Ứng dụng kỹ thuật phân tử phát hiện đột biến gen α globin gây bệnh hemoglobin h

tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 80 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Alpha thalassemia là bệnh di truyền đơn gen phổ biến, là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu ở trẻ em, do đột biến gen α-globin nằm trên cánh ngắn NST 16 (16p13.3) quy định, gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin [1]. Người bình thường có tổng số 4 gen α globin, nằm trên hai nhiễm sắc thể (NST) số 16 tương đồng, trong đó mỗi NST 16 có 2 gen α globin (αα/ αα). Trong bệnh HbH, một NST 16 mất hoàn toàn cả hai gen α globin, và ở NST 16 tương đồng còn lại mất hoặc đột biến 1 gen α globin. Hậu quả của sự thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin này dẫn đến sự tăng tổng hợp chuỗi β globin, tạo thành các chuỗi β4, là Hemoglobin H (HbH)[1,2]. Bệnh HbH có thể được chia thành hai thể, dựa vào hai loại đột biến có thể gặp trên gen α globin: đột biến mất đoạn và đột biến không mất đoạn. Thông thường, 90% bệnh này là do các đột biến mất đoạn gen gây nên do sự kết hợp giữa đột biến mất hai gen α globin trên cùng một NST 16 và đột biến mất 1 gen α globin trên NST 16 còn lại. Trong đó, các kiểu mất đoạn gen dạng SEA (--SEA), Thailand(--THAI), Philipin (--FIL), α 4.2 (-α4.2), α3.7(α3.7) là những kiểu mất đoạn thường gặp nhất trong quần thể người Trung Quốc và Đông Nam Á [ 7,8]. Bệnh HbH không do mất đoạn gen chiếm khoảng 10%. Thể bệnh này là do sự kết hợp giữa mất hai gen α globin trên cùng một NST 16 và một đột biến điểm trên một gen α globin của NST 16 còn lại, trong đó các đột biến điểm Hb Constant Spring (HbCs), Hb Qzuong Sze (HbQs) tại gen α2 là các đột biến điểm rất thường gặp ở quần thể người Trung Quốc và Đông Nam Á[4,5,8]. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Ngô Thị Tuyết Nhung*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Diễm Ngọc*, ,Nguyễn Thị Phương Mai*, Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Nguyễn Thị Mai Hương** * Khoa Di truyền và Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung ương ** Khoa Huyết học lâm sàng- Bệnh viện Nhi Trung ương TÓM TẮT Alpha thalassemia (α thal) là một trong những bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất trên thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có khu vực Đông Nam Á[1,2]. Bệnh huyết sắc tố H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh α thal với ba trên bốn gen α globin của cơ thể bị đột biến. Mục tiêu: Phát hiện các đột biến gen α globin gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhi được chẩn đoán mắc HbH dựa trên lâm sàng tại Bệnh viện Nhi TƯ. Các kỹ thuật phân tử bao gồm: Multiplex Gap PCR, CARMS PCR , giải trình tự gen, MLPA để phát hiện đột biến trên gen α globin. Kết quả: Tỷ lệ phát hiện đột biến là 40/40(100%). Kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đã phát hiện 33/40(82,5%) bệnh nhân có các kiểu gen như sau: (--SEA/-HbCs); (--SEA/-α3,7); (-- SEA/-α4.2); (-- SEA/-HbQs), với tỷ lệ lần lượt là: 17/40 (42,5%);10/40(25%); 4/40(10%); 2/40 (5%). Kỹ thuật MLPA phát hiện 1/40 (2,5%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-HbA1) và 4/40 (10%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-c.2delT), 1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/- c.92G>A),1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến(--SEA/- c.426A>T) được phát hiện bằng phương pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2. Kết luận: 100% bệnh nhân HbH được phát hiện đột biến trên gen α globin bằng bằng kỹ thuật phân tử, trong đó có ba đột biến hiếm gặp. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong điều trị, tiên lượng bệnh, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh HbH. Từ khóa: HbH, α Thalassemia, Multiplex Gap PCR, CARMS PCR, giải trình tự gen, MLPA. 81 phần nghiên cứu Bệnh HbH gây thiếu máu trên lâm sàng ở nhiều mức độ khác nhau, có thể có hoặc không phụ thuộc truyền máu, hoặc tử vong do biến chứng truyền máu. Do đó, việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trò rất quan trọng trong vấn đề tiên lượng mức độ của bệnh để đưa ra các quyết định điều trị phù hợp, đặc biệt trong việc tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu: Xác định các đột biến trên gen α globin gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng Nghiên cứu được thực hiện trên 40 bệnh nhi tại Bệnh viện Nhi Trung ương, từ tháng 1/2016 đến tháng 8/2016. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Kỹ thADN được tách trực tiếp từ mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA) bằng Kit QiaAmp DNA mini kit (Qiagen, Đức). 2.2.2. Kỹ thuật Multiplex Gap Polymerase Chain Reaction( Multiplex Gap PCR) Kỹ thuật Multiplex Gap PCR được thực hiện tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử Bệnh viện Nhi Trung ương để sàng lọc 7 loại đột biến mất đoạn 1 gen và 2 gen thường gặp của quân thể người châu Á: SEA (--SEA) (1349 bp), α 4.2 (-α4.2) (1628 bp), α 3.7(-α3.7) (1800 bp), Philipin (--FIL) (560 bp), Thailand(--THAI) (411 bp). 2.2.3. Kỹ thuật CAMRS PCR (Combine Amplification Refractory Mutation System-PCR) Kỹ thuật CARMS PCR sàng lọc hai đột biến điểm HbCs (Hb Constant Spring-283bp) và HbQs (Hb Quong Sze-238 bp). 2.2.4. Kỹ thuật giải trình tự gen Giải trình tự gen được thực hiện trên máy ABI 3130. Kết quả được phân tích bằng phần mềm Chromas và Chromas Pro, sau đó được đưa lên Ngân hàng gene (Gene Bank) để so sánh với trình tự chuẩn. Kỹ thuật này được sử dụng để sàng lọc các đột biến điểm khác trên gen HbA1, HbA2. 2.2.5. Kỹ thuật Multiplex Ligation-Dependent probe Amplification (MLPA) Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực hiện bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại P140-B4 để phát hiện các đột biến mất đoạn lớn. Kết quả được phân tích trên phần mềm COFALYSER. 3. KẾT QUẢ Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện 40/40 mẫu mang đồng thời hai đột biến gây bệnh HbH, trong đó: 33/40mẫu phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR, chiếm 82.5%, 07/40 mẫu phát hiện bằng phương pháp giải trình tự gen HbA, HbA2 và 01/40 mẫu được xác định bằng kỹ thuật MLPA, chiếm 2%. Có 17 mẫu mang kiểu gen (--SEA/-HbCs), chiếm 42,5%, 10 mẫu mang kiểu gen (--SEA/- α3,7), chiếm 25%, 04 mẫu (--SEA/-c.2delT), 01 mẫu mang kiểu gen (--SEA/-c.92G>A), chiếm 2.5%, 01 mẫu mang kiểu gen (--SEA/- c.426A>T) chiếm 2,5% và 01 mẫu mang đột biến (--SEA/HbA1) chiếm 2,5%. Bảng 1. Kiểu gen và tỷ lệ đột biến của bệnh nhân HbH Kiểu gen bệnh nhân HbH Số lượng bệnh nhân Tỷ lệ % (n=40) Đột biến mất đoạn 15 37,5 (--SEA/-α3.7) 10 25 (--SEA/-4.2) 4 10 (--SEA/-HbA1) 1 2,5 Đột biến không mất đoạn 25 62,5 (--SEA/-HbCs) 17 42,5 (--SEA/-c2delT) 4 10 (--SEA/-HbQs) 2 5 (--SEA/-c.92G>A) 1 2,5 (--SEA/- c.426A>T) 1 2,5 Tổng số 40 tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 82 Hình 1. Xác định đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex Gap PCR M: Maker 1kp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng dị hợp tử SEA; 3: Chứng dị hợp tử α3.7; 4: Chứng bệnh SEA/ α4.2; 5: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 6: ADN bệnh nhân SEA/ α4.2; 7: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 8: ADN bệnh nhân SEA/ α3.7; 9: Mẫu không chứa ADN. Hình 2. Phát hiện đột biến không mất đoạn bằng kỹ thuật CARMS PCR M: Maker 100bp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng bệnh SEA/HbCs; 3: Chứng bệnh SEA/HbQs; 4: ADN bệnh nhân SEA/HbCs; 5: ADN bệnh nhân SEA/HbQs; 6: ADN bệnh nhân không bị đột biến; 7: Mẫu không chứa AND. Hình 3. Đột biến c.2delT được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.2delT 83 phần nghiên cứu Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.92G>A Hình 4. Đột biến c.92G>A được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.426A>T Hình 5. Đột biến c.426A>T được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến mất đoạn HbA1 Hình 6. Đột biến mất đoạn HbA1 được phát hiện bằng phương pháp MLPA tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 84 4. BÀN LUẬN Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu, có 25/40 (62,5%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến không mất đoạn,15/40 (37,5%) thuộc nhóm đột biến mất đoạn. Người mang kiểu gen (- - SEA/- HbCs) chiếm tỷ l ệ cao nhất: 42,5%, người mang kiểu gen (- - SEA/- α 3.7): 25%; người mang kiểu gen (- - SEA/ HbQs): 5%, (--SEA/-α4.2): 10%. