị, máy móc  Tủ cấy vô trùng  Bồn ổn nhiệt  Máy li tâm  Tủ định ôn  Tủ lạnh  Máy đo OD  Tủ sấy dụng cụ  Thiết bị điện di  Máy chụp gel  Lò vi sóng 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Thu thập mẫu Các mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên trên các heo nái giống Yorkshire. Các loại mẫu lấy bao gồm: Lấy máu từ tỉnh mạch tai Lấy mẫu da tai Mỗi con heo thì lấy đồng thời mẫu máu và mẫu da tai. Cách thu thập và bảo quản mẫu Mẫu máu: lấy khoảng 1-1.5 ml máu ở mỗi cá thể heo. Máu đƣợc cho vô ống nghiệm vô trùng chứa sẵn 4mg Na2ETDA. Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng. Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70o C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20o C. khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích. 23 3.4.2.2 Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu của Roe và ctv, 1998) 1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm 400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10o C, lấy cặn. 2. Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở 10 oC, lấy cặn. Lặp lại bƣớc này cho đến khi phần cặn trở nên trắng. 3. Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS 10 %; 3 µl proteinase K (20 mg / ml), ủ hỗn hợp gần 1 giờ trong tủ ấm ở 55o C. 4. Cho vào 60 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1.5 ml mới, sau đó cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ - 20o C trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi lấy phần cặn, làm ráo. 7. Cho vào 100 l TE 1X, vortex, ủ 55o C trong 15 phút. 8. Cho vào 10 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 250 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 oC, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 500 l ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55o C. 11. Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay. Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 đƣợc Lê Thị Thu Phƣơng (2004) điều chỉnh) 1. Cho khoảng 5 mm3 da vào eppendorf 1.5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 24 2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS, pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml). Ủ hổn hợp ở 55oC trong 1 giờ. 3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây. 4. Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20oC trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn, làm ráo. 7. Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55oC trong 15 phút. 8. Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều , ủ ở - 20o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm 55o C 11. Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay. 3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Tiến hành đo sản phẩm DNA ly trích bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 – 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính bằng công thức: Nồng độ (ng / μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36 DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. 3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn Xây dựng qui trình phản ứng PCR o Xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR 25 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version 2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer: Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’ Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’ Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng 4 o C. Vincent (1998) đã đƣa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này để thực hiện phản ứng PCR. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí nghiệm của nƣớc ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR Qui trình 1 Qui trình 2 Bƣớc Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) 1 2 3 4 5 93 93 60 72 72 180 30 60 60 3 93 93 62 72 72 180 30 60 60 3 Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại 35 lần  Ghi chú:  Qui trình 1 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong việc phát hiện gen PRLR (qui trình 2 trang 26)  Qui trình 2 là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR 26 Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer – dimer sẽ xuất hiện, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá ít. Do đó việc xác định tỉ lệ giữa nồng độ primer và DNA mẫu trong phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Để xác định nồng độ thích hợp của primer trong phản ứng PCR phát hiện gen PRLR chúng tôi tiến hành thực hiện ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ở (bảng 3.2) Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR theo qui trình nhiệt 2 Thành phần Nồng độ cuối Qui trình 1 Qui trình 2 Qui trình 3 PCR bufer 10X MgCl2 (25 mM) dNTPs ( 2,5 mM / µl) Mồi xuôi (10 pmol / µl) Mồi ngƣợc (10 pmol / µl) Taq polymerase (5UI / µl) DNA khuôn 1 X 2 mM 1 mM 5 pmol 5 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 10 pmol 10 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 15 pmol 15 pmol 0,6 UI 20 ng Thể tích ( l) 25 25 25 Ghi chú:  Qui trình 2 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong công tác phân tích sự đa hình của gen PRLR  Qui trình 1, 3 là qui trình thí nghiệm xác định nồng độ primer thích hợp nhất Xác nồng độ các hoá chất cắt enzyme giới hạn AluI Thể tích của các chất tham gia trong việc xử lý enzyme giới hạn đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.3 sau: 27 Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI Thành phần Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 Thể tích (µl) Thể tích (µl) Thể tích (µl) Nƣớc cất RE 10X Buffer Acetylated BSA (10 µg / µl) DNA (*) Enzyme (10 UI / µl) 16,3 2 0,2 1 0.5 17,2 2 0,4 20 0,4 11,75 2,5 0,6 10 0,15 Tổng thể tích 20 40 25  Ghi chú:  (*) – Nồng độ DNA ở cả 3 qui trình khác nhau: ở qui trình 1 nồng độ DNA theo đề nghị của nhà sản xuất là 1 µg / µl; qui trình 2, 3 là sản phẩm PCR  Qui trình 1 là qui trình đề nghị của nhà sản xuất  Qui trình 2 đƣợc đề nghị bởi A.L. Vincent (1998)  Qui trình 3 là qui trình thí nghiệm Ủ hỗn hợp 3 - 12 giờ. 3.4.2.4.2 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích Chọn qui trình PCR và qui trình cắt enzyme giới hạn thích hợp nhất để phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Yêu cầu của các qui trình đƣợc áp dụng để phát hiện ra gen thụ thể prolactin nhƣ sau:  Qui trình PCR xem là thích hợp khi nó có tính ổn định cao, phát hiện ra sự hiện diện của gen thụ thể một cách chính xác không xuất hiện trƣờng hợp âm tính giả hoặc dƣơng tính giả. Các sản phẩm PCR thu đƣợc không xuất hiện các băng phụ mà chỉ hiện diện sản phẩm chính. 28  Khi chọn qui trình xử lý enzyme giới hạn không những căn cứ vào hiệu quả của việc cắt mà còn căn cứ vào hiệu quả kinh tế của việc sử dụng enzyme và hoá chất Xác định sự hiện diện của gen PRLR  Tiến hành phản ứng PCR với các mẫu DNA đã đƣợc ly trích  Tiến hành điện di sản phẩm PCR với nồng độ gel 1,5 %, 100 V, 250 mA, trong 30 phút. o Qui trình điện di đƣợc tiến hành nhƣ sau : Cân 0,6 g agarose LMP (low melting agarose) cho vào bình chứa 40 ml dung dich TBE 0,5X Tiến hành đun agarose trong bồn nhiệt (70oC) cho đến khi tan hết. Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhiệt độ gel bằng với nhiệt độ phòng là đƣợc Đặt lƣợt vào khay đổ gel, tiến hành đổ gel sao cho tránh bọt khí Để nguội khoảng 2 giờ đến khi gel cứng hoàn toàn, rút lƣợt ra Cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TBE 0,5X sao cho dung dịch này ngập miếng gel khoảng 1 – 1,5 cm Cho DNA vào giếng : Trộn 8 l với loading dye trên giấy nhôm hoặc giấy parafin dùng pipet bơm vào các giếng. Điều chỉnh các thông của bồn điện di : 100 V, 250 mA, trong 30 phút. Nhuộm gel với ethium bromide trong 30 phút Đọc kết quả điện di sản phẩm PCR  Thống kê kết quả phản ứng PCR thành công và kết luận tỉ lệ phần trăm xuất hiện của gen PLRL Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR  Tiến hành phân cắt enzyme giới hạn AluI các mẫu có phản ứng PCR thành công.  Tiến hành điện di sản phẩm phân cắt với loại gel LMP có nồng độ cao (3,5%) để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ (60 bp đến 130 bp) , do gen PRLR sau 29 khi phân cắt tạo thành các đoạn có kích thƣớc dƣới 60 bp. Các thông số của quá trình điện di: 50 V, 48 mA, 60 phút. Để đo kích thƣớc của các đoạn DNA sau khi xử lý enzyme khi điện di chúng ta cho thêm ladder 25 bp vào một giếng, dùng ladder này để đo kích thƣớc của các đoạn DNA.  Đọc kết quả trên gel trên máy chụp gel (máy Gel doc) nối với máy vi tính sử dụng phần mềm Quantity one Gen thụ thể prolactin có 2 alen là A, B. Enzyme AluI cắt sản phẩm PCR thành các băng có kích thƣớc khác nhau : 124 bp, 110 bp, 90 bp, 79 bp, 76 bp nhƣng có sự xuất hiện của băng DNA 90 bp là alen A, 110 bp là alen B. 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai 4.1.1 Mẫu máu Việc thu thập mẫu máu bị hạn chế do các yếu tố khách quan nhƣ: Các heo lấy mẫu là các heo nái đang mang thai Muốn lấy mẫu máu phải dùng các dụng cụ để khớp mỏ heo lại Thời tiết vào thời gian lấy mẫu rất nóng nực Đây là các yếu tố rất dễ gây stress dẫn đến sảy thai, đẻ non, các heo con sinh ra không đƣợc khỏe mạnh.. Do đó chỉ thu đƣợc 10 mẫu máu của 10 heo nái, còn lại là các mẫu da tai. Việc lấy mẫu da tai tƣơng đối đơn giản. Tai heo đƣợc bôi cồn sát trùng sau đó dùng kiềm bấm một mẫu da tai nên không gây ảnh hƣởng nhiều lên heo. Nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA thu đƣợc từ các mẫu máu. Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu Mẫu Tỉ số OD260 nm / 280 nm OD260 nm OD280 nm Nồng độ (ng / µl) 1 1,41 0,17 0,12 6,37 2 1,45 0,16 0,11 6,1 3 1,16 0,12 0,06 5,39 4 1,45 0,21 0,12 8,89 5 1,52 0,09 0,06 3,5 6 1,33 0,13 0,1 4,58 7 1,5 0,15 0,10 5,84 8 1,33 0,20 0,15 7,18 9 1,45 0,12 0,06 5,39 10 1,6 0,09 0,056 3,65 Trung bình ( X ) 1,42 0,14 0,09 5,51 Độ lệch chuẩn ± 0,12 ± 0,04 ± 0,03 ± 1,75 Tỉ số OD của các mẫu máu thu đƣợc tƣơng đối thấp, OD260 nm / 280 nm trung bình là 1,42. Mẫu DNA ly trích đƣợc xem là sạch, không tạp nhiễm protein nằm trong khoảng 1,8 – 2 (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Phƣơng (2003) thì độ tinh sạch của mẫu máu cao hơn mẫu da tai. Kết quả này ngƣợc với kết 31 quả do chúng tôi tiến hành. Điều này có thể lý giải do việc ly trích DNA từ máu rất phức tạp, để thu đƣợc mẫu máu tinh sạch cần tốn rất nhiều thời gian ly tâm với dung dịch TE 1X để tách các phân tử hemolobin từ máu, các tế bào máu có thể theo dung dịch tẩy rửa ra ngoài qua quá trình hút rửa. Nồng độ DNA ly trích cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA mẫu bằng dung dịch đệm. Để có mẫu DNA có độ tinh sạch cao, nồng độ cao trong quá trình ly trích chúng ta cho vào một thể tích dung dịch đệm tƣơng đối ít. Ví dụ ta có mẫu DNA có tỉ số OD260 nm / 280 nm= 1,85 muốn mẫu này có nồng độ DNA trong mẫu cao thay vì cho vào 200 µl dung dịch đệm TE 1X chúng ta chỉ cho vào từ 50 – 100 µl dung dịch TE 1X thì nồng độ DNA trong mẫu tăng lên đáng kể phù hợp với các yêu cầu nghiên cứu. 4.1.1 Mẫu da tai Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA của các mẫu da tai tƣơng đối cao, tỉ số OD260 nm / 280 nm đạt mức trung bình là 1,82, nồng độ DNA trung bình trên một mẫu là 8,98 ng / µl tƣơng đối phù hợp với yêu cầu thực hiện phản ứng PCR. Mẫu da tai sau khi giã nhuyễn đƣợc xử lý proteinase K không cần phải qua các thao tác tẩy rửa phức tạp, proteinase K phân cắt các phân tử protein có cấu trúc phức tạp thành các đoạn acid amin ngắn. Các đoạn acid amin này dể dàng bị loại bỏ qua quá trình rửa phenol / chloroform / isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm thì toàn bộ DNA nhân của các mô liên kết đƣợc giữ lại ở phần nƣớc nổi bên trên, protein và cặn chìm xuống phía dƣới, lấy nƣớc nổi này và tiến hành thu DNA Đây chính là lý do mà mẫu da tai sau khi ly trích có độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA cao. 32 Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai Mẫu Tỉ số OD260 nm / 280 nm OD260 nm OD280 nm Nồng độ DNA (ng / µl) 1 1,83 0,11 0,06 4,76 2 1,89 0,15 0,07 6,92 3 1,73 0,92 0,53 38,79 4 1,8 0,64 0,35 27,66 5 1,71 0,12 0,07 5,03 6 1,75 0,21 0,12 8,89 7 1,85 0,17 0,09 7,45 8 1,83 0,25 0,14 10,69 9 1,94 0,21 0,11 9,25 10 1,86 0,26 0,14 11,31 11 1,85 0,15 0,08 6,56 12 1,84 0,08 0,04 3,59 13 1,88 0,12 0,06 5,39 14 1,95 0,22 0,11 9,88 15 1,7 0,16 0,09 6,82 16 1,75 0,21 0,12 8,89 17 1,90 0,12 0,068 5,1 18 1,8 0,09 0,05 3,86 19 1,96 0,10 0,06 4,13 20 1,73 0,15 0,08 6,56 21 1,84 0,16 0,09 6,82 22 1,85 0,16 0,09 6,82 23 1,83 0,08 0,044 3,45 24 1,90 0,37 0,19 16,43 25 1,78 0,10 0,056 4,27 26 1,84 0,17 0,092 7,38 27 1,7 0,09 0,052 3,79 28 1,85 0,16 0,086 6,97 29 1,71 0,13 0,076 5,44 30 1,85 0,07 0,037 3,07 Trung bình ( X ) 1,82 0,198 0,12 8,47 Độ lệch chuẩn ± 0,074 ±0,174 ±0,11 ±7,46 33 4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau Để tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp nào là tối hảo cho cặp primer đang tiến hành thí nghiệm chúng tôi tiến hành thực hiện 15 phản ứng trên mẫu da tai cho mỗi qui trình. Mẫu da tai đƣợc chọn do hàm lƣợng DNA cao, độ tinh sạch tƣơng đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả của hai qui trình phản ứng đƣợc trình bày ở (Bảng 4.3) Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) 1 15 10 66,7 2 15 10 66,7 Với kết quả này thì hai qui trình nhiệt độ đều phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Ở qui trình 1, nhiệt độ bắt cặp thấp hơn, các primer không hoàn toàn bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, có một số lƣợng nhỏ primer bắt cặp không đặc hiệu, tạo thành các sản phẩm phụ chuỗi dài và ngắn hơn sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau khi chạy điện di xuất hiện những vệt dài sáng (giống nhƣ hiện tƣợng sao chổi) kèm theo đó là các băng phụ của các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Ở qui trình 2 nhiệt độ bắt cặp cao hơn 2o C, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, không xuất hiện vệt dài sáng nhƣ ở qui trình 1. Nhƣ vậy, qui trình của Vincent khi tiến hành tại điều kiện phòng thí nghiệm của chúng ta không phù hợp và phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp tăng lên khoảng 2o C. 34 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % 1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều xuất hiện các vệt sáng dài 2, 4, 6, 8: Các giếng không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2 1 2 3 4 5 6 7 8 Các vệt dài sáng Sản phẩm PCR 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR Các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer) 35 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Để tiến hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai. Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Bảng 4.4): Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Qui trình PCR