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu khác của tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc. Trong 435 bệnh nhân HbH được nghiên cứu tại tỉnh Quảng Đông, có 328/435 (75,6%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến không mất đoạn, 107/435 (25,4%) thuộc nhóm đột biến mất đoạn[ 4,6]. Một nghiên cứu khác tại Thái Lan, người mang kiểu gen (- - SEA/HbCs): 181/355 (51%), người mang kiểu gen (- - SEA/-α 3,7): 135/355 (38%), tỷ lệ người mang kiểu gen (--SEA/HbQs), (--SEA/-α4,2) lần lượt là: 5/355 (1,4%) và 2/355 (0,6%). Tuy nhiên, kết quả này có đặc điểm khác biệt so với nhiều nghiên cứu khác [1,4,8]. Do đó, để có thể kết luận về tỷ lệ phân bố kiểu gen của bệnh nhân HbH, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát trên một cỡ mẫu lớn hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đầu tiên để sàng lọc 7 đột biến có tần suất gặp cao nhất ở người Đông Nam Á: SEA, α 3.7, α4,2, Thailand, Philipin, HbCs, HbQs, phát hiện được 33/40(82,5%) mẫu đều mang 2 đột biến, 7 mẫu chỉ phát hiện được 1 đột biến mất đoạn 2 gen SEA. Trong trường hợp này chúng tôi tiến hành giải trình tự gen và MLPA để tìm đột biến còn lại. Đối với 7 mẫu mới phát hiện 1 đột biến (SEA), chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự gen phát hiện 4 đột biến điểm c.2delT(ATG>A-G), 1 đột biến điểm c.92G>A,1 đột biến điểm c.426A>T và sử dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mât đoạn 1 gen HbA1. Đặc biệt đột biến điểm c.426A>T (p.Term143Tyr) là đột biến điểm đầu tiên gây bệnh Hemoglobin Pakse được phát hiện ở mức độ phân tử tại Việt Nam. Phát hiện này bước đầu mang nhiều ý nghĩa, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các đột biến hiếm gặp và đột biến mới. Bệnh HbH là bệnh tan máu mạn tính ở nhiều mức độ khác nhau. Dựa vào hai loại đột biến có thể gặp trên gen α globin, bệnh HbH được chia thành hai thể: đột biến mất đoạn (deletional type) và đột biến không mất đoạn (non-deletional type). Bệnh không do mất đoạn gen thường có biểu hiện lâm sàng nặng hơn loại do mất đoạn gen [7]. Do đó,việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trò rất quan trọng trong vấn đề tiên lượng mức độ của bệnh để đưa ra các quyết định điều trị phù hợp, đặc biệt trong việc tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. 5. KẾT LUẬN Tỷ lệ phát hiện đột biến là 40/40 (100%). Kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đã phát hiện 33/40(82,5%) bệnh nhân, trong đó kiểu gen (--SEA/-HbCs) chiếm tỷ lệ cao nhất:17/40 (42,5%). Kỹ thuật MLPA phát hiện 1/40 (2,5%) bệnh nhân mang đột biến (-- SEA/- HbA1) và 4/40 (10%) bệnh nhân mang đột biến (-- SEA/- c.2delT), 1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-c.92G>A) và (--SEA/-c.426A>T) được phát hiện bằng phương pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2. Việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trò rất quan trọng trong vấn đề tiên lượng mức độ của bệnh để đưa ra các quyết định điều trị phù hợp, đặc biệt trong việc tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, giảm nguy cơ sinh con bị bệnh, làm tăng chất lượng cuộc sống. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amy Yuk-Yin Chan, Chi-Chiu So, Edmond Shiu-Kwan Ma et al. A laboratory strategy for genotyping haemoglobin H disease in the Chinese. J Clin Pathol 2007; 60: 931–934. 2. Higgs DR, Vickers AOM, Wilkie I-M, et al. A review of the molecular genetics of the human a-globin gene cluster. Blood1989;73:1081–104. 3. Liebhaber SA. A-Thalassemia. Hemoglobin 1989; 13: 685–731. 4. Guangxi province, Southern China: clinical review of 357 patients.Acta Haematol. 2010; 124(2): 86–91. 5. Chen FE, Ooi C, Ha SY, et al. Genetic and clinical features of hemoglobin H. 6. Yin XL, Zhang XH, Zhou TH, et al. Hemoglobin H disease in disease in Chinese patients.N Engl J Med2000;343:544–50. 7. Chan Pui Wah Vicky. (2003). “Molecular Genetics of HbH Disease in Hong Kong Chinese”. Thesis submitted for the Degree of Master Science, Dept of Pathology, Hong Kong University. 8. Fang J, Chen L, Zeng R, Tian Q,et al. The Hb H disease genotypes in Southern China. Hemoglobin. 2014; 38(1): 76-8.